一株產纖維素酶枯草芽孢桿菌的麩曲制作及其產酶特性研究

鄭自強 衛春會 鄧 杰 黃治國 仲濟宇 任志強

(1.四川輕化工大學生物工程學院，四川 宜賓 644000；2.四川輕化工大學生釀酒生物技術及應用四川省重點實驗室，四川 宜賓 644000)

纖維素在動植物中普遍存在，被稱為最豐富的可再生能源之一，廣泛應用于醫藥、食品、棉紡、環保行業，具有遠大的經濟開發前景[1]。纖維素資源的利用經常需要進行降解處理，主要分為物理降解法、化學降解法和生物降解法，生物降解法因其綠色和低能耗的優點備受青睞，而生物降解法一般是通過利用產纖維素酶的微生物來實現的[2]。纖維素酶是由細菌、真菌等微生物產生的能夠將纖維素降解成可發酵性糖的一系列酶類的總稱，主要由內切β-葡聚糖酶、外切β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶3種酶構成，3種酶類的協同作用才能更好地將纖維素酶解[3]。能夠同時產內切β-葡聚糖酶、外切β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶菌株的酶系較為復雜，目前從自然界中篩選出的產纖維素酶菌株存在分解纖維素的酶解效率低，應用于實踐生產難的局限性[4]。

選育性能良好的產纖維素酶菌株是利用纖維素的基礎。楊偉平等[5]分離出一株能高效降解纖維素的細菌，鑒定為甲基營養型芽孢桿菌；黃玉蘭等[6]從土壤中篩選出一株纖維素酶高產菌株XW-1，其最佳的產酶條件下的酶活性為15.60 U/mL；胡麗娟等[7]篩選出一株高產纖維素酶的突變株Y-9，經工藝優化后的酶活性可達28.62 U/mL。以往的研究大多只以羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)為底物測定內切β-葡聚糖酶活力作為菌株纖維素酶活力參考，而少有對纖維素酶3種酶的酶活特性進行綜合探討，且對于纖維素生物降解的應用多采用直接接種的方式，造成酶生成量少、酶穩定性差、酶作用效率低等問題，無法滿足現階段工業上的應用需求。

鑒于目前的研究現狀，在不降低產纖維素酶菌株的產酶特性條件下擴培菌種以及提高酶的穩定性變得尤為重要，產纖維素酶菌株的大規模應用首先需要擴大培養，制備麩曲是白酒行業比較常見的生產用菌擴培方式。麩曲一般以麩皮為原料，經處理后接種微生物培養產酶，工業上常通過制備麩曲的方式對純種微生物進行擴培，提高經濟效益[7]。研究擬以一株產纖維素3種酶齊全、酶活性高的枯草芽孢桿菌——XWS-A[8]為出發菌株制作細菌麩曲，利用Design-Expert 8.0.6軟件設計試驗優化工藝擴大菌種，并對成品麩曲的內切β-葡聚糖酶、外切β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶的活力進行測定，以期改善菌種應用價值，提高資源利用率，為開發利用纖維素資源提供一條新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

XWS-A菌種：釀酒生物技術及應用四川省重點實驗室；

麩皮：市售；

羧甲基纖維素鈉：淄博海瀾化工有限公司；

微晶纖維素：河南德鑫化工實業有限公司；

水楊苷：上海源葉生物科技有限公司；

纖維素酶、(NH4)2SO4、KH2PO4、DNS試劑：分析純，成都市科龍化工試劑廠。

1.2 儀器及設備

電子天平：CP214型，奧豪斯儀器有限公司；

紫外可見分光光度計：UV-1200型，翱藝儀器上海有限公司；

高速冷凍離心機：5430R型，德國Eppendorf公司。

1.3 培養基

羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)培養基：羧甲基纖維素鈉10 g/L，(NH4)2SO44 g/L，NaCl 1.25 g/L，KH2PO41.0 g/L，MgSO40.5 g/L，瓊脂粉18 g/L，pH 7.0；

LB培養基：蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，瓊脂粉18 g/L，pH 7.0。

1.4 試驗方法

1.4.1 麩曲枯草芽孢桿菌生物量測定 取10 g樣品(麩曲)加入90 mL無菌水，作為10-1濃度，采用LB培養基稀釋涂布計數[9]。

1.4.2 麩曲工藝流程

1.4.3 枯草芽孢桿菌麩曲制作單因素試驗 以芽孢桿菌生物量為指標，在前期預試驗的基礎上，確定原料采用全麩皮，固定培養時間為60 h，分別考察不同接種量(1%，3%，5%，7%，9%，11%)、培養溫度(30，35，40，45，50，55，60 ℃)和含水量(30%，35%，40%，45%，50%，55%，60%)對麩曲中XWS-A菌株生物量的影響。

1.4.4 枯草芽孢桿菌麩曲制作的響應面優化 根據單因素結果，運用Design-Export 8.0.6軟件設計試驗Box-Behnken中心組合，以芽孢桿菌生物量為響應值，選取接種量、培養溫度和含水量為試驗因素，確定強化麩曲的工藝最優點[11]。

1.4.5 麩曲纖維素酶活力的測定

(1)標準曲線繪制：分別在比色管中加入1.0 g/L的葡萄糖標準溶液0.0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL，各管分別補離子水至1 mL，再分別加入1.5 mL DNS試劑，沸水浴5 min，冷卻后稀釋至刻度線(25 mL)，以不加葡萄糖標準溶液為空白，540 nm處測定吸光值。

