移植低氧預(yù)處理MSC對(duì)CKD大鼠腎功能的影響及機(jī)制

邵麗詩(shī)，邢藝苑，2，羅成誠(chéng)，楊力 ，馬逸群，萬(wàn)珊杉 ，王家平

1 昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院影像科，昆明650500；2 鄭州市疾病預(yù)防控制中心內(nèi)科；3 云縣人民醫(yī)院泌尿外科；4 昆明醫(yī)科大學(xué)解剖學(xué)與組織胚胎學(xué)系；5 云南昆鋼醫(yī)院 大理大學(xué)第七附屬醫(yī)院影像科

慢性腎臟病（CKD）是一種進(jìn)行性腎功能惡化疾病，目前，尚無(wú)有效治療方法。間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）具有自我更新、多分化潛能性和分泌細(xì)胞因子的特性，可通過(guò)細(xì)胞融合、分化和旁分泌信號(hào)傳導(dǎo)等多種機(jī)制修復(fù)受損腎臟［1］。由于MSC能歸巢到受損部位的數(shù)量較少，且受損組織局部缺血、炎癥、缺氧和氧化應(yīng)激等導(dǎo)致MSC 存活率低，限制了其應(yīng)用［2］。低氧預(yù)處理MSC（HP-MSC）能有效提高細(xì)胞存活率和分泌能力［3］。低氧還可通過(guò)調(diào)節(jié)低氧誘導(dǎo)因子提高M(jìn)SC 活性和促血管生成潛能［4］。基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1（SDF-1）是一種干細(xì)胞趨化因子，能通過(guò)與其特異性受體4（CXCR）結(jié)合促使MSC 遷移至損傷部位，因而SDF-1-CXCR4 信號(hào)軸對(duì)MSC 歸巢至受損組織至關(guān)重要［5］。研究發(fā)現(xiàn)，短期低氧預(yù)處理可增加MSC表面CXCR4 的表達(dá)，而且HP-MSC 能更有效減輕腎缺血/再灌注損傷［6］。然而，HP-MSC 對(duì) CKD 的影響以及SDF-1-CXCR4 通路在該過(guò)程中發(fā)揮的作用仍不明確。2016 年 1 月—2017 年 3 月，本研究觀察HP-MSC 對(duì)CKD 大鼠腎功能的影響，并探討其可能的作用機(jī)制。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、試劑及儀器 58 只雄性SD 大鼠，100～120 g，5～6 周，購(gòu)自四川大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，SCXK（川）2018-026，于動(dòng)物安置標(biāo)準(zhǔn)設(shè)施中飼養(yǎng)，溫度24 ℃，光/暗循環(huán)時(shí)間12 h，每日更換墊料、飼料和水。所有實(shí)驗(yàn)操作均符合昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)要求。胎牛血清FBS（美國(guó)Sigma 公司）；EDTA（美國(guó)Amresco Hualcyuan biotechnology 公司）；阿霉素（ADR，美國(guó)Sigma 公司）；PT-PCR 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（中國(guó)Invitrogen 公司）；熒光定量PCR 試劑盒（日本Takara 公司）；TRIzol Reagent（中國(guó)Invitrogen 公司）；兔抗大鼠SDF-1（美國(guó)Santa Cruz 公司）；山羊抗兔IgG（美國(guó)Santa Cruz 公司）；兔抗大鼠CXCR4（中國(guó)博士德公司）；5%CO2培養(yǎng)箱（中國(guó)HERACELL 公司）；冰凍切片機(jī)（德國(guó)Leica公司）；GDST600凝膠掃描系統(tǒng)（英國(guó)UVP 公司）；SDS-PAGE 電泳槽（英國(guó)Bio-Rad公司）；PCR儀（美國(guó)Agilent公司）；核酸蛋白分析儀（美國(guó)Beckman）。

