HPLC 法測定依帕司他片清潔驗證中殘留物

尤銳，薛雯蔚，馮小雪(揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)南京海陵藥業(yè)有限公司，江蘇 南京 210049)

0 引言

糖尿病是一種常見的慢性非傳染性疾病，已成為嚴(yán)重的世界性公共衛(wèi)生問題?！秶鴦?wù)院關(guān)于實施健康中國行動的意見》[1]指出，我國是糖尿病患病率增長最快的國家之一。據(jù)國際糖尿病聯(lián)盟(IDF) 數(shù)據(jù)顯示，截至2019 年，在20 歲到79 歲的人群中，中國糖尿病患者數(shù)總?cè)藬?shù)約為1.164億[2]。然而，糖尿病致死原因主要?dú)w于其并發(fā)癥。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，糖尿病并發(fā)癥高達(dá)100 多種，是目前已知并發(fā)癥最多的一種疾病。糖尿病死亡者有一半以上是心腦血管所致，10% 是腎病變所致。因糖尿病截肢的患者是非糖尿病的10～20 倍。臨床數(shù)據(jù)顯示，糖尿病發(fā)病后10 年左右，將有30%～40% 的患者至少會發(fā)生一種并發(fā)癥，且并發(fā)癥一旦產(chǎn)生，藥物治療很難逆轉(zhuǎn)，因此強(qiáng)調(diào)盡早預(yù)防糖尿病并發(fā)癥。糖尿病周圍神經(jīng)病變(diabetic peripheral neuropathy, DPN) 屬于糖尿病微血管并發(fā)癥，發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，是老年2 型糖尿病患者反復(fù)住院的重要危險因素[3]。依帕司他片主要用于治療糖尿病周圍神經(jīng)病變，是預(yù)防糖尿病并發(fā)癥的常用藥物。臨床研究證明[4]，依帕司他聯(lián)合甲鈷胺治療糖尿病周圍神經(jīng)病變效果顯著，可改善神經(jīng)傳導(dǎo)速度與臨床表現(xiàn)，且患者無明顯不良反應(yīng)，用藥安全性較高。

最大限度地降低藥品生產(chǎn)過程中污染、交叉污染是藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理的核心內(nèi)容之一[5]。出于生產(chǎn)成本、生產(chǎn)空間的局限性，做到降本增效，在藥品生產(chǎn)過程中，不同藥品共用生產(chǎn)線和生產(chǎn)設(shè)備的情況不可避免。制定有效、便捷的清潔程序是防止污染、交叉污染的重要舉措之一。清潔驗證[6]是證明清潔程序能有效清潔設(shè)備并滿足其預(yù)定用途的直接證據(jù)?；诖?，本文參照《日本藥典》中依帕司他含量測定的檢測方法，優(yōu)化實驗條件，建立高效液相色譜法測定依帕司他片清潔驗證中的化學(xué)殘留。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

Agilent 1260 高效液相色譜儀(安捷倫科技有限公司)；XPE205DR 分析天平(梅特勒-托利多)。

磷酸二氫鉀(分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；磷酸氫二鈉(分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；乙腈(色譜純，TEDIA)；乙醇(色譜純，TEDIA)；N, N-二甲基甲酰胺(色譜純，TEDIA)；布簽(TEXWIPE)。

1.2 實驗方法

1.2.1 色譜條件色譜柱：十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(Waters Xbrige C18 150mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：磷酸鹽緩沖液[0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液，用0.05 mol/L 磷酸氫二鈉溶液調(diào)節(jié)pH 值至6.5(0.05 mol/L 磷酸二氫鉀溶液與0.05 mol/L 磷酸氫二鈉溶液的體積比約為200∶85)]-乙腈(65∶35)；檢測波長：294 nm；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣盤溫度：4 ℃；進(jìn)樣量：50 μL；流速：1.0 mL/min；運(yùn)行時間：10 min；洗針方式：沖洗端口，15 s；洗針溶液：乙腈。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制和標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取依帕司他對照品約30.5 mg，置50 mL 容量瓶中，加N, N-二甲基甲酰胺適量，充分振搖使溶解，并稀釋至刻度，搖勻；精密量取上述溶液2 mL，置100 mL 容量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，即得對照品貯備液。精密量取對照品貯備液5 mL 置50 mL 容量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，即得對照品溶液。

精密量取依帕司他對照品貯備液適量，使制成濃度范圍在定量限至300% 濃度水平(約為3.66 μg/mL) 之間的6 個濃度水平的溶液。按1.2.1 項下色譜條件記錄色譜圖，以濃度(c) 為橫坐標(biāo)，峰面積(A) 為縱坐標(biāo)，計算回歸方程及相關(guān)系數(shù)。濃度級別及試驗結(jié)果如表1 所示。

表1 不同濃度級別下依帕司他對照品溶液的線性關(guān)系

1.2.3 取樣回收率供試品溶液的制備

根據(jù)與產(chǎn)品直接接觸的設(shè)備、容器、工器具的材質(zhì)，選擇316L 不銹鋼、聚四氟乙烯、有機(jī)玻璃和硅膠四種材質(zhì)進(jìn)行取樣回收率測試。

