黃柏酮對肺癌細(xì)胞核糖體合成、增殖的影響及機(jī)制

廉振穎，閻星羽，朱霞琳，李蓮蓮，刁玉濤，劉紅艷

1 山東第一醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，濟(jì)南250062；2 山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬中心醫(yī)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究中心

肺癌是世界上發(fā)病率及病死率較高的惡性腫瘤之一，2020 年全球報(bào)告的肺癌新增病例超過220 萬例［1］。由于多數(shù)肺癌患者確診時(shí)已是晚期，往往出現(xiàn)了腫瘤轉(zhuǎn)移與擴(kuò)散，手術(shù)治療的可能性極低，而傳統(tǒng)放化療對晚期肺癌的治療效果并不理想。針對肺癌驅(qū)動基因的靶向治療已成為臨床重要的治療手段，并且取得了顯著療效。核糖體生物合成是細(xì)胞內(nèi)重要的生物學(xué)過程，核糖體是蛋白質(zhì)合成的“機(jī)器”，直接決定細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成的速率，最終影響細(xì)胞的生長和增殖。由于腫瘤細(xì)胞代謝旺盛，增殖能力強(qiáng)，頻發(fā)核糖體生物合成的異常，因此核糖體生物合成相關(guān)蛋白被認(rèn)為是治療腫瘤的有效靶點(diǎn)。靶向藥物的研發(fā)及作用機(jī)制的闡明對肺癌的治療有著重要意義。黃柏酮來源于黃柏、白鮮皮等植物，為檸檬苦素類三萜化合物，具有多種藥理活性［2-3］。但黃柏酮是否使肺癌患者獲益尚不清楚，對于黃柏酮的抗腫瘤分子機(jī)制也有待于進(jìn)一步闡明。2020年1月—2021 年5 月，本研究以非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞為體外細(xì)胞模型，觀察黃柏酮對肺癌細(xì)胞核糖體合成及增殖的調(diào)控作用，并探討其潛在的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑及儀器 人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞（A549 細(xì)胞）購自中國科學(xué)院分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心細(xì)胞庫。DMEM 和RPMI1640 高糖培養(yǎng)基購自美國HyClone 公司胎牛血清購自以色列Biological Industries（BI）公司，青霉素—鏈霉素混合液、0.25%胰蛋白酶（Trypsin-EDTA）、RIPA 裂解液、BCA 蛋白濃度測定試劑盒購自北京索來寶科技有限公司，TRIzol?、Click-iT? RNA 尿嘧啶核苷類似物（EU）檢測試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒Superscript Ⅲ購自美國Invitrogen 公司，BeyoClick ?胸腺嘧啶核苷類似物（EdU）檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；磷酸化雷帕霉素靶蛋白（p-mTOR）、磷酸化S6 核糖體蛋白 235/236［p-RPS6（235/236）］、磷酸化RPS6（240/244）［p-RPS6（240/244）］、mTOR、RPS6一抗以及辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG 二抗購自美國Cell Signaling Technology（CST）公司，Actin 抗體購自美國Abcam 公司。黃柏酮購自美國Selleck生物科技有限公司子公司上海藍(lán)木化工有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)、分組及藥物干預(yù) 將A549 細(xì)胞接種于含有10%胎牛血清、1%青霉素—鏈霉素雙抗的 DMEM 培養(yǎng)基中，在 37 ℃、5% CO2的孵育箱內(nèi)培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)80%時(shí)，用含0.25% EDTA 的胰蛋白酶消化處理后，按1∶4 傳代。將對數(shù)生長期的A549 細(xì)胞接種于96 孔板中，細(xì)胞融合率40%～50%，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。根據(jù)作者前期研究選50 μmol/L 的黃柏酮進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將細(xì)胞隨機(jī)分為對照組、黃柏酮組，分別加入DMSO 溶劑、50 μmol/L黃柏酮繼續(xù)培養(yǎng)，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。