1.2 MSC的分離與培養(yǎng) 取2只12周齡SD大鼠頸椎脫臼處死，剝離股骨及脛骨，用含10% FBS 的DMEM 反復(fù)沖洗大鼠脛骨和股骨的骨髓，經(jīng)無(wú)菌濾網(wǎng)過(guò)濾沖洗得到細(xì)胞懸浮液，收集細(xì)胞，2 000 r/min離心30 min，離心半徑8 mm，加入PBS 溶液，1 600 r/min 再次離心10 min，離心半徑8 mm，獲取MSC。收集細(xì)胞，將其置于含細(xì)胞生長(zhǎng)液和抗生素的培養(yǎng)瓶中，于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)；更換培養(yǎng)基去除非黏附細(xì)胞，保留呈梭形形態(tài)的貼壁細(xì)胞。取傳至第四代的MSC 用CD29/CD45/CD11b/CD90 特異性抗體孵育，用流式細(xì)胞儀分析MSC的表面抗原。

1.3 動(dòng)物分組及模型構(gòu)建 將56 只大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周，隨機(jī)分為模型組40 只、假手術(shù)（Sham）組12只、對(duì)照組4 只。模型組于腹腔注射2%戊巴比妥（0.2 mL/100 mg）麻醉，取俯臥位固定，于左側(cè)肋脊角切口進(jìn)入腹腔，切除左側(cè)腎臟，止血后逐層縫合包扎創(chuàng)口，4 周后經(jīng)尾靜脈注射 ADR（2.5 mg/kg），1 周后再次給予相同劑量ADR構(gòu)建CKD模型；對(duì)照組于相同部位注射等體積生理鹽水；Sham 組做左側(cè)肋脊角切口，隨后縫合包扎，于相同部位注射等體積生理鹽水。造模成功后將模型組40只大鼠隨機(jī)分為CKD組4 只及ADR（ADR）組、干細(xì)胞移植（MSC）組、低氧預(yù)處理干細(xì)胞移植（HP-MSC）組各12 只。將CKD組、對(duì)照組大鼠頸椎脫臼處死，取腎臟組織待測(cè)。

1.4 移植MSC 取部分MSC 在常氧環(huán)境［37 ℃、5%CO2、95%空氣環(huán)境（含大約21%O2）］中培養(yǎng)；另取部分MSC 在低氧環(huán)境（37 ℃、5% CO2、2%O2、93%N2）中培養(yǎng)。24 h后加入抗體，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面CXCR4表達(dá)。取以上處理后的（1×106/mL）細(xì)胞懸液各2 mL，分別經(jīng)右腎動(dòng)脈注射入MSC組、HPMSC組，Sham組、ADR組注射L-DMEM培養(yǎng)液2 mL。

1.5 生化指標(biāo)檢測(cè) MSC 移植第1、7 天，于代謝籠中收集 24 h 尿液樣本，取 5 mL 尿液，3 000 r/min 離心5 min，離心半徑8 mm，去除沉淀。收集尿液的過(guò)程中，大鼠自由飲水，但不進(jìn)食。另外，經(jīng)內(nèi)眥靜脈采血3～5 mL，3 000 r/min離心l0 min，離心半徑6.5 mm，取上清液。用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定PRO、Hb、ALB、BUN、SCr。

1.6 腎臟組織病理變化觀察 采用HE 染色法。分別于MSC 移植第1、7 天后，從各組各自抽取4 只大鼠，經(jīng)頸脫臼處死，迅速取出腎臟分離成若干小塊，用4%多聚甲醛固定過(guò)夜后，石蠟包埋制作成4 μm 的石蠟切片，進(jìn)行 HE 染色，于 400 倍光學(xué)顯微鏡下觀察拍片。

