酸奶發酵劑中菌株分離重組及其在豆乳中的發酵特性

任海東，李興飛，成呂睿，魯緒強，劉軍，時玉強，華欲飛*

1(江南大學 食品學院，江蘇 無錫，214122)2(禹王植物蛋白有限公司，山東 德州，251500) 3(上海協和雙語高級中學，上海，201103)

大豆是一種優質的植物蛋白來源，具有很高的蛋白質含量，且氨基酸評分較高，和牛奶蛋白接近。研究顯示，在每天的蛋白質攝入中若包含50%的植物性蛋白質將有助于減少食品系統對環境的影響，同時滿足全球蛋白質需求，并且這樣的飲食結構會更加均衡和健康[1-2]，因此豆漿也被視作牛奶的替代品。豆漿經過乳酸菌發酵后，不僅保留了原有的品質，還可以降低異味成分和抗營養因子，產生“令人愉悅”的風味[3-4]，同時促進葡萄糖苷元異黃酮轉化為苷元異黃酮，提高異黃酮生物效價[5-6]，因此發酵豆乳具有很好的開發前景。

現有的直投式發酵劑多是用于發酵牛奶，針對特定植物基酸奶發酵的較少，然而乳酸菌是影響發酵豆乳品質的重要因素，不同乳酸菌的生長和產酸活性、蛋白水解活性以及所產生的質構和風味特性有很大差異[7-11]。研究顯示，在常規酸奶發酵劑YC381中加入1株乳雙歧桿菌CCDM94后再進行豆漿發酵，最終產品中的各乳酸菌數量、乙醛以及異黃酮的含量均有所提升[12]。而POUDEL等[13]則通過實驗確定了在豆乳中進行發酵的最優菌種組合為嗜熱鏈球菌和副干酪乳桿菌。本文從現有的直投式發酵劑中分離出多種乳酸菌，分別研究它們在豆漿體系中進行單菌、混合菌發酵時的發酵特性，以及產品品質，以期進一步認識不同乳酸菌在豆漿中的發酵行為，為開發適合于豆漿發酵的菌種組合提供指導和依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗材料

直投式發酵劑A、B、C、D、E、F、G和H，表面有光澤、無霉變、顆粒飽滿的精選大豆，蔗糖、葡萄糖、檸檬酸鈉、K2HPO4，市售；采用無氧磨漿工藝制備的豆漿。

1.1.2 試劑

MRS固體培養基、MRS液體培養基、M17固體培養基、M17液體培養基，杭州百思生物技術有限公司；冰乙酸、三氯乙酸、β-巰基乙醇、鄰苯二甲醛、鄰苯二甲酸氫鉀、十二烷基硫酸鈉、四硼酸鈉、甲醇、NaOH、L-亮氨酸，均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司；2-甲基-3-庚酮標準物，西格瑪-奧德里齊公司。

1.2 儀器與設備

UV-2100紫外可見分光光度計，尤尼科上海有限公司；AB204-N型分析天平、PHS-3TC pH計，梅特勒-托利多儀器有限公司；2.5 L圓底立式厭氧培養袋，百思一基生物耗材店；高速離心機M16，湘儀離心機儀器有限公司；血球計數板，上海市求精生化試劑儀器有限公司；HH-S數顯恒溫水浴鍋，江蘇省金壇市醫療器械廠；SCIONSQ-456-GC氣質聯用儀，美國布魯克-道爾頓公司；FA25高速剪切乳化機，上海弗魯克流體機械制造有限公司；TA.XTPlus型質構儀，英國SMS公司；萃取頭(DVB/CA/PDMS-50/30 μm)，美國Supelco公司；實驗室自制磨漿系統。

1.3 實驗方法

1.3.1 乳酸菌的篩選

從直投式酸奶發酵劑中分離鑒定的26株乳酸菌中篩選出適合在豆漿體系中發酵的乳酸菌種。首先采用血球計數板進行乳酸菌計數，分別接種3×106CFU/g，發酵6 h，以發酵終點的pH、酸度為指標，從多種嗜熱鏈球菌中篩選出產酸較快的菌株。再將其他乳桿菌以及雙歧桿菌和嗜熱鏈球菌分別進行混合發酵，篩選出合適的乳酸菌。

