米漿發(fā)酵過程中的微生物群落變化

謝玲，蘭林，李宇航，錢葉遷，石崇勇，袁平，任元元，李玉鋒*

1(西華大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，四川 成都，611730)2(樂山闕記食品有限公司，四川 樂山，614000) 3(四川省食品發(fā)酵工業(yè)研究設(shè)計(jì)院，四川 成都，611130)

大米，是稻谷經(jīng)過清理、礱谷、碾米、成品整理等工序后制成的成品[1]。當(dāng)今世界的大米加工工藝已經(jīng)比較成熟[2]，制品的品質(zhì)是關(guān)系消費(fèi)者需求的主要因素，目前已將研究重點(diǎn)轉(zhuǎn)移至稻米的深加工和綜合利用上。為滿足消費(fèi)者對(duì)食品提出的安全、營(yíng)養(yǎng)、保健的等方面的要求，需不斷開發(fā)新的大米產(chǎn)品[3]。大米經(jīng)過清洗、浸泡、磨漿、發(fā)酵等工序后，可加工成大米乳酸飲料、米發(fā)糕、米酒等制品。米漿發(fā)酵作為中國(guó)傳統(tǒng)米制品加工的重要工序，經(jīng)過此加工過程，微生物群落組成復(fù)雜多樣，且易滋生雜菌，導(dǎo)致發(fā)酵不易控制，從而出現(xiàn)質(zhì)量問題及安全隱患[4]。現(xiàn)有研究多集中在發(fā)酵米制品的加工工藝及食味品質(zhì)，對(duì)米漿發(fā)酵過程中微生物群落變化的研究較少。研究米漿發(fā)酵體系的微生物群落結(jié)構(gòu)對(duì)改善發(fā)酵米制品品質(zhì)及風(fēng)味具有重要的作用[5]。

高通量測(cè)序是20世紀(jì)70年代由FREDERICK發(fā)明的雙脫氧鏈終止法核酸測(cè)序技術(shù)。近年來被廣泛應(yīng)用于食醋、白酒、泡菜、豆豉等發(fā)酵過程中微生物群落的測(cè)定[6-7]，該技術(shù)能快速、準(zhǔn)確地對(duì)發(fā)酵食品的微生物組成及其豐度變化進(jìn)行多方位的研究，在食品微生物快速檢測(cè)中有著重要的應(yīng)用前景[8-9]。本研究基于高通量測(cè)序技術(shù)，探究傳統(tǒng)自然發(fā)酵過程中不同發(fā)酵階段的微生物生長(zhǎng)變化規(guī)律，為后續(xù)復(fù)合菌劑的制備和米制品質(zhì)量控制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新米漿、老漿，樂山闕記食品有限公司；Qubit3.0 DNA檢測(cè)試劑盒(Q10212)，Life；E.A.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit(M5635-02)，美國(guó)OMEGA公司；2×Hieff? Robust PCR Master Mix(10105ES03)、Hieff NGSTMDNA Selection Beads(2601ES56)，翌圣(Yeasen)生物科技(上海)股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Pico-21臺(tái)式離心機(jī)，Thermo Fisher；GL-88B旋渦混合器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；TND03-H-H混勻型干式恒溫器，深圳拓能達(dá)科技有限公司；DYY-6C電泳儀電源、DYCZ-21電泳槽，北京市六一儀器廠；FR-1000凝膠成像系統(tǒng)，上海復(fù)日科技有限公司；Q32866 Qubit?3.0熒光計(jì)，Invitrogen；ETC 811 PCR儀，北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司；Research plus 0.5～10 μL移液器，Eppendorf。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品預(yù)處理

參照傳統(tǒng)自然發(fā)酵法，將100 g新米漿中接入10 g老漿[m(老漿)∶m(新米漿)=1∶10]，密封后在16～20 ℃發(fā)酵40 h，分別在0、8、16、24、32、40 h取樣10 g，并將細(xì)菌分別標(biāo)號(hào)為(A0-bac)～(A5-bac)，真菌分別標(biāo)號(hào)為(A0-fun)～(A5-fun)。

參照文獻(xiàn)[10-11]的方法，將每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的米漿樣品各取5 g，加入20 mL磷酸緩沖鹽溶液(PBS)(0.137 mol/L NaCl，0.002 7 mol/L KCl，0.01 mol/L Na2HPO4，0.002 mol/L KH2PO4，pH 7.0)懸浮，并加入0.5 g玻璃珠后充分渦旋5 min。在4 ℃離心機(jī)中2 000 r/min離心5 min，收集上清液。將沉淀用PBS洗滌2次并收集上清液。將所有上清液于4 ℃，10 000 r/min離心10 min棄去上清液，收集沉淀。收集的沉淀用1 mL的PBS重懸，轉(zhuǎn)入1.5 mL的EP管中，-20 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 總DNA提取