1.7 腎臟組織中SDF-1 mRNA 表達(dá)檢測(cè) 采用RT-PCR。取CKD 組和正常組腎臟組織研磨離心，TRIzol 法提取總RNA，根據(jù)說(shuō)明書(shū)提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 后進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。根據(jù)PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行qRT-PCR 反應(yīng)。PCR 反應(yīng)體系25 μL，cDNA 0.2 μg，上、下游引物各1 μL，2 X Easy Taq PCR SuperMix 12.5 μL，RNase-free Water 8.5 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 s，95 ℃變性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s 40 個(gè)循環(huán)，72 ℃ 延伸5 min，然后用2.0%瓊脂糖凝膠電泳分離PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物。以 GAPDH 為內(nèi)參基因，用 2-ΔΔCt法計(jì)算 SDF-1 RNA 的相對(duì)表達(dá)量。SDF-1 上游引物序列5'-AAGGTCTGCGCTGTGCTG-3'，下游引物序列5'-CTCAGGCTGGCTTACC-3'；GAPDH 上游引物序列 5'-TGCTGGCTGGCTGCTCTC-3'，下游引物序列5'-ATGAGGTCCCACCCCTGTTGC-3'。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料用表示，兩組比較采用t檢驗(yàn)，多組比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MSC 特性鑒定結(jié)果及 CXCR4 的表達(dá) MSC 形態(tài)均一呈梭形，魚(yú)群樣分布，旋渦狀生長(zhǎng)。流式細(xì)胞儀顯示MSC 高表達(dá)CD29（99.8%）、CD90（99.4%），而低表達(dá) CD11b（0.25%）、CD45（0.13%）。常氧MSC 及 HP-MSC 的 CXCR4 表達(dá)率分別為（26.80 ±1.57）%、（15.74 ± 1.03）%。HP-MSC 的 CXCR4 表達(dá)率高于常氧MSC（P＜0.01）。

2.2 各組生化指標(biāo)比較 見(jiàn)表1。

表1 各組移植第1、7天生化指標(biāo)比較（）

表1 各組移植第1、7天生化指標(biāo)比較（）

注：與ADR組同一時(shí)間點(diǎn)比較，#P＜0.05；與MSC組同一時(shí)間點(diǎn)比較，△P＜0.05。

ALB（g/L）PRO（mg/24 h）Hb（g/L）BUN（mmol/L）SCr（μmol/L）組別Sham組移植第1天移植第7天ADR組移植第1天移植第7天MSC組移植第1天移植第7天HP-MSC組移植第1天移植第7天25.89±0.95#24.59±1.76#143.25±0.67#144.18±0.33#32.77±0.26#33.32±0.50#2.44±0.35#2.46±0.25#32.88±1.10#34.66±0.23#45.86±3.65 54.91±2.90 113.63±0.57 102.19±0.31 29.46±1.62 22.86±1.20 6.49±0.91 7.22±0.17 75.18±0.61 90.4±0.44 46.43±5.19 39.37±1.93#114.28±0.40 109.29±0.83#29.21±0.89 25.59±1.02#6.39±0.05 5.48±0.27#74.38±0.84 86.92±0.49#74.04±0.98 70.38±0.43#△46.69±2.90 30.59±4.38#△115.27±0.50 110.65±1.48#28.90±0.57 27.24±0.71#△5.96±0.35 3.55±0.97#△

2.3 各組腎臟組織病理變化比較 HE染色結(jié)果顯示，Sham 組腎小球和腎小管形態(tài)正常，ADR 組腎小球局灶節(jié)段性硬化，腎小管?chē)?yán)重萎縮，腎小球系膜細(xì)胞和基質(zhì)呈不同程度增生，腎間質(zhì)明顯纖維化。移植第7 天，MSC 組與HP-MSC 組腎臟組織損傷減輕，MSC 組腎小球尚可見(jiàn)局灶節(jié)段硬化，HP-MSC 組腎小球袢擴(kuò)張；與MSC 組比較，HP-MSC 組腎間質(zhì)纖維化改善更明顯，炎癥反應(yīng)更輕。

2.4 對(duì)照組與CKD 組腎組織SDF-1 mRNA 表達(dá)比較 對(duì)照組與CKD組腎組織SDF-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為1.01±0.06、1.41±0.14。與對(duì)照組比較，CKD組腎組織SDF-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量高（P＜0.05）。