1.3 細(xì)胞核糖體RNA（rRNA）合成檢測 采用EU標(biāo)記法。取各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h 后，向含有細(xì)胞和完全培養(yǎng)基的96孔板中加入等體積的2×EU 工作液混合均勻，EU 終濃度為1 mmol/L，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育1 h。用3.7%多聚甲醛固定，室溫孵育15 min；0.5% Triton?X-100 滲 透 液 ，室 溫 孵 育15 min。每孔加入50 μL Click-iT?反應(yīng)混合液，室溫下避光孵育30 min；用DAPI 進(jìn)行DNA 染色，用高內(nèi)涵顯微成像系統(tǒng)進(jìn)行成像和分析。熒光顯微鏡下，DAPI 標(biāo)記的活細(xì)胞核呈現(xiàn)藍(lán)色熒光，EU 標(biāo)記的新生成的核仁RNA 呈現(xiàn)綠色熒光。用ImageJ 軟件對熒光信號強(qiáng)度進(jìn)行量化，用積分光密度量化信號強(qiáng)度，計(jì)算EU的定量值。

1.4 細(xì)胞增殖能力檢測 采用EdU 標(biāo)記法。取各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h 后，每孔加入與細(xì)胞完全培養(yǎng)基等體積的2×EdU 工作液混合均勻，EdU 終濃度為 10 μmol/L。置于 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育2 h。3.7%多聚甲醛固定細(xì)胞，室溫靜置15 min；0.3%Triton?X-100的滲透液室溫孵育15 min；ClickiT?檢測：每孔加入50 μl Click-iT?反應(yīng)混合液，室溫下避光孵育 30 min；DAPI 進(jìn)行 DNA 染色，利用高內(nèi)涵成像系統(tǒng)繼續(xù)進(jìn)行熒光檢測和成像分析。在熒光顯微鏡下，DAPI 標(biāo)記的活細(xì)胞細(xì)胞核呈現(xiàn)藍(lán)色熒光，處于增殖狀態(tài)的細(xì)胞被EdU 標(biāo)記呈現(xiàn)明亮的紅色熒光。計(jì)算EdU陽性細(xì)胞的比例。

1.5 細(xì) 胞 中 rRNA（5.8S rRNA、18S rRNA、28S rRNA、45S pre-rRNA）表達(dá)檢測 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR。取各組細(xì)胞培養(yǎng)72 h，用TRIzol 法提取細(xì)胞總RNA 并定量，用Superscript Ⅲ進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。PCR 引物由鉑尚生物技術(shù)（上海）有限公司合成。5.8S rRNA 上游引物序列：5'-ACTCTTAGCGGTGGATCACTC-3'，下游引物序列：5'-AAGCGACGCTCAGACAGG-3'；18S rRNA 上游引物序列：5'-CGGCTACCACATCCAAGG-3'，下游引物序列：5'-TACAGGGCCTCGAAAGAGTC-3'；28S rRNA 上游引物序列：5'-AGTCGGGTTGCTTGGGAATGC-3'，下游引物序列：5-'CCCTTACGGTACTTGTTGACT-3'；45S pre-rRNA 上游引物序列：5'-GCCTTCTCTAGCGATCTGAGAG-3'，下游引物序列：5'-CCATAACGGAGGCAGAGACA-3'；Actin 上游引物序列：5'- CTTAGTTGCGTTACACCCTTTCT-3'，下游引物序列：5'-TGCTGTCACCTTCACCGTTC-3'。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min 進(jìn)行1個(gè)循環(huán)；95 ℃變性10 s、60 ℃退火45 s，40 個(gè)循環(huán)。用 2-ΔΔct法計(jì)算目的基因相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 細(xì)胞中 p-mTOR、p-RPS6（235/236）、p-RPS6（240/244）蛋白表達(dá)檢測 采用Western blotting 法。取各組細(xì)胞培養(yǎng)72 h，用預(yù)冷的RIPA 裂解液于冰上裂解30 min，提取總蛋白。BCA 法蛋白定量后將樣品置于100 ℃金屬浴加熱變性10 min。將30 μg 蛋白樣品加入上樣緩沖液中，通過12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離裂解物樣品，電泳電壓為80 V，30 min 后改為160 V，1 h；將總蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜，電流300 mA、2 h冰上轉(zhuǎn)膜；用5%BSA（5 g，100 mL），4 °C，放置搖床上封閉1 h。一抗p-mTOR、p-RPS6（235/236）、p-RPS6（240/244）、mTOR、RPS6（均按照 1：1 000 稀釋）放置 4 °C 冰箱孵育過夜，TBST 洗 3 次，每次 15 min，加入與 HRP 偶聯(lián)的兔二抗孵育 2 h；TBST 洗 3 次，每次 15 min。ECL 試劑盒檢測蛋白表達(dá)，在多功能成像儀UVitec 顯影并拍照，使用Image J 軟件對蛋白條帶進(jìn)行灰度定量分析。目的蛋白的相對表達(dá)量=目的蛋白灰度值/內(nèi)參蛋白灰度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用Graphpad prism6.01 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料用表示，兩組比較用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 黃柏酮對A549 細(xì)胞核糖體合成能力的影響EU結(jié)果顯示，黃柏酮組熒光信號強(qiáng)度與對照組熒光信號強(qiáng)度的比值為0.684± 0.008（P＜0.05）。

