黃芩苷對急性高眼壓小鼠視網(wǎng)膜損傷的治療作用

高雪松，王全，張釗，孫瑞強

天津市眼科醫(yī)院麻醉科，天津300020

青光眼是一種對視神經(jīng)及視覺功能產(chǎn)生損傷的疾病，其主要特征為視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞（RGC）發(fā)生不可逆性死亡或視野缺損［1］。臨床認為青光眼的發(fā)病機制與機械壓迫、缺血損傷、氧化應激及神經(jīng)炎癥反應等有關，但針對青光眼發(fā)病機制的有效治療手段卻研究較少［2-3］。因此，如何早期對青光眼患者進行干預，阻止RGC 進一步受損，成為目前臨床上研究的難題。黃芩苷是從中藥黃芩中提取的一種黃酮類化合物，能通過對Toll 樣受體4 信號通路的調(diào)節(jié)減輕神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)炎癥反應［4］。目前有關黃芩苷是否對急性高眼壓視神經(jīng)損傷有治療作用的研究較少［5］。因此，2021 年 2 月—7 月本研究觀察黃芩苷對急性高眼壓小鼠視網(wǎng)膜損傷的治療作用。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑及儀器 6～8 周C57BL/6 小鼠100只，雌雄各半，體質(zhì)量 180～225（210 ± 20）g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證為［SCXK（京）2016-0008］，動物飼養(yǎng)室溫度（21 ±2）℃，相對濕度（55 ± 1）%，光照/黑暗周期為12 h，實驗開始前均以普通飼料飼養(yǎng)，符合“眼與視覺研究協(xié)會動物使用聲明”中的相關規(guī)定［5］。黃芩苷購自荊州市宏達生物科技股份有限公司，HE染色試劑盒購自上海一研生物科技有限公司，兔抗鼠誘導性一氧化氮合酶（iNOS）購自美國CST 公司，免疫鼠白細胞介素1β（IL-1β）抗體購自上海安研商貿(mào)有限公司，免疫鼠腫瘤壞死因子（TNF-α）購自上海信帆生物科技有限公司，小鼠IL-1β 酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒購自中國廣州Elabscience 公司，實時熒光定量PCR試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司，Tonolab手持眼壓計購自芬蘭Icare公司。

1.2 動物分組、模型構建及藥物干預 用隨機數(shù)字表法將小鼠分為正常對照組、高眼壓組、黃芩苷25 mg/kg+高眼壓組、黃芩苷50 mg/kg+高眼壓組、黃芩苷75 mg/kg+高眼壓組，每組20 只。其中正常對照組正常飼養(yǎng)，其他各組通過前房灌注平衡鹽溶液建立急性高眼壓模型，方法：經(jīng)腹腔麻醉后對小鼠眼球表面進行麻醉及散瞳。使用一次性無菌輸液器連接30 G 胰島素針頭及生理鹽水溶液以形成前房灌注裝置，對前房進行穿刺，維持灌注高度為1 m，用Tonolab眼壓計測量小鼠眼壓，保證眼壓60 mmHg左右，使前房維持50 min 的水密狀態(tài)。且前房灌注前30 min，黃芩苷各組經(jīng)尾靜脈分別注射25、50、75 mg/kg 黃芩苷，藥物濃度選擇參考相關文獻［6］；正常對照組及高眼壓組經(jīng)尾靜脈注射等量生理鹽水。

1.3 視網(wǎng)膜厚度測算 采用HE 染色法。造模1、3、5、7 d 時，各組每日分別取5 只大鼠以10%水合氯醛進行麻醉并斷頸處死，取左眼視網(wǎng)膜組織，制作石蠟切片后用HE 進行染色，在Zeiss 倒置顯微鏡下采集視網(wǎng)膜圖片，用ImageJ 軟件對距神經(jīng)中心1 mm 處內(nèi)界膜至外界膜的視網(wǎng)膜全層厚度進行測量。