316L 不銹鋼板：精密量取對照品貯備液1 mL 均勻地滴加在316L 不銹鋼板的方塊區(qū)域上，方塊為10 cm×10 cm，常溫晾置約20 min，取布簽，用乙醇約0.2 mL 潤濕，將其按在涂好并晾置后的不銹鋼板上，盡量使布簽與取樣點(diǎn)表面完全接觸，平穩(wěn)而緩慢地按圖1(a) 所示方向均勻擦拭一遍，然后翻轉(zhuǎn)布簽，用另一面按圖1(b) 所示方向進(jìn)行第二次擦拭。同法重復(fù)3 次。取樣必須盡快完成以免溶劑揮發(fā)和污染物沉積到樣品表面。將在同一塊平板上取樣的布簽置于同一頂空瓶中，加入10 mL 流動相，超聲5 min，搖勻，過濾，作為取樣回收率供試品溶液。

圖1 布簽擦拭示意圖

聚四氟乙烯板、有機(jī)玻璃板、硅膠板的相關(guān)供試品溶液制備過程同316L 不銹鋼板。

2 方法和結(jié)果

2.1 色譜條件的選擇和優(yōu)化

以《日本藥典》[7]中依帕司他含量測定的檢測方法為參考，根據(jù)紫外分光光度計檢測結(jié)果，對檢測波長進(jìn)行調(diào)整，確定以294 nm 作為檢測波長。在波長294 nm 下，考察了不同流動相比例對出峰時間和峰型的影響，發(fā)現(xiàn)原定流動相比例條件下布簽空白溶液在依帕司他主成分峰位置出現(xiàn)干擾峰。后調(diào)整流動相為磷酸鹽緩沖液-乙腈(65∶35)，此時無明顯雜峰干擾，且出峰時間有所提高。在檢測波長和流動相比例同時優(yōu)化的條件下，將主成分峰出峰時間提高近一倍，大大縮短了檢驗周期。

2.2 專屬性

取適量乙醇作為空白溶劑溶液。取布簽，用乙醇約0.2 mL 潤濕，將其分別按在試驗用的空白316L 不銹鋼板(10 cm×10 cm)、聚四氟乙烯板(10 cm×10 cm)、有機(jī)玻璃板(10 cm×10 cm)、硅膠板(10 cm×10 cm) 上，按1.2.3 所述方法制備，即為布簽空白溶液。

取空白溶劑溶液、布簽空白溶液、對照品溶液適量，用1.2.1項下色譜條件進(jìn)行色譜分析，記錄各色譜圖。結(jié)果表明，空白溶劑、空白布簽及空白材質(zhì)對依帕司他殘留物含量的測定均不產(chǎn)生干擾，供試品溶液中主峰與相鄰峰的分離度為2.45，分離情況良好。

2.3 溶液穩(wěn)定性

取4℃下放置的對照品溶液和供試品溶液，分別于0、6、12、18、24、30、36、42、48 h分別進(jìn)樣采集，記錄色譜圖，結(jié)果顯示，4 ℃下放置的對照品溶液及供試品溶液在48 h 內(nèi)穩(wěn)定，其各時間點(diǎn)的保留時間與初始測得值的比值在0.98～1.02 之間，各個時間點(diǎn)測得的主成分峰面積與初始峰面積的相對平均偏差均小于1.0%。

2.4 檢測限與定量限

以信噪比約為3∶1 時的濃度作為該方法的檢測限，以信噪比不小于10 時的濃度作為該方法的定量限。結(jié)果顯示，該方法的檢測限濃度為0.000 766 2 μg/mL，限度為0.000 076 62 μg/cm2；定量限濃度為0.003 065 μg/mL，限度為0.000 306 5 μg/cm2。

2.5 重復(fù)性

取依帕司他對照品溶液適量，按1.2.1 項下色譜條件進(jìn)行色譜分析，平行進(jìn)樣6 次，記錄其色譜圖中主成分的峰面積，計算出其RSD。結(jié)果表明，6 次測得主成分峰面積RSD 為0.1%，精密度較好，符合測定的要求。

2.6 取樣回收率

按1.2.3 項下配制取樣回收率供試品溶液，各材質(zhì)分別由兩名人員各擦拭3 次，得到每種材質(zhì)6 份供試品溶液。以外標(biāo)法進(jìn)行定量分析，結(jié)果如表2 所示。結(jié)果表明，取樣回收率均大于70%，RSD 值小于20%，符合制劑生產(chǎn)中清潔到位的要求。

表2 各材質(zhì)取樣回收率結(jié)果

3 結(jié)語

建立了高效液相色譜法測定制劑生產(chǎn)清潔過程中依帕司他片的主成分殘留量，通過優(yōu)化色譜條件，大大縮短了檢測周期和時間成本。對該方法專屬性、線性、穩(wěn)定性、檢測限與定量限、精密度和回收率進(jìn)行驗證，結(jié)果表明該方法滿足《藥品生產(chǎn)驗證指南》[8]相關(guān)要求，適用于依帕司他片清潔驗證的殘留物檢測，為大生產(chǎn)過程中依帕司他片清潔驗證提供了一種準(zhǔn)確、快速且可靠的殘留物檢測方法。