骨關(guān)節(jié)炎大鼠軟骨組織中生物鐘基因及蛋白的表達(dá)變化

張曉冬，溫亮

首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院骨科，北京100020

骨關(guān)節(jié)炎（OA）為一種常見的關(guān)節(jié)退行性病變，好發(fā)于中老年人群，發(fā)病率與年齡呈正相關(guān)［1］。目前OA 的治療僅限于緩解疼痛癥狀或接受關(guān)節(jié)置換，尚無更好的解決方法。研究發(fā)現(xiàn)，OA 的發(fā)生與軟骨細(xì)胞生物鐘紊亂有關(guān)。哺乳動物的生物節(jié)律受中樞及外周生物鐘的調(diào)控，中樞生物鐘位于下丘腦視交叉上核（SCN），可產(chǎn)生自主生物節(jié)律；外周生物鐘位于心臟、肌肉、軟骨等，可調(diào)控局部組織生物鐘，其中位于軟骨組織中的生物鐘基因及蛋白可以調(diào)控“休息時(shí)軟骨細(xì)胞的修復(fù)”以及“運(yùn)動時(shí)軟骨細(xì)胞的磨損”之間的平衡。如果該平衡能夠保持，則OA 不會發(fā)生［2-4］?？刂栖浌羌?xì)胞生物鐘的基因及蛋白主要有兩對，對生物鐘起激活作用的BMAL1 和CLOCK 及起抑制作用的 PER1 和 CRY1。OA 患者BMAL1 基 因 和 蛋 白 表 達(dá) 降 低［5-6］，但 OA 患 者CLOCK、PER1 和CRY1 基因及蛋白的表達(dá)尚未明確。2020 年 6 月—12 月，我們觀察了 OA 大鼠軟骨組織生物鐘基因及蛋白的表達(dá)變化。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑及儀器 6周齡雄性SD 大鼠24只，購自中國藥品生物制品檢定所，動物許可證號：SCXK（京）2014-001，無特殊病原體級，質(zhì)量200～230 g，飼養(yǎng)于清潔級動物房，常規(guī)飼料喂養(yǎng)，每日加水，每周更換1次墊料。鹽酸氨基葡萄糖（普力得），北京康比得藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字H20070173，規(guī)格：0.24 g×42 粒。PCR 相關(guān)試劑：Power SYBR Green PCR Master Mix 試劑盒（日本TOYOBO 公司，QPK-201）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國Promega 公司，A3500）；引物由廣州復(fù)能公司Genecopoeia 代合成。Western blotting 相關(guān)試劑：SDS-PAGE 凝膠制備試劑盒（中國索萊寶，P1200），Western blotting 蛋 白 Marker（美 國 Thermo Fisher，26610）；5×蛋白上樣緩沖液（含DTT，中國索萊寶，P1040）；ECL 超敏發(fā)光液（中國索萊寶，PE0010）；CLOCK 抗體（英國 Abcam，ab3517）；PER1 抗體（英國 Abcam，ab136451）；CRY1 抗體（英國 Abcam，ab54649）；BMAL1 抗體（英國Abcam，ab231793）；βactin 抗體（英國 Abcam，ab8227）。HE 染色相關(guān)試劑：改良HE 染色試劑盒（中國索萊寶，G1121）。儀器：旋轉(zhuǎn)式組織脫水機(jī)（日本櫻花病理儀器株式會社，4634）；組織包埋機(jī)（日本櫻花病理儀器株式會社，5235）；石蠟溶蠟箱（日本櫻花病理儀器株式會社，PM-401）；舒式切片機(jī)（日本櫻花病理儀器株式會社，CRM-44）；雙人顯微鏡（日本 OLYMPUS，BH-2）；Nanno Drop（美國Thermo Scientific，NDoneW）；基因擴(kuò)增儀（美國MJResearch，TTC-220）；PCR儀（美國Applied Biosystems，ABI7500）；電泳儀（美國BIORAD，042BR03674）；酶 標(biāo) 儀（美 國 BIO-RAD，721BR16681）。