3 討論

研究證實(shí)，MSC 通過(guò)發(fā)揮抗炎、抗纖維化和促進(jìn)血管生成等作用修復(fù)腎臟［7］，但MSC 的治療效果一直受限于較差的生存率和歸巢率。MSC 隨著傳代次數(shù)的增加，純度越高，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)越快，但細(xì)胞表面CXCR4 的表達(dá)量卻逐漸降低，進(jìn)而降低了MSC 對(duì)SDF-1的靶向遷移作用。本研究在移植前通過(guò)低氧預(yù)處理激活MSC。本研究腎功能指標(biāo)檢測(cè)證實(shí)，用ADR 成功地誘導(dǎo)了大鼠慢性腎損傷，CKD大鼠的 PRO、BUN 和 SCr 水平明顯升高，且 ALB 和Hb水平降低。同時(shí)，進(jìn)一步觀察到腎臟組織的病理?yè)p害，表現(xiàn)為腎小球損傷，腎間質(zhì)局灶狀纖維化和ADR 所致其他的腎損傷的特征。本研究發(fā)現(xiàn)，CKD模型大鼠腎組織中SDF-1 mRNA 表達(dá)升高，這可能由于ADR 引起腎臟組織炎癥反應(yīng)進(jìn)而刺激SDF-1表達(dá)升高。當(dāng)移植 MSC 或 HP-MSC 7 天后，CKD 大鼠 PRO、BUN 和 SCr 水平降低，ALB 和 Hb 水平顯著升高。病理檢查結(jié)果顯示，MSC 能減輕CKD 大鼠的腎損傷。與移植MSC 比較，移植HP-MSC 后大鼠PRO、BUN 和 SCr 水平更低，表明 HP-MSC 能夠更好地減輕CKD大鼠腎損傷。

SDF-1 可控制細(xì)胞黏附和分泌其他因子，誘導(dǎo)細(xì)胞穿過(guò)血管內(nèi)皮細(xì)胞［8］。當(dāng)MSC 短時(shí)間暴露于低氧條件下時(shí)，這會(huì)導(dǎo)致CXCR4 表達(dá)增加，并改善SDF-1 介導(dǎo)的趨化性［9］。本研究結(jié)果也證明，HP-MSC 的CXCR4 表達(dá)率升高，說(shuō)明低氧能誘導(dǎo)MSC 表達(dá)更多的CXCR4。此外，還有研究認(rèn)為CKD腎臟組織細(xì)胞局部配體SDF-1高表達(dá)對(duì)表面高表達(dá)受體CXCR4的MSC具有定向趨化作用，并且該作用呈濃度依賴(lài)性［10］。SDF-1與CXCR4同時(shí)高表達(dá)能增強(qiáng)MSC 的歸巢能力。本研究發(fā)現(xiàn)，CKD 大鼠腎組織中SDF-1 mRNA 表達(dá)高于正常大鼠。以上表明低氧預(yù)處理的MSC 通過(guò)調(diào)節(jié)SDF-1-CXCR4 軸來(lái)提高其修復(fù)腎損傷的能力。

MSC 暴露于低氧條件下與其歸巢到體內(nèi)受損組織缺氧微環(huán)境相似［11］。研究表明，HP有助于移植細(xì)胞的存活、增殖、分化以及提高其旁分泌能力［12］。HP-MSC 在受損腎組織中釋放 TGF-β 和 IL-10 等抗炎因子，從而抑制炎癥進(jìn)展［13］。在增殖期，HP-MSC分泌肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子等，從而修復(fù)腎臟［14］。研究證實(shí)，在腎缺血再灌注損傷模型中，上述有益因子可促進(jìn)血管再生，減少氧化應(yīng)激和抑制細(xì)胞凋亡［12］。此外，PI3K、AKT、ERK 和 p38 信號(hào)通路在SDF-1誘導(dǎo)MSC歸巢過(guò)程中也發(fā)揮重要的調(diào)控作用［15］。

本研究證實(shí)，HP-MSC 為通過(guò)調(diào)控SDF-1-CXCR4信號(hào)軸治療慢性腎病提供了新方向。后期研究將進(jìn)一步探討低氧對(duì)MSC 的作用機(jī)制及SDF-1-CXCR4 信號(hào)軸涉及的相關(guān)保護(hù)機(jī)制，以期為MSC 治療CKD提供新的理論依據(jù)。