子宮內膜癌組織中miR-96、FOXO1表達變化及意義

田秀芳，陳紅曉，欒雅靜，郭景霞

1 天津市第五中心醫院婦產科，天津300451；2 天津醫科大學基礎醫學院教學中心

子宮內膜癌（EC）是婦科常見惡性腫瘤，全世界范圍內每年新發病例約50 萬例，死亡病例達26 萬例［1］。近年來，EC的臨床治療取得了較大發展，如新輔助化療、免疫治療等，改善了患者的預后，但中晚期EC 患者預后仍然較差，5 年總體生存率小于40%［2］。微小 RNA-96（miR-96）是一種小的非編碼RNA調控分子，轉錄后調控下游基因表達，如miR-96能與PTEN、CDK1 mRNA 的3'非編碼區（UTR）結合，調控基因表達，影響細胞增殖及分化等過程［3-4］。研究發現，miR-96能夠促進黏附斑激酶的表達及激活，進而促進腫瘤細胞的遷移、侵襲，且與腫瘤患者的不良預后有關［5］。叉頭框基因O1屬于叉頭盒轉錄因子家族成員，可以促進下游多種趨化因子的產生，調節免疫微環境中免疫細胞的構成，影響疾病的發生發展［6-7］。研究發現，在乳腺癌［8］、膀胱癌［9］等腫瘤中均發現FOXO1表達下調，從而抑制AKT信號通路的激活及腫瘤細胞增殖、惡性進展，增強腫瘤細胞對化療藥物如順鉑的敏感性。目前有關EC組織中miR-96、FOXO1 表達的報道較少。本研究探討EC 組織中miR-96、FOXO1的表達變化及臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集 2015 年 1 月—2018 年 4 月天津市第五中心醫院收治行手術治療的120 例EC 患者的臨床資料，患者年齡32～74（44.3 ± 6.1）歲；腫瘤直徑≤5 cm 75 例，＞5 cm 45 例；高中分化 67 例，低分化53 例；伴肌層浸潤42 例，無肌層浸潤78 例；伴淋巴結轉移29 例，無淋巴結轉移91 例；國際婦產科聯盟（FIGO）分期：Ⅰ、Ⅱ期80 例，Ⅲ、Ⅳ期40 例。納入標準：經病理檢查確診；無放化療藥物、免疫藥物等治療史；臨床資料完整，均簽署知情同意書，能夠配合相應檢查、治療及隨訪。排除標準：伴其他器官惡性腫瘤；伴子宮肌瘤等子宮良性疾病；合并嚴重心肺功能障礙。本研究獲得醫院醫學倫理委員會批準（2016-10-013）。

1.2 EC 組織及癌旁組織中miR-96、FOXO1 mRNA表達檢測 采用熒光定量PCR。取術中新鮮獲得的（離體30 min以內）EC 組織及癌旁組織（距癌組織邊緣＞5 cm），置于液氮中保存待測。檢測時將組織置于液氮中研磨，離心后去除底層組織碎塊，TRIzol法提取組織中RNA，并溶于DEPC 水中，微量分光光度計檢測RNA 的濃度。以5 μg RNA 為模板，逆轉錄成cDNA。然后進行熒光定量PCR。miR-96 正向引物 序 列 5'-GCCCGCTTTGGCACTAGCACATT-3'，反向引物序列 5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'；U6 正向引物序列5'-TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAGC-3'，反向引物序列5'-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3'；FOXO1 正向引物序列 5'-TCGTCATAATCTGTCCCTACACA-3'，反向引物序列5'-CGGCTTCGGCTCTTAGCAAA-3'；GAPDH 正 向 引 物 序 列 5'-TGATAACTGGAGTACATTTCGCC-3'，反向引物序列5'-CGGTCATAATGGGTGAGAGTCT-3'。 PCR 引 物和探針均購自ABI生物公司。反應體系20 μL：模板2 μL，正反向引物各1 μL，SYBR premix 10 μL，去離子 水 6 μL。 miR-96 及 內 參 U6 反 應 條 件 ：95 ℃5 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 45 s，40 個循環。FOXO1 及內參 GAPDH 反應條件：95 ℃ 4 min，95 ℃ 30 s，62 ℃1 min，72 ℃ 30 s，35 個循環。用 2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。

1.3 隨訪 病例確診之日為隨訪開始時間，出院后以電話方式隨訪，內容包括患者生存狀況及腫瘤控制情況等。隨訪至2021年4月。

1.4 統計學方法 采用SPSS20.0 統計軟件。計量資料以表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；miR-96與FOXO1 mRNA表達的相關性分析采用Pearson 相關法；用在線軟件 TargetScan 對 miR-96 與FOXO1相互作用的位點進行預測；Kaplan-Meier生物曲線法進行生存分析；多因素Cox回歸分析影響EC患者預后的危險因素。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 EC 組織及癌旁組織中miR-96、FOXO1 mRNA表達比較 EC 組織及癌旁組織中miR-96 相對表達量 分 別 為 4.118 ± 1.121、1.115 ± 0.383，FOXO 1 mRNA 相對表達量分別為0.918± 0.140、4.682±0.841。與癌旁組織比較，EC 組織中miR-96 相對表達量高、FOXO1 mRNA相對表達量低（P均＜0.05）。

2.2 EC 組織中 miR-96 與 FOXO1 mRNA 表達的關系 癌組織中miR-96 與FOXO1 mRNA 的表達呈負相關（r=-0.611，P＜0.05）。應用 TargetScan 軟件對miR-96 與FOXO1 mRNA 相互作用位點進行預測，結果發現，FOXO1 mRNA 的 3'UTR 區第 232～266堿基位置處存在與miR-96相互結合的潛在位點。