1.2 動物分組及模型制備 用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為正常對照組、模型組、鹽酸氨基葡萄糖組，各8 只。模型組、鹽酸氨基葡萄糖組以Hulth 法制備OA 模型，術(shù)前24 h 禁食禁水，用10%水合氯醛（4 mL/kg）腹腔注射麻醉，膝關(guān)節(jié)及其周圍備皮、消毒，于大鼠髕韌帶做橫向約5 mm 切口，充分暴露關(guān)節(jié)腔，切掉內(nèi)側(cè)半月板及內(nèi)側(cè)副韌帶，刀尖向下，切斷前后交叉韌帶。術(shù)后以生理鹽水清理傷口，以無菌紗布將周圍血跡擦干后，縫合傷口。術(shù)后連續(xù)3 d以青霉素16萬U局部注射，防止感染［7-8］。

1.3 干預(yù)方法 正常對照組、模型組均給予生理鹽水3 mL/d灌胃；鹽酸氨基葡萄糖組給予鹽酸氨基葡萄糖25 mg/（kg·d）灌胃。每天1次，連續(xù)28 d。

1.4 取材 連續(xù)干預(yù)28 d，將大鼠腹腔注射10%水合氯醛（4 mL/kg）進(jìn)行麻醉，麻醉后用采血針行心臟取血，每只大鼠取血10 mL 后脫頸椎處死。將造模部位的關(guān)節(jié)取出置于提前準(zhǔn)備的器材中（注意此過程操作時(shí)膝關(guān)節(jié)不可接觸鼠毛，防止RNA 酶污染）。取材完畢，將血液放入離心機(jī)內(nèi)，以1 700 r/min 離心10 min（半徑16 cm），分離上清液。將膝關(guān)節(jié)放置于-80 ℃冰箱中保存，用于提取RNA及蛋白質(zhì)，各組取3只大鼠的膝關(guān)節(jié)進(jìn)行HE染色，剩余5只用于PCR及Western blotting檢測。

1.5 膝關(guān)節(jié)軟骨組織病理變化觀察 采用HE 染色法。將膝關(guān)節(jié)置于EDTA 中脫鈣70 d，脫鈣間期每天搖晃1 次脫鈣的EDTA 液，每周更換1 次以充分脫鈣。待膝關(guān)節(jié)周圍骨頭用針刺可以刺穿時(shí)進(jìn)行石蠟包埋，其次進(jìn)行切片、脫蠟并染色。染色結(jié)束后采用顯微鏡進(jìn)行觀察。

1.6 軟骨組織破壞情況評價(jià) 采用Mankin's評分。每組取3 只脫鈣后的膝關(guān)節(jié)軟骨，采用Safranin O 染色，5倍物鏡10倍目鏡顯微鏡下觀察軟骨結(jié)構(gòu)、軟骨細(xì)胞數(shù)量、軟骨潮線、Safranin O 染色情況，以上述四個(gè)指標(biāo)綜合評分作為最終Mankin's 評分。分值越高，軟骨組織破壞越嚴(yán)重。

1.7 軟 骨 組 織 中 BMAL1、CLOCK、PER1、CRY1 mRNA 表達(dá)檢測 采用PCR 技術(shù)。用手術(shù)刀將軟骨從關(guān)節(jié)表面刮下，置于研缽內(nèi)研磨，邊研磨邊加入液氮，研磨成粉末，轉(zhuǎn)移至EP 管中。以RNA 提取試劑盒進(jìn)行提取RNA，提取后的RNA以NanoDrop進(jìn)行檢測。用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，配制反應(yīng)體系50 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性 5 min；95 ℃變性1 min、65 ℃退火50 s、55 ℃延伸90 s，40 個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增引物由廣州復(fù)能公司Genecopoeia合成，PER1上游引物序列5'-GACGGATTCATCTACCAGTG-3'，下游引物序列5'-GGCTTAGCGGCATTACGGTG-3'；CRY1上游引物序列5'-GACTTGGACGTTAACGGCAC-3'，下游引物序列5'-ACTTACGGTAACCGTTAGGG-3'；CLOCK 上 游 引 物 序 列 5'-ACCTAGGCTTAGCCTAACAC-3'，下游引物序列5'-ATCCCGGATAAGCTAGATAC-3'；BMAL1 上游引物序列5'-GACGTTACGTTGCACTAGAC-3'，下游引物序列 5'-GCAATGGACAAGTCGGATCG-3'；β-actin 上游引物序列5'-GAGGGAAATCGTGCGTGA-3'，下游引物序列 5'-CTGGAAGGTGGACAGTGA-3'。用 2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因相對表達(dá)量。