2.2 黃柏酮對A549細(xì)胞增殖能力的影響 黃柏酮組、對照組EdU 陽性細(xì)胞率分別為（28.74 ±0.95）%、（43.45±0.78）%。與對照組比較，黃柏桐組EdU陽性細(xì)胞率低（P＜0.05）。

2.3 黃柏酮對A549 細(xì)胞中核糖體RNA 表達(dá)的影響 見表1。

表1 兩組核糖體RNA表達(dá)比較（）

表1 兩組核糖體RNA表達(dá)比較（）

注：與對照組比較，*P＜0.05。

組別核糖體RNA 28S rRNA 1.00±0.06 0.55±0.05*-16.660＜0.05 t P對照組黃柏酮組Pre-45S rRNA 1.00±0.03 0.73±0.02*-24.620＜0.05 5.8S rRNA 1.00±0.03 0.80±0.01*-11.100＜0.05 18S rRNA 1.00±0.06 0.47±0.07*-10.110＜0.05

2.4 黃柏酮對A549 細(xì)胞中磷酸化RPS6、磷酸化mTOR蛋白表達(dá)的影響 見表2。

表2 兩組p-mTOR、p-RPS6（235/236）、p-RPS6（240/244）、mTOR及RPS6蛋白相對表達(dá)量比較（）

表2 兩組p-mTOR、p-RPS6（235/236）、p-RPS6（240/244）、mTOR及RPS6蛋白相對表達(dá)量比較（）

注：與對照組比較，*P＜0.05。

組別對照組黃柏酮組RPS6蛋白0.09±0.01 0.09±0.01 p-mTOR蛋白0.19±0.01 0.08±0.01*p-RPS6（235/236）蛋白3.11±0.21 1.34±0.04*p-RPS6（240/244）蛋白1.13±0.14 0.776±0.07*mTOR蛋白0.63±0.07 0.64±0.07

3 討論

癌細(xì)胞為了快速生長和增殖，必須保持高速率的核糖體生物合成。研究表明，腫瘤中存在核糖體生物合成的頻繁失調(diào)［4］。因此針對核糖體生物合成設(shè)計(jì)或篩選抑制劑來抑制癌細(xì)胞的過度增殖是行之有效的方法。研究報(bào)道rRNA 合成抑制劑（CX-5461）通過阻止轉(zhuǎn)錄起始因子SL1與rDNA啟動子的結(jié)合來破壞轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的形成，從而特異性地抑制RNA 聚合酶Ⅰ轉(zhuǎn)錄起始，說明核糖體生物合成相關(guān)分子是癌癥治療干預(yù)的靶點(diǎn)［5］。臨床前研究表明，CX-5461 可顯著降低小鼠模型中myc 癌基因驅(qū)動的血液癌癥的腫瘤負(fù)荷［6］。用于癌癥治療的藥物在抑制核糖體合成方面發(fā)揮重要作用，研究發(fā)現(xiàn)阿霉素在釀酒酵母中可抑制與核糖體小亞基生物發(fā)生、組裝、加工相關(guān)的 34 個(gè)基因［7］；放線菌素D 優(yōu)先插入富含GC 的rDNA，在復(fù)制叉處阻止RNA 聚合酶轉(zhuǎn)錄［8］；奧沙利鉑能夠?qū)е潞颂求w合成缺陷從而殺死淋巴瘤細(xì)胞［9］。而目前關(guān)于靶向核糖體合成的選擇性藥物研究甚少。