1.4 視網(wǎng)膜組織中IL-1β、TNF-α、iNOS mRNA 表達檢測 采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）。造模7 d后，取各組右眼視網(wǎng)膜組織分成兩部分保存于液氮中，其中一部分制備組織勻漿并提取總RNA，測定濃度及純度，以RNA 為模板行逆轉(zhuǎn)錄反應，將所得cDNA 進行 qRT-PCR 反應。反應體系 20 μL：ULtra-SYBR mixture 10 μL、模板cDNA 2 μL、上下游引物各2.0 μL、去離子純化水4 μL。反應條件：95 ℃預變性 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共 40 個循環(huán)。以U6為內(nèi)參，用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。引物序列由賽默飛世爾科技（中國）有限公司設計并合成。IL-1β 正向引物序列：5'-AAGGTGAAGGTCGGAGTCAAC-3'，反向引物序列：5'-GGGGTCATTGATGGCAACAATA-3'；TNF-α 正向引物 序 列 ：5'-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3'，反向引物序列：5'-GGAACGCTTCACGAATTTG-3'；iNOS 正向引物序列：5'-AAGAACCAGTACGTCAGTATCGG-3'，反向引物序列：5'-CACAAACGAGACCAGCGAGT-3'；β -actin 正 向 引 物 序 列 ：5'-GCAGAAGTGCGAAGAGGAGG-3'，反向引物序列：GCTTGATGGAGTTGTCGGTGTA-3'。

1.5 視網(wǎng)膜組織中IL-1β、TNF-α、iNOS蛋白表達檢測 采用Westen blotting 法。將剩余部分右眼視網(wǎng)膜組織制備組織勻漿，冰上裂解，依據(jù)蛋白提取試劑盒提取總蛋白，行聚丙烯酰胺凝膠電泳，聚偏二氟乙烯膜轉(zhuǎn)膜，5%牛血清白蛋白封閉，孵小鼠一抗IL-1β、TNF-α、iNOS 及內(nèi)參β-actin，稀釋比例均為1∶500，4 ℃過夜，清洗，孵育辣根過氧化物酶標記的二抗，曝光顯影，用ImageJ 軟件分析蛋白條帶，目的基因相對表達量=目的蛋白條帶灰度值/β-actin 蛋白條帶灰度值。

1.6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS23.0 統(tǒng)計軟件。計量資料符合正態(tài)分布以表示，多組比較采用方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組不同時間點視網(wǎng)膜全層厚度比較 見表1。

表1 各組不同時間點視網(wǎng)膜全層厚度比較（n=5，）

表1 各組不同時間點視網(wǎng)膜全層厚度比較（n=5，）

注：與正常對照組同時間點比較，aP＜0.05；與高眼壓組同時間點比較，bP＜0.05；與黃芩苷25 mg/kg+高眼壓組同時間點比較，cP＜0.05；與黃芩苷50 mg/kg+高眼壓組同時間點比較，dP＜0.05。與同組造模1 d比較，eP＜0.05；與同組造模3 d比較，fP＜0.05；與同組造模5 d比較，gP＜0.05。

造模7 d 131.22±25.18 389.96±58.50aefg 201.73±30.26abefg 181.25±27.19abcefg 157.11±23.58abcdefg組別視網(wǎng)膜全層厚度（μm）造模3 d 130.06±24.33 321.16±48.18ae 245.76±36.87abe 231.85±35.78abce 210.16±32.55abcde造模1 d 132.16±24.33 295.89±45.03a 262.38±39.36ab 250.55±33.23abc 233.03±27.45abcd造模5 d 132.13±24.32 359.69±55.50aef 222.73±33.41abef 206.79±31.05abcef 183.05±27.45abcdef正常對照組高眼壓組黃芩苷25 mg/kg+高眼壓組黃芩苷50 mg/kg+高眼壓組黃芩苷75 mg/kg+高眼壓組

2.2 各組視網(wǎng)膜組織中IL-1β、TNF-α 及iNOS 表達比較 見表2。

表2 各組視網(wǎng)膜組織中IL-1β、TNF-α及iNOS表達比較（n=5，）

表2 各組視網(wǎng)膜組織中IL-1β、TNF-α及iNOS表達比較（n=5，）

注：與正常對照組比較，aP＜0.05；與高眼壓組比較，bP＜0.05；與黃芩苷25 mg/kg+高眼壓組比較，cP＜0.05；與黃芩苷50 mg/kg+高眼壓組比較，dP＜0.05。