1.8 軟骨組織中 BMAL1、CLOCK、PER1、CRY1 蛋白表達(dá)檢測 采用Western blotting 法。取研磨成粉末的軟骨，用蛋白提取試劑盒提取蛋白，提取后的蛋白使用BCA 試劑盒檢測蛋白濃度，以RIPA 裂解液稀釋蛋白使提取的蛋白濃度為1 μg/μL，加入蛋白上樣緩沖液，100 ℃煮沸5 min。配制凝膠，上樣并電泳，先采用80 V 通電30 min 后轉(zhuǎn)換成120 V。將分離好的條帶轉(zhuǎn)膜至PVDF 膜上，封閉、加抗體，其中一抗為BMAL1、CLOCK、PER1、CRY1，稀釋比分別為 1∶500、1∶1 000、1∶500、1∶500。二抗為β-actin 抗體，比例為1∶1 000。抗體孵育結(jié)束后顯色并讀取灰度值，使用Image Lab 軟件讀取并分析灰度值。目的蛋白相對表達(dá)量=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參條帶灰度值。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0 統(tǒng)計(jì)軟件。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組軟骨病理變化比較 正常對照組軟骨表面光滑，潮線完整，厚度正常；模型組軟骨表面不光滑，軟骨變薄；鹽酸氨基葡萄糖組軟骨表面光滑，厚度基本正常，潮線基本完整。

2.2 各組軟骨組織破壞情況比較 正常對照組、模型組、鹽酸氨基葡萄糖組Mankin's 評分分別為（0.23 ± 0.17）、（11.92 ± 0.61）、（7.68 ± 0.52）分。與正常對照組比較，模型組Mankin's 評分高（P＜0.05）；與模型組比較，鹽酸氨基葡萄糖組Mankin's評分低（P＜0.05）。

2.3 各組軟骨組織中 BMAL1、CLOCK、PER1、CRY1 mRNA表達(dá)比較 見表1。

表1 各組軟骨組織中BMAL1、CLOCK、PER1、CRY1 mRNA相對表達(dá)量比較（）

表1 各組軟骨組織中BMAL1、CLOCK、PER1、CRY1 mRNA相對表達(dá)量比較（）

注：與正常對照組比較，▲P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05。

組別正常對照組模型組鹽酸氨基葡萄糖組CRY1 mRNA 1 1.43±0.42▲1.15±0.31△BMAL1 mRNA 1 0.53±0.26▲0.83±0.63△CLOCK mRNA 1 0.51±0.32▲0.94±0.56△PER1 mRNA 1 1.55±0.46▲1.29±0.61△

2.4 各組軟骨組織中 BMAL1、CLOCK、PER1、CRY1蛋白表達(dá)比較 見表2。

表2 各組軟骨組織中BMAL1、CLOCK、PER1、CRY1蛋白相對表達(dá)量比較（）

表2 各組軟骨組織中BMAL1、CLOCK、PER1、CRY1蛋白相對表達(dá)量比較（）

注：與正常對照組比較，▲P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05。

組別正常對照組模型組鹽酸氨基葡萄糖組CRY1蛋白1 1.46±0.22▲1.05±0.22△BMAL1蛋白1 0.64±0.15▲0.79±0.23△CLOCK蛋白1 0.61±0.32▲1.12±0.36△PER1蛋白1 1.65±0.43▲1.19±0.31△