1.3.2 乳酸菌的復配

經研究發現，嗜熱鏈球菌、發酵乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、副干酪乳桿菌、植物乳桿菌、保加利亞乳桿菌具有較好的發酵性能，其中保加利亞乳桿菌具有較強的蛋白水解活性，植物乳桿菌和鼠李糖乳桿菌具有良好的風味物質形成能力，副干酪乳桿菌和發酵乳桿菌產黏特性較好。故以嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌為基礎菌種，同時添加不同的產黏菌和產香菌進行多種菌的混合發酵實驗，并且和現有的直投式發酵劑作對比。

1.3.3 發酵豆乳工藝

豆漿→60 ℃預熱→調制→殺菌(95 ℃，5 min)→冷卻至42 ℃→接種→發酵至終點pH 4.5→冷藏→后熟→待用。

1.3.4 發酵性能測定

1.3.4.1 pH值的測定

用 PHS-3TC型高精密度pH計測定。

1.3.4.2 酸度的測定

根據國家標準GB 5009.239—2016中的第二法pH計法，取10 g樣品加入10 g煮沸后冷卻的水，再用0.1 mol/L NaOH溶液滴定至pH 8.30，記錄消耗的NaOH標準溶液的體積。酸度/°T=消耗的NaOH 溶液體積(mL)×10。

1.3.4.3 游離氨基含量的測定

采用鄰苯二甲醛(o-phthalaldehyde, OPA)法[14]。取3 g左右的豆漿樣品，定容至10 mL，然后取3 mL，加入5 mL 0.75 mol/L三氯乙酸溶液，混勻后靜置10 min，過濾，取濾液200 μL加入4 mL OPA試劑，室溫反應2 min后測定340 nm處吸光度。OPA試劑組成為：25 mL 10 mmol/L四硼酸鈉溶液，2.5 mL 20%十二烷基硫酸鈉，40 mg OPA(用1 mL甲醇溶解)和100 μL β-巰基乙醇。標曲制作采用的是梯度稀釋的L-亮氨酸溶液(0～2 mmol/L)。

1.3.4.4 活菌數的測定

參照譚允冰[15]的方法。用9 g/L的NaCl溶液梯度稀釋樣品，M17瓊脂培養基進行球菌活菌數計數，冰醋酸酸化的MRS瓊脂培養基(pH 5.4)進行桿菌活菌數計數，數據表示為CFU/g。

1.3.4.5 質構測定

1.3.4.6 風味成分分析

GC-MS條件：采用DB-WAX色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，升溫程序：起始溫度40 ℃，保持3 min；以6 ℃/min升溫至100 ℃；再以10 ℃/min升溫至230 ℃，保持7 min；不分流進樣。

質譜條件：離子源EI源，離子源溫度200 ℃，接口溫度250 ℃，電子能量70 eV，掃描范圍m/z33～350，采集方式為Scan。

樣品預處理方法：準確稱取15 g酸奶，加入少許16 g/L的NaCl溶液，轉移至容量瓶，定容至100 mL，并向其中加入20 μL的內標物(2-甲基-3-庚酮)，其質量濃度為32 μg/mL，搖勻，然后進行微剪切，再用移液管移取5 mL放置于萃取瓶中，放置在已經設定好溫度的60 ℃水浴鍋中。將老化的固相微萃取針插入樣品瓶，邊攪拌邊頂空吸附30 min。

1.4 數據分析

酸奶質構特性測試完成后，軟件Texture Expert Exceed可自動對數據進行存儲分析生成表格進行統計。采用Origin 9.1軟件得到乳酸菌在發酵豆漿過程中的pH和酸度隨時間的變化趨勢圖。并用SPSS 17.0對結果的顯著性進行分析。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌的篩選

嗜熱鏈球菌是酸奶發酵的常見菌種，其優良的產酸性能使其成為酸奶發酵的常用菌種。從表1可知，分離的9株嗜熱鏈球菌中，CG45-1產酸能力最強，發酵6 h后豆漿的pH、酸度和其他嗜熱鏈球菌相比存在顯著差異(P<0.05)。而對于蛋白水解活性而言，由于起始豆漿中L-亮氨酸含量為0.779 mg/g，故對所有的嗜熱鏈球菌而言，在發酵6 h后其蛋白水解度均低于起始值，說明嗜熱鏈球菌在豆漿中生長，其蛋白水解能力要低于其對小肽和氨基酸的消耗能力。

表1 不同嗜熱鏈球菌的發酵性能Table 1 Fermentation performance of different S.thermophilus strains