參考李榮源等[10]的方法，對(duì)樣品進(jìn)行處理后，使用DNA抽提試劑盒(OMEGA，美國(guó))進(jìn)行DNA提取，步驟嚴(yán)格參照DNA抽提試劑盒說明書，并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取質(zhì)量。

1.3.3 PCR擴(kuò)增及高通量測(cè)序

參考高乾坤等[12]的方法，以檢驗(yàn)合格的細(xì)菌基因組為模板，引物針對(duì)16S rRNA基因V3/V4區(qū)合成特異引物，Nobar_341F(CCTACGGGNGGCWGCAG)，Nobar_805R(GACTACHVGGGTATCTAATCC)。以提取的總真菌的基因組為模板，引物針對(duì)16S rRNA基因ITS1-ITS2區(qū)合成特異引物，ITS1:(CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA)，ITS2：(GCTGCGTTCTTCATCGATGC)。根據(jù)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物濃度進(jìn)行等濃度混樣，使用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)效果。將合格的樣品送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行Illumina MiSeq高通量測(cè)序。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用Usearch軟件將最終優(yōu)化數(shù)據(jù)在97%相似度水平下進(jìn)行運(yùn)算分類單位(operational taxonomic unit,OTU)聚類分析；基于OTU聚類分析結(jié)果，利用Mothur軟件對(duì)α多樣性指數(shù)進(jìn)行分析；基于分類學(xué)信息，利用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)各分類水平進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計(jì)分析；利用方差分解將數(shù)據(jù)差異反映在二維坐標(biāo)上繪制主成分分析圖。作圖軟件使用R軟件和origin 8.0。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌多樣性分析

2.1.1 細(xì)菌OTU聚類分析

為研究各樣本間的微生物組成，以97%的相似度水平對(duì)所有樣本的有效序列進(jìn)行OTUs聚類分析并進(jìn)行物種注釋。16S rRNA的V4區(qū)間經(jīng)過濾和雙端拼接后共得到383 814條有效序列，聚類得到447個(gè)OTU。Venn圖可以顯示所有樣本共有OTU和特有OTU的數(shù)目，為直觀顯示樣品OTU組成數(shù)目的相似性及重疊性，對(duì)米漿發(fā)酵過程各時(shí)間點(diǎn)的細(xì)菌的OTU進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果如圖1所示。米漿整個(gè)發(fā)酵過程中細(xì)菌共有的OTU數(shù)為16個(gè)。發(fā)酵初期樣品中特有OTU數(shù)為15個(gè)，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，在32 h時(shí)特有OTU數(shù)目為1個(gè)，其他時(shí)間點(diǎn)均為0個(gè)，證明在環(huán)境中獲得的細(xì)菌數(shù)量少。將每個(gè)OTU與細(xì)菌分類學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)比后得到其物種注釋，共2個(gè)門，8個(gè)屬水平的細(xì)菌。結(jié)果表明，自然發(fā)酵過程與老漿細(xì)菌種類相似，證明發(fā)酵過程感染的細(xì)菌量少，與孟燕華[13]的研究結(jié)果一致。

圖1 不同發(fā)酵階段細(xì)菌OTU數(shù)Fig.1 Number of bacterial OTU in different stages of fermentation

2.1.2 細(xì)菌α多樣性分析

α多樣性分析能反映微生物群落的豐度和多樣性，利用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析指數(shù)(P<0.05)估計(jì)群落的物種豐度和多樣性。Chao指數(shù)體現(xiàn)群落豐度，其值越大表明群落豐富度越大。OTUs體現(xiàn)物種的豐富度，ACE指數(shù)用于估計(jì)群落中OTU數(shù)目的指數(shù)。Shannon和Simpson指數(shù)都能體現(xiàn)群落多樣性，Shannon值越大，Simpson值越小，群落多樣性越高。Shannoneven是反映物種個(gè)體數(shù)目在群落中分配的均勻程度的指數(shù)。由表1可知，在整個(gè)發(fā)酵過程中，OTUs、Chao和Ace指數(shù)在0～16 h時(shí)增加，然后減少至32 h后再增加，物種豐富度和多樣性在16 h最高，32 h最低。覆蓋率均在99.94%～99.99%，證明樣本中的細(xì)菌幾乎都被檢測(cè)到，該數(shù)據(jù)可靠。