2.3 miR-96、FOXO1 mRNA 表達與 EC 患者臨床病理特征的關系 miR-96、FOXO1 mRNA 表達與EC的 FIGO 分期、伴淋巴結轉移有關（P均＜0.05），與EC患者年齡、腫瘤直徑、浸潤深度、分化程度無關（P均＞0.05）。見表1。

表1 miR-96、FOXO1表達與EC患者臨床病理特征的關系

2.4 miR-96、FOXO1 mRNA 表達與 EC 患者預后的關系 隨訪5～36（27.7 ± 6.3）個月，隨訪期間死亡26 例，無失訪病例。以miR-96 相對表達量的均數4.118 為臨界值，分為miR-96 高表達組65例，miR-96 低表達組 55 例。miR-96 高、低表達組 3年總體生存率分別為64.6%（42/65）、94.5%（52/55），比較差異有統計學意義（P＜0.05）。

以FOXO1 mRNA 相對表達量的均數0.918 為臨界值，分為 FOXO1 高表達組 62 例，FOXO1 低表達組58 例。FOXO1 高、低表達組3 年總體生存率分別為93.5%（58/62）、62.0%（36/58），比較差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.5 影響EC 患者預后的因素 以EC 患者隨訪過程中的生存情況為因變量（1 為死亡，0 為存活，t 為生存時間），納入年齡（賦值：1 為≥60 歲，0 為＜60歲）、腫瘤大小（賦值：1 為≥5 cm，0 為＜5 cm）、肌層浸潤（賦值：1 為有，0 為無）、分化程度（賦值：0 為高分化，1 為中低分化）、腫瘤分期（賦值：1 為Ⅲ、Ⅳ期，0為Ⅰ、Ⅱ期）、淋巴結轉移（賦值：1 為伴淋巴結轉移，0為無淋巴結轉移）、miR-96（賦值1為高表達，0為低表達）、FOXO1（賦值1為低表達，0為高表達）為自變量。經多因素Cox 回歸分析結果顯示，miR-96 高表達、FOXO1 低表達、高FIGO 分期及淋巴結轉移是EC 患者預后不良的危險因素。見表2。

表2 影響EC患者預后的多因素Cox比例風險回歸模型

3 討論

研究發現，miR-96 在乳腺癌、宮頸癌中表達升高，并通過抑制抑癌基因促進腫瘤的發生發展［10］。本研究發現，EC 中miR-96 的表達顯著升高，FIGOⅢ、Ⅳ期及伴淋巴結轉移癌組織中miR-96 表達升高，表明miR-96 促進EC 的發生發展。研究發現，腫瘤中缺氧微環境誘導，轉化生長因子β 等因子的表達水平升高，能夠增加miR-96 的穩定性，因此EC 組織中miR-96 表達上調［11］。天冬氨酸蛋白水解酶9（Caspase-9）是細胞凋亡的執行者，促進細胞凋亡；miR-96能夠轉錄后抑制半胱氨酸的Caspase-9的表達。腫瘤發生后miR-96表達上調，Caspase-9的促凋亡能力降低，導致腫瘤細胞無限增殖［12］。FEI等［13］報道，腫瘤中miR-96 的表達升高能夠抑制酰肌醇蛋白聚糖-3 的表達，進而促進腫瘤細胞的遷移。本研究還發現，miR-96高表達的EC 患者3年總生存率低，并且miR-96 高表達是患者預后不良的危險因素。表明miR-96 是提示EC 患者預后的重要指標，值得臨床深入研究。

FOXO 家族的代表性成員，廣泛存在于無脊椎動物和哺乳動物中，發揮抑制細胞增殖、調節能量代謝和誘導細胞反應等功能［14］。近年來研究發現，FOXO1 在結直腸癌、肺癌等腫瘤中異常低表達，并作為抑癌基因，抑制腫瘤的發生發展［15］。本研究中，EC 中FOXO1 表達明顯降低，且其表達與FIGO 分期、淋巴結轉移有關，表明FOXO1 的低表達促進EC的發生發展。分析其機制，可能與FOXO1的抑癌作用有關。FOXO1過表達能夠誘導腫瘤細胞G2/M 期的周期停滯，進而抑制腫瘤細胞增殖［16］。此外，FOXO1 表達降低后，SGK1 轉錄因子活性受到顯著抑制，腫瘤細胞與細胞外基質無法解離，腫瘤細胞的浸潤轉移能力下降［17］。因此，FOXO1 可能是通過誘導細胞周期停滯和細胞外基質重塑，抑制EC腫瘤細胞的增殖、遷移。進一步研究表明，FOXO1低表達患者預后差，且FOXO1 低表達是EC 患者預后不良的獨立危險因素。因此，檢測EC 組織中FOXO1 的表達變化有利于預測患者的預后。本研究中miR-96 與FOXO1 表達呈明顯負相關，生物信息學預測結果亦提示miR-96 與FOXO1 之間存在潛在的結合位點。表明miR-96 可能是通過調控FOXO1的表達，促進EC的發生發展。

綜上所述，EC 組織中miR-96 表達上調，而FOXO1 表達下調，兩者表達呈負相關，并且與腫瘤FIGO 分期、淋巴結轉移有關，miR-96 可能通過調控FOXO1 的表達，參與EC 的疾病進展過程。EC中miR-96 高表達、FOXO1 低表達、腫瘤Ⅲ～Ⅳ期及淋巴結轉移是患者不良預后的危險因素。檢測EC組織中miR-96、FOXO1 的表達對評估EC 發生發展及預后有重要意義。