以CG45-1為基礎菌種，分別和5株保加利亞乳桿菌、3株嗜酸乳桿菌和2株副干酪乳桿菌進行混合菌發酵，依據pH和酸度變化分別從同一屬的乳桿菌中挑選出產酸較快的乳酸菌。從圖1和圖2可知，保加利亞乳桿菌CG45-2、CG90-2和CG45-1組合發酵時發酵速率增加，達到pH 4.5的時間比嗜熱鏈球菌單菌發酵縮短1 h，而另外3株保加利亞乳桿菌對于嗜熱鏈球菌的發酵速率并無影響。圖3和圖4表明，3株嗜酸乳桿菌CGSS、CG27-3和CG3K-3中，CG3K-3與CG45-1的組合發酵速率最快，而2株副干酪乳桿菌CG3K-2和CG31與CG45-1組合發酵速率較為一致，較優于CG45-1單菌發酵，同時在終點處的酸度比單菌發酵高出7～10°T。

圖1 嗜熱鏈球菌與不同保加利亞乳桿菌組合 發酵時的pH變化Fig.1 Changes in pH of S.thermophilus and different L.bulgaricus strains during fermentation

圖2 嗜熱鏈球菌與不同保加利亞乳桿菌組合 發酵時的酸度變化Fig.2 Changes in acidity of S.thermophilus and different L.bulgaricus strains during fermentation

圖3 嗜熱鏈球菌與不同嗜酸乳桿菌和副干酪乳桿菌 組合發酵時的pH變化Fig.3 Changes in pH of S.thermophilus and different L.acidophilus and L.paracasei strains during fermentation

圖4 嗜熱鏈球菌與不同嗜酸乳桿菌和副干酪乳桿菌 組合發酵時的酸度變化Fig.4 Changes in acidity of S.thermophilus and different L.acidophilus and L.paracasei strains during fermentation

2.1.1 風味成分

經過初步篩選后，分別選擇CG90-2、CG45-2、CG3K-3以及CG3K-2和CG31做進一步的篩選，同時和其他乳桿菌包括鼠李糖乳桿菌CGS、發酵乳桿菌CGF、瑞氏乳桿菌CG3K-4、植物乳桿菌CG47-2、乳雙歧桿菌CGR、長雙歧桿菌CGC作對比，菌種組合列舉在表2中。表3給出了CG45-1和其他乳桿菌分別進行混合菌發酵時，發酵豆乳中的風味物質種類及含量。

1.由原來的全過程審批轉向只對關鍵環節審批。此前，各級監管部門對政府采購各環節采用審批制管理，從采購計劃到招標公告、招標文件、變更公告、中標(成交)公告、變更采購方式等每個環節都要審批。目前，除個別環節外，基本上采用備案制管理，將權力和責任交給了采購人和采購代理機構。

表2 菌種組合列表Table 2 List of strains combination

表3 以不同乳酸菌組合制備的發酵豆乳的風味成分 單位：mg/kg

酸奶的風味主要是由體系中的揮發性酸、非揮發性酸、羰基化合物、低級醇等構成，其中以羰基化合物為主[16-18]，由表3可以看出，嗜熱鏈球菌和鼠李糖乳桿菌混合發酵時酮類風味物質2，3-丁二酮含量最高，其次是植物乳桿菌和另外2株副干酪乳桿菌，并且與植物乳桿菌混合發酵時3-羥基-2-丁酮含量最高。另外發酵豆乳的風味還受到豆漿本身所存在的一些風味成分的影響，特別是己醛，它是最具有典型豆腥味的風味成分，而且閾值低[19]，植物乳桿菌和鼠李糖乳桿菌在發酵終點的己醛含量均很低。因此從揮發性風味成分分析，鼠李糖乳桿菌和植物乳桿菌是較為突出的豆乳發酵乳酸菌。

2.1.2 游離氨基含量

由表4可見，所有的菌種組合中，CG45-1和CG90-2的組合發酵終點游離氨基含量最高，與其他菌種組合之間存在顯著差異(P<0.05)。其余的組合在發酵終點時的游離氨基含量均較低，說明了多數乳桿菌對于大豆蛋白的水解利用有限。

表4不同乳酸菌組合制備的發酵豆乳中的游離氨基含量 單位：mg/g(以亮氨酸計)

