miR-23c對滋養層細胞增殖、侵襲及遷移的影響及作用機制研究

夏愛華 徐平 高添藝 姜邦蓉 潘雪華 李劍蘭

子癇前期（preeclampsia，PE）是一種由母體、胎兒和環境因素引起的妊娠期特有的多因素疾病，其臨床特征表現為妊娠20周后新發異常的高血壓（≥140/90 mmHg）和蛋白尿（≥300 mg/24 h）。研究顯示，滋養層細胞浸潤不充分和螺旋動脈重塑失敗所致胎盤化不足是PE發病的關鍵因素[1]。磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K）/蛋白激酶 B（protein kinase B，Akt）通路與細胞增殖、遷移密切相關，抑制PI3K/Akt通路活性可導致胎盤絨毛細胞滋養層和合胞滋養層細胞遷移和浸潤能力受限而誘發PE[2]。第10號染色體缺失性磷酸酶和張力蛋白同源物（phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten，PTEN）基因是一個腫瘤抑制基因，可負調控PI3K/Akt通路抑制癌細胞增殖，同時，PTEN基因的轉錄后水平也受多種microRNA（miRNA）調控[3]。本課題組前期預實驗發現，miR-23c在PE患者和健康者之間存在差異表達，經TargetScan數據庫預測miR-23c可與PTEN 3'UTR結合，提示miR-23c可能通過調控PTEN/Akt通路參與PE進程。故本研究選取滋養層HTR8/SVneo細胞為研究對象，探討miR-23c對PTEN/Akt通路的調控機制以及對滋養層細胞增殖、侵襲和遷移的影響，以期進一步揭示PE發生的分子生物學機制，現報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2019年4月至2020年8月在北海市人民醫院行常規產前檢查的孕婦70例，納入標準：（1）孕婦臨床資料完整；（2）年齡 20～35 歲；（3）單胎妊娠的初產婦。排除標準：（1）多胎妊娠；（2）合并自身免疫性疾病、肝腎臟疾病、糖尿病、原發性高血壓及精神疾病者；（3）胎兒為試管嬰兒；（4）醫學或非醫學妊娠丟失；（5）中途退出研究。其中PE者35例（PE組），年齡（29.71±3.05）歲；正常者 35例（正常組），年齡（28.83±2.74）歲。兩組對象年齡比較差異無統計學意義（P＞0.05），均于分娩前抽取靜脈血3 ml，于分娩后留取胎盤組織進行研究。本研究經醫院醫學倫理委員會批準，兩組對象均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 主要材料和試劑 人絨毛膜滋養層細胞系HTR8/SVneo細胞購于美國ATCC細胞庫。RPMI 1640培養基、FBS購自美國 Gibco公司；TRIzol、逆轉錄試劑盒、Realtime PCR試劑盒購自日本Takara公司；Opti-MEM、Lipofectamine 3000購自美國Invitrogen公司；CCK-8試劑盒購自北京索萊寶公司；Transwell小室、Matrigel Matrix 基質膠購自美國 BD 公司；Akt、p-Akt、PTEN、βactin、羊抗兔二抗均購自英國Abcam公司；pmirGLO載體、PTEN 3'UTR-WT及 MUT、miR-23c模擬物（miR-23c mimic）及陰性對照（mimic-NC）、miR-23c抑制物（miR-23c inhibitor）及陰性對照（inhibitor-NC）購自上海生工生物公司。

1.2.2 實驗分組與細胞轉染 取對數生長期的HTR8/SVneo細胞接種于6孔板，1×105個/孔。次日待細胞融合度達60%～70%時，采用Lipofectamine 3000進行轉染，細胞分為Blank control組、mimic-NC組、miR-23c mimic組、inhibitor-NC組和miR-23c inhibitor組，共5組，Blank control組不做轉染處理，其余組分別轉染對應miR-23c模擬物或抑制物或其陰性對照。