白鮮皮為常用中藥，味苦、性寒，有清熱燥濕、祛風(fēng)解毒的功效。黃柏酮為白鮮皮的活性成分，能夠抗腫瘤并且增強(qiáng)抗腫瘤藥的細(xì)胞毒作用［2］。有研究報(bào)道，黃柏酮能夠抑制前列腺癌細(xì)胞、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、結(jié)腸腺癌和乳腺癌細(xì)胞的增殖［3，10-11］。其作用機(jī)制與煙酸和煙酰胺代謝、苯丙氨酸代謝、色氨酸代謝、類固醇激素生物合成、嘧啶代謝、精氨酸和脯氨酸代謝以及甘油磷脂代謝有關(guān)［3］。對乳腺癌的研究還發(fā)現(xiàn)，黃柏酮通過上調(diào)促凋亡蛋白Bax 的表達(dá)，下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl2的表達(dá)，誘導(dǎo)G1細(xì)胞周期停滯來促進(jìn)細(xì)胞凋亡。黃柏酮可通過激活Nrf2 通路有效保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激反應(yīng)的損傷，并抑制博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化［12］。但是，目前黃柏酮在肺癌中的作用尚不清楚。

本研究利用高內(nèi)涵細(xì)胞成像系統(tǒng)篩選核糖體合成抑制劑，發(fā)現(xiàn)黃柏酮對肺癌A549細(xì)胞中核糖體的合成和細(xì)胞增殖有抑制作用，表明黃柏酮對肺癌具有抗腫瘤活性。本研究進(jìn)一步檢測了核糖體RNA的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)黃柏酮處理明顯抑制了A549 細(xì)胞中5.8S rRNA、18S rRNA、28S rRNA 以 及 45S 前 體rRNA的表達(dá)，提示黃柏酮可能通過降低核糖體合成從而抑制細(xì)胞增殖。

黃柏酮能夠抑制多種腫瘤細(xì)胞增殖，目前其分子作用機(jī)制尚未闡明。本研究初步探討了黃柏酮影響肺癌細(xì)胞增殖的分子機(jī)制，發(fā)現(xiàn)50 μmol/L 黃柏酮處理A549 后細(xì)胞內(nèi)mTOR、RPS6 蛋白的磷酸化水平均顯著降低，提示黃柏酮通過調(diào)控mTOR/RPS6信號通路發(fā)揮了對肺癌細(xì)胞增殖的抑制作用。RPS6 是真核生物核糖體40S 亞基中的一個(gè)至關(guān)重要的蛋白質(zhì)成分，作為核糖體蛋白激酶S6K 的底物其S235/236和S240/244位點(diǎn)受S6K的磷酸化調(diào)控。黃柏酮能夠同時(shí)抑制RPS6 蛋白S235/236 和S240/244 位點(diǎn)的磷酸化，進(jìn)一步證實(shí)黃柏酮通過抑制mTOR/RPS6 信號通路的激活進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖。mTOR 在細(xì)胞內(nèi)通過與其他分子形成復(fù)合物發(fā)揮生物功能，其主要形成兩種復(fù)合物：mTOR 復(fù)合物1 和 mTOR 復(fù)合物 2，其中 mTORC1 在代謝方面發(fā)揮重要的作用，尤其在調(diào)控核糖體合成、嘌呤和嘧啶的從頭生物合成方面占有重要的生物學(xué)地位［13］。腫瘤中mTORC1 頻繁過度激活，調(diào)控其下游信號加速蛋白、脂類以及核苷酸的合成代謝過程，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長和增殖［13-15］。因此黃柏酮有望成為mTOR的靶向藥物，為肺癌的靶向治療提供選擇。

綜上所述，黃柏酮能夠抑制肺癌細(xì)胞的核糖體合成和細(xì)胞增殖，其分子機(jī)制可能是通過抑制mTOR/RPS6 信號通路的激活實(shí)現(xiàn)。本研究僅在細(xì)胞水平初步探討了黃柏酮影響肺癌細(xì)胞增殖的分子機(jī)制，其體內(nèi)的抗腫瘤作用以及具體作用機(jī)制仍不完全清楚，尚需進(jìn)一步研究。