3 討論

OA作為一種常見的關(guān)節(jié)退行性疾病，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。研究OA 與軟骨細(xì)胞生物鐘的關(guān)系，可從生物鐘的方向探索OA 可能的發(fā)病機(jī)制。本研究采用Hulth 法制作OA 模型。關(guān)節(jié)軟骨由軟骨基質(zhì)和軟骨細(xì)胞組成，軟骨表面的局灶損傷是OA發(fā)生的開始，進(jìn)而出現(xiàn)軟骨基質(zhì)代謝紊亂，最后發(fā)展成更大范圍的軟骨破壞。本研究結(jié)果顯示，OA大鼠關(guān)節(jié)軟骨表面不光滑，HE 染色見軟骨變薄，潮線不完整，Mankin's 評分較高，表明存在明顯的骨破壞，此表現(xiàn)與OA 的病理表現(xiàn)一致，證明Hulth 法可成功復(fù)制OA 模型。鹽酸氨基葡萄糖干預(yù)后OA 大鼠關(guān)節(jié)軟骨表面變光滑，潮線完整，Mankin's 評分降低，表明鹽酸氨基葡萄糖對OA 大鼠有治療作用，可以作為本實(shí)驗(yàn)的陽性藥物。

本研究PCR 檢測結(jié)果顯示，模型組軟骨組織BMAL1、CLOCK 基因表達(dá)低，PER1、CRY1 基因表達(dá)高；鹽酸氨基葡萄糖干預(yù)后，BMAL1、CLOCK 基因表達(dá)量上升，PER1、CRY1 基因表達(dá)量下降。Western blotting 檢測結(jié)果與PCR 結(jié)果一致。這與相關(guān)研究結(jié)果一致，即OA 患者軟骨細(xì)胞中存在生物鐘基因及蛋白表達(dá)紊亂，其中BMAL1 蛋白的表達(dá)明顯降低［9-11］。另外本研究還發(fā)現(xiàn)，除BMAL1 蛋白表達(dá)降低外，CLOCK 蛋白表達(dá)量也呈降低趨勢，而PER1、CRY1 蛋白表達(dá)量呈升高趨勢。但由于目前對OA軟骨細(xì)胞生物鐘的相關(guān)研究較少，并不能明確BMAL1、CLOCK、PER1、CRY1 四種基因及蛋白在OA中的主要作用。

哺乳動物體內(nèi)存在著兩個(gè)生物鐘環(huán)路［12-14］，該環(huán)路主要依靠四種蛋白的調(diào)控，分別是BMAL1、CLOCK 和 PER1、CRY1 蛋白，前兩種對生物鐘的調(diào)控起激活作用，后兩種起抑制作用［15-16］。結(jié)合本研究結(jié)果可以推測，OA大鼠軟骨細(xì)胞中起激活作用的BMAL1、CLOCK 表達(dá)受到抑制，而起抑制作用的PER1、CRY1 表達(dá)被激活，這導(dǎo)致了“休息時(shí)軟骨細(xì)胞的修復(fù)”以及“運(yùn)動時(shí)軟骨細(xì)胞的磨損”之間的平衡被打破，在休息時(shí)使軟骨不能及時(shí)得到修復(fù)，進(jìn)而引發(fā)OA。由此猜想，可將時(shí)間醫(yī)學(xué)納入OA 的治療理念中，通過修復(fù)OA 軟骨細(xì)胞生物鐘基因及蛋白的表達(dá)，維持好“休息時(shí)軟骨細(xì)胞的修復(fù)”以及“運(yùn)動時(shí)軟骨細(xì)胞的磨損”之間的動態(tài)平衡。

綜上所述，OA 大鼠存在軟骨細(xì)胞生物鐘紊亂，其中對生物鐘起激活作用的BMAL1、CLOCK基因及蛋白表達(dá)下降，起抑制作用的PER1、CRY1 基因及蛋白表達(dá)上升。本研究探索了OA 的發(fā)病機(jī)制，為OA的臨床治療提供新的思路與方向。