(2)纖維素酶活力檢測(DNS法)：分別在比色管中加入0.5 mg/mL酶液0.1 mL和質量分數為1%緩沖液0.9 mL(內切β-葡聚糖酶活力測定采用羧甲基纖維素鈉檸檬酸緩沖液；外切β-葡聚糖酶測定采用微晶纖維素檸檬酸緩沖液；β-葡萄糖苷酶測定采用水楊苷檸檬酸緩沖液)，調節pH，一定溫度條件下水浴10 min，加入1.5 mL DNS溶液終止反應，沸水浴5 min，冷卻后稀釋至刻度線(25 mL)，以先加入DNS溶液，后加入緩沖溶液和酶液作為空白，540 nm處測定吸光值[12]。

(3)纖維素酶活力的定義：在37 ℃，pH 5.5的條件下，每分鐘從質量濃度為4 mg/mL 的羧甲基纖維素鈉溶液中降解釋放1 μmol還原糖所需要的酶量為一個酶活力單位U，每1 min水解產生1 μ/g還原糖(以葡萄糖計)所需的酶量為一個酶活力單位(U/g)[13]。

以上試驗均測定3次，結果取平均值，并做3次重復。

1.5 數據處理

使用Design-Export 8.0.6軟件進行響應面設計、方差分析及模型預測，采用SPSS 22.0數據分析軟件對試驗結果進行多重比較和顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

由圖1可知，最佳接種量為7%，最佳培養溫度為45 ℃，最佳含水量為45%，并以此結果為基礎設計響應面水平中心點。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.2 Box-Behnken響應面試驗

Box-Behnken響應面設計各因素及水平見表1，試驗設計及結果見表2。

表1 Box-Behnken響應面設計各因素及水平

表2 Box-Behnken響應面設計及結果

對結果進行二次多元分析，得到擬合評分結果的二次多元的編碼方程為：

Y=4.44+0.15A+0.18B+0.17C-0.025AB-0.13AC-0.075BC-0.28A2-0.28B2-0.23C2。

(1)

圖2 預測對應關系圖

表3 中心組合的回歸方程方差分析

由圖3可知，接種量與培養溫度、接種量與含水量、培養溫度與含水量的交互圖均呈橢圓形，3D立體圖存在極點值，說明各因素之間交互作用顯著，各因素交互作用對麩曲生物量結果有較大影響。模型分析預測的最大值為4.5，對應的實際值為A=7.4，B=46.3，C=46.4。考慮到試驗操作的方便性，將結果修正為A=7.5，B=46，C=46，即模型預測的最佳工藝為：接種量7.5%，培養溫度46 ℃，含水量46%。

圖3 交互作用響應分析圖

為驗證響應面設計結果的可靠性，在最佳工藝參數條件下即控制接種量7.5%，培養溫度46 ℃，含水量46%，進行多次驗證實驗，結果表明，此條件下的成品曲生物量結果為(4.5±0.3)×1011CFU/g，與預測結果4.5×1011CFU/g接近，證明該響應面模型理想，參數組合穩定可靠。

2.3 pH及反應溫度對枯草芽孢桿菌麩曲纖維素酶活性的影響

通過Box-Behnken響應設計優化制曲工藝，成功對枯草芽孢桿菌XWS-A進行擴培，而纖維素酶的測定沒有具體的標準，甚至同一種測定方法中，處理條件的差異對酶活的測定結果也會產生較大影響[16-17]，考慮到纖維素酶的酶學性質，試驗測定在不同pH及反應溫度條件下枯草芽孢桿菌XWS-A麩曲的酶活，結果見圖4。

由圖4可知，內切β-葡聚糖酶、外切β-葡聚糖酶與β-葡萄糖苷酶在pH為5.0時，酶活力達到最大值，分別為(2 420±70)，(15±1)，(19±1)U/g；酶是蛋白質，高溫會使蛋白質失活，內切β-葡聚糖酶活性在55 ℃時酶活力達到最大值(2 510±70)U/g；外切β-葡聚糖酶活性在55 ℃時酶活力達到最大值(15±2)U/g；β-葡萄糖苷酶活性在60 ℃時酶活力達到最大值(30±3)U/g。綜合上述結果，確定試驗成品曲纖維素酶的酶活測定應控制pH為5.0，內切β-葡聚糖酶、外切β-葡聚糖酶的反應溫度為55 ℃，β-葡萄糖苷酶的反應溫度為60 ℃。

圖4 不同處理條件對纖維素酶活測定的影響

3 結論

以XWS-A為出發菌株制作麩曲，通過響應面設計優化制曲工藝，并對成品曲的產酶特性進行了研究。其最佳工藝為：控制接種量7.5%，培養溫度46 ℃，含水量46%。該條件下XWS-A獲得了有效的增殖，其成品曲的生物量達到了(4.5±0.3)×1011CFU/g，實現了XWS-A的擴培。

不同測定條件下內切β-葡聚糖酶、外切β-葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶的活性皆有較大差異，在最佳測定條件下內切β-葡聚糖酶活力為(2 510±70)U/g，外切β-葡聚糖酶的活力為(15±2)U/g，β-葡萄糖苷酶的活力為(30±3)U/g。

但研究還存在部分待解決的問題，如尚未大量開展中試及實際工業生產試驗，缺乏對纖維素資源的多種途徑開發的實際生產數據，下一步將計劃從食品、環保、造紙等方向解決此問題，以進一步完備理論支撐依據。