表1 樣品中細(xì)菌α多樣性指數(shù)測(cè)定結(jié)果Table 1 α-Diversity of bacteria in samples

2.1.3 細(xì)菌物種組成分析

2.1.3.1 門水平米漿發(fā)酵過程群落結(jié)構(gòu)分析

米漿發(fā)酵體系中共檢測(cè)出2個(gè)門的細(xì)菌(圖2)，在發(fā)酵初期厚壁菌門(Firmicutes)占全部細(xì)菌群落的89.22%，螺旋菌門(Spirochaetota)占10.33%，其他物種占0.46%。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，厚壁菌門的豐度增加至99.40%，螺旋菌門的豐度降低至0.05%。5組樣品中厚壁菌門的豐度均最高，可見厚壁菌門是米漿發(fā)酵體系的優(yōu)勢(shì)微生物。厚壁菌門是半固態(tài)發(fā)酵食品中的重要微生物，如乳制品、酒類、醬油等[14],這與本研究結(jié)果一致。

圖2 門水平細(xì)菌相對(duì)豐度Fig.2 Relative abundance of bacteria at phylum level

2.1.3.2 屬水平米漿發(fā)酵過程群落結(jié)構(gòu)分析

米漿發(fā)酵體系共檢測(cè)出8個(gè)屬的細(xì)菌，其他物種合并為Other(圖3)。由圖3可知，屬水平上發(fā)酵體系的細(xì)菌主要有乳桿菌屬，短螺旋體屬(Brachyspira)、芽孢桿菌屬(Bacillus)和需鹽芽孢桿菌屬(Virgibacillus)。發(fā)酵初期，乳桿菌屬的相對(duì)豐度為84.46%，短螺旋體屬的豐度為10.33%，芽孢桿菌屬的豐度為5.05%。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，乳桿菌屬的豐度逐漸增加至97.09%，短螺旋體屬的豐度逐漸降低至0.02%，芽孢桿菌屬的豐度逐漸降低至0.59%。芽孢桿菌是廣泛存在于環(huán)境中的腐生菌，多屬于需氧或兼性厭氧菌。楊磊等[15]在濃香型酒醅中分離得到1株地衣芽孢桿菌。鄧岳等[16]發(fā)現(xiàn)在傳統(tǒng)工藝釀造的醬油中分離得到的芽孢桿菌是酸類、酮類、含硫類、吡嗪類等低閾值化合物合成的重要微生物。大多數(shù)乳酸菌能在低氧發(fā)酵過程中利用糖類產(chǎn)生乳酸結(jié)合乙醇后形成乳酸乙酯，可為發(fā)酵體系提供特殊的風(fēng)味物質(zhì)并降低發(fā)酵體系的pH值，所產(chǎn)生的乳酸菌素能抑制雜菌生長(zhǎng)。故乳酸菌在保證產(chǎn)品風(fēng)味和品質(zhì)方面起著極其重要的作用，這與李美倫等[17]的研究結(jié)果一致。

圖3 屬水平細(xì)菌相對(duì)豐度Fig.3 Relative abundance of bacteria at the genus level

2.1.3.3 屬水平米漿發(fā)酵過程微生物群落主成分分析

主成分分析可找出數(shù)據(jù)中最主要的元素和結(jié)構(gòu)。X軸和Y軸代表選定的主成分軸，圖中不同顏色的點(diǎn)代表不同樣本來源，各點(diǎn)間的距離代表相似程度，越近相似度越高。由圖4可知，各樣本間有明顯差異。A0-bac在坐標(biāo)軸左側(cè)上方且與其他5個(gè)樣本的距離較遠(yuǎn)，表明剛接入老漿時(shí)細(xì)菌多樣性與后續(xù)發(fā)酵過程差異較大。A1-bac至A5-bac這5個(gè)樣品均在坐標(biāo)軸右側(cè)且距離相對(duì)較近，表明環(huán)境中的細(xì)菌變化較小，這與高赟[18]的研究結(jié)果相似。

圖4 屬水平細(xì)菌主成分分析Fig.4 PCA of bacteria at genus level

2.2 真菌多樣性分析

2.2.1 真菌OTU聚類分析

真菌的ITS1經(jīng)過濾和雙端拼接后共得到433 198條有效序列，聚類得到870個(gè)OTU。對(duì)米漿發(fā)酵過程各時(shí)間點(diǎn)的細(xì)菌OTU進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果如圖5所示。真菌的共有OTU數(shù)目37個(gè)。發(fā)酵初期特有OTU數(shù)為27個(gè)，在第8 h減少至8個(gè)，在第16 h又增加至13個(gè)，發(fā)酵終點(diǎn)時(shí)特有OTU數(shù)為8個(gè)。證明從環(huán)境中獲得一定數(shù)量的真菌。將每個(gè)OTU與細(xì)菌分類學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)比后得到其物種注釋，共2個(gè)門，9個(gè)屬水平的真菌。結(jié)果表明，在整個(gè)發(fā)酵過程中，由于乳酸菌產(chǎn)酸導(dǎo)致部分真菌不適應(yīng)低pH環(huán)境，故生長(zhǎng)被抑制，這與文獻(xiàn)[19-20]的研究結(jié)果一致。