1.2.3 miR-23c、PTEN mRNA、Akt mRNA 表達水平檢測 采用qRT-PCR法。參照TRIzol抽提試劑盒說明書，分別從血清、胎盤組織及處理的HTR8/SVneo細胞樣品中提取總RNA，依據相應的逆轉錄試劑盒說明書進行逆轉錄反應，獲得cDNA，并以此作為模板，進行實時熒光定量PCR，U6為miRNA內參，β-actin作為mRNA內參；PCR反應條件：95℃預變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火34 s，40個循環；結果按2-ΔΔCt計算各mRNA相對表達水平，實驗重復3次。引物由華大基因合成，引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.4 Akt、PTEN蛋白表達水平檢測 采用Western blot法。RIPA裂解經相應處理的HTR8/SVneo細胞提取總蛋白，BCA法進行蛋白定量，蛋白變性后取40 μg蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳，半干法轉移蛋白至PVDF膜，于微量震蕩儀上輕輕震蕩，以5%脫脂奶粉TBST室溫下封閉2 h。分別孵育相應Akt、p-Akt和PTEN蛋白及β-actin蛋白一抗，4℃孵育過夜，TBST振搖洗膜5 min×6次，孵育羊抗兔辣根過氧化物酶標記二抗，室溫1 h，TBST振搖洗膜5 min×6次。ECL底物化學發光顯色后機器掃描存盤，以Image軟件進行條帶分析，實驗重復3次。

1.2.5 細胞活性檢測 采用CCK-8法。按實驗分組分別轉染細胞培養24 h，胰酶消化各組細胞制備細胞懸液并計數，調整濃度為 4×104/ml，分別吸取 100 μl細胞懸液接種于96孔板，每組設置4個復孔，置于細胞培養箱中培養。于培養后48 h檢測細胞增殖情況。培養結束后，每孔添加10 μl CCK-8溶液，置于細胞培養箱孵育2h，用酶標儀于450nm波長處測定OD值。實驗重復3次，計算細胞活性。細胞活性=（OD實驗組-OD空白組）/（OD對照組-OD空白組）。

1.2.6 細胞遷移情況檢測 采用細胞劃痕實驗。取對數生長期的細胞接種于6孔板（4×105個/孔）正常培養，細胞融合約90%時，按實驗分組分別轉染miR-23c模擬物或抑制物及其陰性對照。用200 μl滅菌槍頭垂直于孔底劃痕，PBS漂洗至劃痕處無細胞殘留，于倒置顯微鏡下拍照，后將細胞置于細胞培養箱中正常培養，24 h后再次拍照，分析細胞遷移情況，細胞遷移率=（T0h面積-T24h面積）/T0h面積×100%，實驗重復3次。

1.2.7 細胞侵襲情況檢測 采用Transwell實驗。取100 μl稀釋好的基質膠鋪于Transwell小室上表面，于37℃、5% CO2培養箱中放置6 h。轉染24 h后的各組細胞用無血清培養基重懸計數，調整濃度為1×105/ml，分別取200 μl細胞懸液于上室，下室加600 μl完全培養基。培養24 h后，用棉簽輕輕拭去小室上層未浸潤過底膜的細胞和基質膠。4%多聚甲醛固定和結晶紫染色，至于倒置顯微鏡下，隨機選取5個視野拍照并計數侵襲細胞。

1.2.8 miR-23c對PTEN靶向作用驗證 采用雙熒光素酶報告實驗。將HTR8/SVneo細胞用含10% FBS的RPMI1640培養基置于37℃、5% CO2培養箱中培養。將野生型的PTEN基因3'UTR（PTEN 3'-UTR WT）及其突變體（PTEN 3'-UTR MUT）構建到pmirGLO載體中，獲得pmirGLO-WT和pmirGLO-MUT，不含任何外源片段的空載體作為陰性對照。pmirGLO載體的螢火蟲熒光素酶luc2作為主要報告基因，海參熒光素酶hRluc-neo為對照報告基因，按照Lipofectamine 3000脂質體說明書進行轉染，將miR-23c mimic分別與pmirGLO-WT和pmirGLO-MUT轉染到細胞中，同時以mimic-NC作為對照。設置3個復孔，轉染后培養12 h，用雙熒光素酶報告基因檢測系統檢測熒光素酶活性，以海參熒光素酶hRluc-neo的活性作為校正報告基因。

2 結果

2.1 PE組與正常組血清、胎盤組織中miR-23c表達水平比較 與正常組相比，PE組血清及胎盤組織中miR-23c表達水平均顯著降低（均P＜0.05），見表2。

表2 PE組與正常組血清、胎盤組織中miR-23c表達水平比較

2.2 各組細胞miR-23c表達水平比較 與Blank control組相比，miR-23c mimic組miR-23c表達水平顯著升高（P＜0.05），miR-23c inhibitor組 miR-23c表達水平顯著降低（P＜0.05），Blank control組與 mimic-NC組、inhibitor-NC組比較差異均無統計學意義（均P＞0.05），見表 3。