2.1.3 質構特性

不同乳酸菌組合發酵的產品質構參數如表5所示。CGF、CG3K-2在和CG45-1組合發酵豆漿時，產品的質構特性較好。但是與牛奶發酵相比，質構參數值較低，劉文文等[20]研究不同菌種組合發酵時，酸奶硬度值范圍是110～141 g。這可能和牛奶中脂肪含量較高有關。解冰心[21]的研究發現，添加3.5%不同植物油時，酸奶的硬度值是187～273 g。

表5不同乳酸菌組合制備的發酵豆乳的質構參數Table 5 Texture parameters of fermented soy milk prepared by combinations of different lactic acid bacteria

2.1.4 乳酸菌活菌數

發酵終點乳酸菌活菌數如圖5所示。和不同乳酸菌組合發酵時CG45-1的生長情況不同，在和CG3K-2和CGS組合發酵時生長較好，與其他組合之間存在顯著性差異(P<0.05)，發酵終點的活菌數均高于2.9×108CFU/g。而對于乳桿菌及雙歧桿菌而言，在發酵終點時的活菌數均低于嗜熱鏈球菌，其中CGS生長較快，活菌數達2.82×108CFU/g，其次是CG90-2和CG3K-2，與其他乳桿菌活菌數均存在顯著性差異(P<0.05)。

圖5 不同菌種組合發酵終點時的乳酸菌數Fig.5 The number of lactic acid bacteria at the end of fermentation by different strain combinations

HATI等[22]的研究發現，嗜熱鏈球菌發酵豆漿6 h后，活菌數約為3×108CFU/g，而鼠李糖乳桿菌約為2.0×107CFU/g。

2.2 發酵豆乳品質對比

優選菌種組合12(CG45-1+CG90-2+CGS+CG47-2+CGF+CG3K-2)和8種直投式發酵劑的發酵產品特性比較結果如表6和表7。組合12混合發酵產品的酸度和游離氨基含量顯著高于8種直投式發酵(P<0.05)。對于乳酸菌數而言，組合12混合發酵和直投式發酵劑E無顯著性差異，均顯著高于其他直投式發酵劑。但在硬度方面，組合12混合發酵的產品不如直投式發酵劑B、C、D、E、F和H與A、G無顯著性差異(P<0.05)，這可能和蛋白水解情況有關，如于茜[23]研究發現大豆蛋白經堿性蛋白酶水解過后，發酵豆乳的稠度系數明顯下降。楊媚[24]的實驗結果也相似，通過大豆萌發，使得大豆球蛋白逐漸被降解，隨著發芽時間的延長，硬度和黏附性均不斷下降。從風味成分分析來看，主要風味物質均為2，3-丁二酮，組合12制備的發酵豆乳中其含量比發酵劑B低，而高于其他7種發酵劑，同時異味成分己醛比8種直投式發酵劑制備的發酵豆乳低。

表6 自選菌種混合發酵和直投式發酵劑發酵特性比較Table 6 Comparison of fermentation characteristics between optimized strains and direct vat set starters

表7 優選菌種和直投式發酵劑制備的發酵豆乳中揮發性風味成分 單位：mg/kg

3 結論與討論

為開發適合豆漿體系發酵的乳酸菌種，以pH、酸度、風味成分、質構特性和活菌數為評價指標，從26株直投式發酵劑中分離鑒定的乳酸菌中篩選出6株具有較強發酵性能、食用安全的菌種，包括嗜熱鏈球菌CG45-1、保加利亞乳桿菌CG90-2、副干酪乳桿菌CG3K-2發酵乳桿菌CGF、鼠李糖乳桿菌CGS和植物乳桿菌CG47-2。這些菌分別具有較強的產酸速率、較高的蛋白水解活性、優良的質構特性以及較好的風味物質形成能力，可以利用這些菌種來開發適合豆漿體系發酵的直投式發酵劑。

發酵豆乳中風味成分主要為2，3-丁二酮，乙醛含量很低，需要進一步研究發酵豆乳中的風味物質形成機制，以便更好地調控這2種主要風味物質的含量及比例。同時本文是在固定配方的條件下進行不同乳酸菌在豆漿中的發酵特性研究并挑選合適的乳酸菌，其他不適合在豆漿中生長的乳酸菌可能需要通過發酵配方的研究來改變它們在豆漿中的發酵特性，從而改善產品的發酵性能。