蛋白0.20±0.03 1.16±0.18a 0.83±0.13ab 0.66±0.09abc 0.40±0.06abcd組別正常對照組高眼壓組黃芩苷25 mg/kg+高眼壓組黃芩苷50 mg/kg+高眼壓組黃芩苷75 mg/kg+高眼壓組IL-1β mRNA 1.00±0.15 1.89±0.29a 1.75±0.28ab 1.58±0.25abc 1.26±0.19abcd蛋白0.19±0.03 0.98±0.15a 0.72±0.11ab 0.51±0.08abc 0.35±0.06abcd TNF-α mRNA 1.00±0.16 1.77±0.27a 1.53±0.23ab 1.40±0.22abc 1.18±0.18abcd蛋白0.23±0.05 0.97±0.15a 0.79±0.12ab 0.62±0.09abc 0.45±0.07abcd iNOS mRNA 1.00±0.15 1.92±0.29a 1.80±0.28ab 1.61±0.25abc 1.37±0.21abcd

3 討論

青光眼是一種不可逆致盲性眼病，其病理基礎是RGC 發(fā)生不可逆性死亡。常通過制備前房灌注模型以模擬急性青光眼視神經(jīng)損傷，該模型所產(chǎn)生的壓力機械性損傷情況與青光眼急性發(fā)作的疾病進程具有較好的一致性［7-8］。評估視網(wǎng)膜的病理形態(tài)學能進一步了解干預因素對視網(wǎng)膜損傷的作用［9］。黃芩可常用于治療肝膽疾病、炎癥反應性疾病，從黃芩苷中所提取分離的黃酮類化合物具有抗炎、神經(jīng)保護、抗氧化及對腫瘤生長產(chǎn)生抑制作用。但目前臨床仍缺乏具有明確視神經(jīng)保護功效類藥物，所以在本研究中并無陽性對照組。

視網(wǎng)膜是眼睛里一層菲薄而透明的組織，對于完成視覺功能非常重要，視網(wǎng)膜厚度增加往往說明視網(wǎng)膜發(fā)生病變。本研究結果顯示，與正常對照組比較，高眼壓組各時間點視網(wǎng)膜全層厚度均升高，具有時間依賴性，而當以不同濃度黃芩苷藥物進行干預后，小鼠各時間點視網(wǎng)膜全層厚度均一定程度降低，呈時間及劑量依賴性。說明黃芩苷可能對高眼壓小鼠視網(wǎng)膜損傷具有一定保護作用。近年來對神經(jīng)炎癥反應的研究越來越重視，病理情況下，神經(jīng)小膠質(zhì)細胞被激活后快速增殖，釋放大量的神經(jīng)毒性因子及炎癥反應因子等，介導腦神經(jīng)元的損傷［10］。IL-1β、TNF-α、iNOS 均是常見致炎因子。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常對照組比較，高眼壓組小鼠視網(wǎng)膜組織中炎癥因子IL-1β、TNF-α、iNOS mRNA 及其蛋白表達均升高；當以不同濃度黃芩苷藥物進行干預后，小鼠視網(wǎng)膜組織中炎癥因子IL-1β、TNF-α、iNOS mRNA及其蛋白表達均一定程度降低，呈劑量依賴性。說明黃芩苷能有效減輕小鼠視網(wǎng)膜組織中炎癥因子的表達、釋放，進而減輕炎癥反應。

由于本研究采用的是預處理的方式進行干預，這與臨床中先發(fā)病后治療的實際情況可能不相符。但有學者在缺血缺氧性腦損傷疾病的動物研究中發(fā)現(xiàn)，黃芩苷與對新生大鼠缺血缺氧性腦損傷具有保護作用的地塞米松具有相似藥理作用［11］。譚麗麗等［12］研究顯示，缺血預處理聯(lián)合黃芩苷預處理對大鼠腦缺血再灌注半暗帶細胞凋亡具有抑制作用，從而發(fā)揮腦保護作用。基于以上文獻，本研究選擇了以黃芩苷預處理的方式進行干預。

綜上所述，用黃芩苷能減輕急性高眼壓小鼠視網(wǎng)膜炎癥反應，進而保護損傷的視網(wǎng)膜，可為黃芩苷在臨床急性高眼壓中的治療提供理論依據(jù)。然而本研究并未能明確黃芩苷對急性高眼壓視網(wǎng)膜損傷發(fā)揮保護作用的具體機制，后期應進行深入研究。