2.2.2 真菌α多樣性分

真菌α多樣性如表2所示。在米漿發(fā)酵全過程40 h中，OTUs、Chao和Ace指數(shù)在發(fā)酵初期開始增加至第8 h，然后降低并在發(fā)酵后期略有升高。Shannon和Simpson指數(shù)分別在40 h時(shí)達(dá)到最大和最小，說明在發(fā)酵終點(diǎn)真菌多樣性最高，即此時(shí)真菌豐度最高，這與古明亮等[21]的研究結(jié)果一致。

圖5 不同發(fā)酵階段真菌OTU數(shù)Fig.5 Number of fungal OTU in different stages of fermentation

表2 樣品真菌α多樣性指數(shù)測(cè)定結(jié)果Table 2 α-Diversity of fungal in samples

2.2.3 真菌物種組成分析

2.2.3.1 門水平米漿發(fā)酵過程群落結(jié)構(gòu)分析

米漿發(fā)酵體系中共檢測(cè)出2個(gè)門的真菌，分別為子囊菌門(Ascomycota)和擔(dān)子菌門(Basidiomycota)。子囊菌門在發(fā)酵體系占主導(dǎo)地位，在發(fā)酵初期其相對(duì)豐度占真菌群落的98.48%，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)其含量幾乎無變化，證明其在發(fā)酵過程中起重要的作用，為體系的主要優(yōu)勢(shì)菌。擔(dān)子菌門的豐度在整個(gè)發(fā)酵過程中都低于1.5%，作為真菌中最高等的門類，多數(shù)為大型真菌，故在米漿發(fā)酵體系的作用不大且不易生長(zhǎng)，此結(jié)果與張文齊等[22]的研究結(jié)果相似。

圖6 門水平真菌相對(duì)豐度Fig.6 Relative abundance of fungi at the phylum level

2.2.3.2 屬水平米漿發(fā)酵過程群落結(jié)構(gòu)分析

米漿發(fā)酵體系中共檢測(cè)出9個(gè)屬的真菌。由圖7可知，米漿發(fā)酵體系主要有哈薩克斯坦酵母屬(Kazachstania)、雙足囊菌屬(Dipodascus)、釀酒酵母菌屬(Saccharomyces)、假絲酵母屬(Candida)、伊薩酵母屬(Issatchenkia)、木克拉酵母屬(Mrakia)、曲霉屬(Aspergillus)、絲孢酵母屬(Trichosporon)。哈薩克斯坦酵母屬在發(fā)酵初期豐度為73.49%，8 h豐度達(dá)到86.86%然后開始減小，至發(fā)酵終點(diǎn)豐度為46.87%，為發(fā)酵體系的主要優(yōu)勢(shì)菌。哈薩克斯坦酵母屬參與發(fā)酵體系乙酸乙酯、β-苯乙醇、異戊醇等香氣物質(zhì)的產(chǎn)生，并能利用糖類產(chǎn)生乙醇和CO2，使米漿漿體變得多孔蓬松并獲得特殊風(fēng)味，提升了產(chǎn)品的口感和風(fēng)味[23]，這與王雪山[24]的研究結(jié)果一致。

2.3.3.3 屬水平米漿發(fā)酵過程群落主成分分析

由圖8可知，各樣本間有明顯差異。A0-fun在坐標(biāo)軸左上側(cè)且與其他5個(gè)樣本距離較遠(yuǎn)，表明剛接入老漿時(shí)真菌多樣性較大，A3-fun和A4-fun的距離較近，表明在發(fā)酵24～32 h時(shí)真菌的多樣性達(dá)到相對(duì)穩(wěn)定，其多樣性差異不明顯。A1-fun至A5-fun這5個(gè)樣品的差異較明顯，表明環(huán)境中的真菌變化較大，這與方冠宇[25]的研究結(jié)果相似。

圖7 屬水平真菌相對(duì)豐度Fig.7 Relative abundance of fungi at genus level

圖8 屬水平真菌主成分分析Fig.8 PCA of fungi at genus level

3 結(jié)論

本研究采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)米漿不同發(fā)酵時(shí)間微生物多樣性進(jìn)行分析。研究發(fā)現(xiàn)，在門水平上，厚壁菌門和子囊菌門為發(fā)酵體系主要優(yōu)勢(shì)菌門。在屬水平上，乳桿菌屬、哈薩克斯坦酵母屬、雙足囊菌屬和釀酒酵母屬為發(fā)酵體系主要優(yōu)勢(shì)菌屬，這些優(yōu)勢(shì)菌主要影響著發(fā)酵體系特殊風(fēng)味物質(zhì)的生成和發(fā)酵米制品的品質(zhì)。高通量測(cè)序技術(shù)能分析各時(shí)間點(diǎn)的微生物組成及豐度變化規(guī)律，為發(fā)酵米制品的生產(chǎn)提供了一定的理論依據(jù)。