2.3 各組細胞活性、侵襲數及遷移率比較 與Blank control組相比，miR-23c mimic組細胞活性顯著增強（P＜0.05），侵襲數顯著增加（P＜0.05），遷移率顯著升高（P＜0.05）；而 miR-23c inhibitor組細胞活性顯著減弱（P＜0.05），侵襲數顯著減少（P＜0.05），遷移率顯著降低（P＜0.05）。Blank control組與mimic-NC組、inhibitor-NC組細胞活性、侵襲數及遷移率比較差異均無統計學意義（均 P ＞0.05），見表 4、圖 1-2。

表4 各組細胞活性、侵襲數及遷移率比較

圖1 各組細胞Transwell實驗所見（×100）

圖2 各組細胞劃痕實驗所見（×40）

2.4 各組細胞PTEN、Akt mRNA和蛋白表達水平比較與Blank control組相比，miR-23c mimic組p-Akt/Akt水平顯著升高（P＜0.05），PTEN mRNA和蛋白表達均顯著降低（均 P＜0.05）；miR-23c inhibitor組 p-Akt/Akt水平顯著降低（P＜0.05），PTEN mRNA和蛋白表達均顯著升高（均P＜0.05）。Blank control組與mimic-NC組、inhibitor-NC組p-Akt/Akt水平及PTEN mRNA和蛋白表達水平比較差異均無統計學意義（均P＞0.05），各組Akt mRNA和蛋白表達水平比較差異均無統計學意義（均P＞0.05）。見表5、圖3。

圖3 各組細胞磷酸酶與張力蛋白同源物（PTEN）、蛋白激酶B（Akt）蛋白表達電泳圖

表5 各組細胞PTEN、Akt mRNA和蛋白表達水平比較

2.5 miR-23c對PTEN的靶向作用 在轉染pmirGLOWT質粒的細胞中，與mimic-NC相比，miR-23c mimic顯著降低了熒光素酶活性（P＜0.05）；在轉染pmirGLOMUT質粒及空載質粒的細胞中，miR-23c mimic與mimic-NC均未明顯降低熒光素酶活性（均P＞0.05），表明miR-23c可以靶向PTEN 3'-UTR并降低PTEN基因的表達，見圖4。

圖4 雙熒光素酶報告實驗檢測結果（PTEN為磷酸酶和張力蛋白同源物；*P＜0.05）

3 討論

PE是一種妊娠期特有的疾病，其發病機制復雜，目前研究表明妊娠時滋養層細胞遷移和浸潤不足是誘導PE的關鍵因素。滋養層細胞侵入動脈壁異常，導致子宮螺旋動脈由小直徑向大直徑血管轉換受阻，進而導致胎盤血流灌注不足誘發PE；正常妊娠時，滋養層細胞不僅侵襲蛻膜，還侵襲肌肉層參與胎盤形成，滋養層細胞缺失和浸潤不足導致胎盤淺埋也是PE發病的關鍵，表明滋養層細胞增殖侵襲和遷移在PE的發病過程中至關重要[1]。滋養層細胞的遷移和侵襲受到多種因素影響，目前尚未清楚確切分子機制。研究表明，miRNA通過影響滋養層細胞增殖、侵襲參與PE的發病過程[4]。本研究檢測發現PE患者血清和胎盤組織中miR-23c異常低表達，推測其可能在PE發病機制中起重要作用。故本研究在人絨毛膜滋養層細胞系HTR8/SVneo細胞中轉染miR-23c模擬物和抑制物，探討miR-23c對滋養層細胞增殖、侵襲及遷移的影響及調控機制。

miRNA是一種豐富的內源性非編碼類RNA小分子，含18～25個核苷酸，它們通過靶向mRNA發揮降解和翻譯抑制作用。越來越多的證據表明miRNA在不同的生物學過程中發揮關鍵作用，包括細胞增殖、分化、凋亡、細胞周期進展和干細胞分裂等，研究表明miRNA在許多人類疾病中異常表達，與疾病發生、發展密切相關[5]。miR-23c最早發現于結直腸癌組織且呈高表達狀態[6]，可抑制肝細胞癌的增殖并誘導細胞凋亡[5]，過表達miR-23c抑制膠質瘤細胞的增殖、遷移和侵襲能力，其機制可能與其下調異粘蛋白（metadherin，MTDH）表達有關[7]。miR-23c還可能通過靶向基質細胞衍生因子-1α（stromal cell-derived factor-1α,SDF-1α） 抑制血管生成，調節傷口愈合[8]。上述研究表明miR-23c在細胞增殖、侵襲等過程中具有重要的調節作用。本研究將miR-23c mimic和miR-23c inhibitor分別轉染HTR8/SVneo細胞，檢測miR-23c對細胞的增殖、侵襲及遷移的影響，發現過表達miR-23c能增強細胞活性，促進細胞侵襲和遷移，而抑制miR-23c表達后，細胞活性、侵襲及遷移能力均顯著下降，表明miR-23c具有促進滋養層細胞侵襲和遷移的作用。

PTEN作為一個重要的腫瘤抑制因子，參與調節細胞增殖、分化、代謝、凋亡和侵襲等過程。PTEN通過其磷酸肌醇磷酸酶活性將磷脂酰肌醇三磷酸（phosphatidylinositol-3,4,5-triphosphate,PIP3）去磷酸化為磷脂酰肌醇二磷酸（phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate,PIP2）來拮抗PI3K活性，進而阻礙下游的Akt磷酸化，發揮拮抗PI3K/Akt信號通路的作用[3]。PI3K/Akt信號通路對維持細胞基本過程、細胞生長、存活、死亡和代謝的完整性至關重要[9]。研究發現，激活滋養層細胞中PI3K/Akt/mTOR通路后，細胞侵襲和轉移能力顯著增強，抑制劑LY294002抑制PI3K活性，可導致HTR8/SVneo細胞增殖、侵襲和遷移能力減弱[2，10]。這表明PI3K/Akt通路參與滋養細胞侵襲，在PE中發揮重要作用。研究發現，miR-21 inhibitor通過增加PTEN的表達，進而降低p-Akt的水平，抑制成纖維細胞的增殖并誘導凋亡[11]。薛平平等[12]研究發現，重度PE患者胎盤組織中PTEN表達顯著升高，且PTEN通過下調Akt活性降低基質金屬蛋白酶-2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）和 MMP-9表達而抑制滋養層細胞的遷移。上述研究表明PTEN蛋白調節的Akt磷酸化水平在滋養層細胞增殖、侵襲和遷移的過程中具有重要的調節作用。本研究中，HTR8/SVneo細胞過表達miR-23c時，細胞內PTEN表達下調，p-Akt/Akt水平顯著上調，細胞增殖、遷移能力顯著增強；相反，抑制miR-23c表達時，細胞內PTEN表達上調，p-Akt/Akt水平下調，細胞增殖、遷移能力顯著降低，表明miR-23c通過抑制PTEN表達促進Akt發生磷酸化，進而激活PI3K/Akt通路增強HTR8/SVneo細胞的增殖、遷移能力。

既往研究發現miR-221和miR-26a均可靶向PTEN基因，抑制其表達，增強PI3K/Akt信號通路促進細胞增殖[13-14]。Li等[15]進行微陣列分析發現PTEN基因是miR-23c潛在的靶點。為進一步確認HTR8/SVneo細胞中miR-23c與PTEN基因是否存在確切的結合活性，本研究預測并設計PTEN基因3'-UTR的野生型序列及其突變體，分別與miR-23c mimc共轉染到HTR8/SVneo細胞中，運用雙熒光素酶報告實驗檢測miR-23c對PTEN基因的靶向作用。結果顯示，轉染pmirGLO-WT質粒的細胞的熒光素酶活性顯著降低，而轉染pmirGLOMUT質粒與空載質粒的細胞熒光素酶活性無顯著差異，均不能明顯降低熒光素酶活性，證實miR-23c可以靶向PTEN 3'-UTR并降低其表達。

綜上所述，本研究發現miR-23c通過抑制PTEN的表達，激活PI3K/Akt信號通路活性，進而促進滋養層細胞的增殖、侵襲及遷移，表明miR-23c參與調控PE的發病機制，并在滋養層細胞浸潤異常而導致的胎盤化不足機制中發揮有益作用。這進一步揭示了PE的發病機制，提示miR-23c有望成為PE診斷或治療的靶標，值得進一步研究。