甜橙來源法尼烯合成酶的異源表達及酶學性質研究

付聞文，王均華，李由然，石貴陽*

1(糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室(江南大學)，江蘇 無錫，214122) 2(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫，214122)

法尼烯是倍半萜化合物，存在于多種植物的葉片和果實中，是重要的信息素[1]，在植物防御中發揮重要作用[2-3]，也是柴油和噴氣燃料的高效替代物[4]。法尼烯合成酶(farnesene synthase，FS)是法尼烯合成途徑中的關鍵酶，催化前體法尼基焦磷酸(farnesyl diphosphate，FPP)生成法尼烯。

法尼烯在植物中含量極低，提取困難，利用合成生物學方法有望高效獲得這一高值化學品[5]。FS是法尼烯合成途徑中的關鍵酶，對法尼烯的生成具有重要調控作用[6-7]。目前已有多種植物來源的FS通過微生物異源表達被鑒定了功能，但僅對蘋果、青蒿等來源的FS進行了詳盡的酶學性質研究[8-11]，對FS酶學性質認識的不足限制了其在合成生物學中的應用。法尼烯作為揮發性物質在柑橘中存在廣泛[12]，本研究擬通過基因挖掘及異源表達對一種甜橙來源的萜類合成酶(farnesene synthase fromCitrussinensis，FSCS)進行功能表征，并對酶學性質進行研究，以期將其應用于重組釀酒酵母合成法尼烯。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株與質粒

本研究所用菌株和質粒見表1。

表1 本研究所用菌株和質粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

1.1.2 儀器和試劑

限制性核酸內切酶(SalⅠ，BamH Ⅰ，NcoⅠ，DpnⅠ，XbaⅠ)、T4DNA連接酶，美國Thermo Fisher；2×TaqPCR Master Mix、2×Phanta Max Master Mix，南京諾唯贊生物科技有限公司；質粒DNA 提取試劑盒、DNA 純化試劑盒、DNA 凝膠回收試劑盒，康寧生命科學有限公司(上海)；卡那霉素、氨芐青霉素、遺傳霉素(geneticin，G418)、法尼烯標準品，美國Sigma；乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)、二硫蘇糖醇(dithiothreitol，DTT)、異丙基硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-thiogalactoside，IPTG)，北京索萊寶科技有限公司；蛋白胨和酵母粉，OXOID；其余試劑均為國產或進口分析純。

GCMS-QP 2020氣質色譜-質譜聯用儀，日本島津公司；UltiMate 3000高效液相色譜儀，Thermo Scientific。

1.1.3 培養基及培養條件

酵母浸出粉胨葡萄糖(yeast extract peptone dextrose, YPD)培養基(g/L)：酵母提取物10.0，胰蛋白胨20.0，無水葡萄糖20.0。

兩相萃取發酵培養基(g/L)：葡萄糖30.0，酵母粉10.0，蛋白胨20.0，十二烷(體積分數10%)。

TB(terrific broth)培養基(g/L)：甘油5.0，蛋白胨12.0，酵母粉24.0，K2HPO412.5，KH2PO42.3。

大腸桿菌發酵培養條件：將種子液按體積分數3%接種量轉接至50 mL發酵培養基，添加終質量濃度為30 μg/mL卡那霉素，于37 ℃、200 r/min搖床培養至OD600為0.6～0.8，加入終濃度為0.5 mmol/L IPTG誘導，于18 ℃、200 r/min搖床培養22 h。

釀酒酵母發酵培養條件：將種子液按體積分數2%接種量轉接至30 mL發酵培養基，添加終質量濃度為30 g/L葡萄糖溶液，體積分數10%的十二烷，于30 ℃、200 r/min搖床培養72 h。

1.2 實驗方法

1.2.1 氨基酸序列分析

將NCBI數據庫中大豆來源FS(登錄號：NM_001353335.1)氨基酸序列用BLAST比對，選擇序列相似度為53%的Fscs，借助DNAMAN進行關鍵位點分析。

1.2.2 重組表達質粒構建

1.2.2.1 原核表達質粒pET28a-Fscs構建

根據E.coli密碼子偏好優化并基因合成pUC57-Fscs，在兩端分別加入酶切位點BamH Ⅰ、SalⅠ。提取質粒，用SalⅠ、BamH Ⅰ雙酶切并膠回收，將載體pET28a用SalⅠ、BamH Ⅰ雙酶切并線性化。將基因片段與載體于16 ℃條件下連接，連接產物轉入DE3感受態，涂布卡那抗性平板，于37 ℃恒溫烘箱中培養10～12 h，挑取轉化子，提取質粒雙酶切驗證并測序。構建表達質粒pET28a-Fscs所需引物見表2。

表2 構建pET28a-Fscs表達質粒所用引物Table 2 Primers for the construction of plasmid carrying Fscs

1.2.2.2 真核表達質粒Ts gal80-xtpfscs的構建

質粒Ts-xtpfscs的構建：將針對Saccharomycescerevisiae密碼子優化合成的pUC57-Fscs提取質粒，用SalⅠ、BamH Ⅰ雙酶切并膠回收；提取質粒Ts-XTP，反向PCR準備載體，PCR產物用DpnⅠ消化并用SalⅠ、BamH Ⅰ雙酶切；將目的片段與載體于16 ℃條件下連接，轉化JM109感受態，篩選正確轉化子，酶切驗證后保藏菌株。

質粒Ts gal80-xtpfscs的構建：提取質粒Ts-xtpfscs，用XbaⅠ酶切后膠回收；提取質粒Ts-GAL80，反向PCR準備載體并用XbaⅠ酶切；后續實驗步驟同質粒Ts-xtpfscs的構建。構建質粒所需引物見表3。

Ts gal80-xtpfscs醋酸鋰轉化釀酒酵母WH4：活化釀酒酵母WH4菌株，培養至OD600=0.6；將Ts gal80-xtpfscs用NcoⅠ酶切并純化，進行釀酒酵母醋酸鋰轉化實驗。涂布G418抗性培養基，篩選轉化子進行菌落PCR及基因組驗證。

表3 構建Ts-xtpfscs及Ts gal80-xtpfscs表達質粒所用引物Table 3 Primers for the construction of plasmids Ts-xtpfscs and Ts gal80-xtpfscs

1.2.3 重組pET28a-Fscs的誘導表達及蛋白純化

以0.5 mmol/L IPTG為誘導劑，18 ℃、200 r/min發酵22 h使蛋白表達。收集發酵液于4 ℃、8 000 r/min離心10 min，收集菌體，用20 mmol/L磷酸鈉緩沖液(pH 7.4)振蕩重懸洗滌細胞2次，超聲破碎菌體8～10 min，于4 ℃、12 000 r/min離心10 min，上清液即為粗酶液。用鎳柱對FSCS粗酶液進行純化，并將純酶液進行超濾濃縮，4 ℃、12 000 r/min離心20 min，重復3次。

1.2.4 酶學性質研究方法

用純酶液進行酶學性質檢測，以FPP為底物，20 mmol/L，pH 7.4的磷酸鈉溶液作為緩沖液，加入終濃度為5 mmol/L DTT，體積分數10%甘油。反應體系上方覆蓋十二烷萃取產物，反應結束后取上層有機相，10 000 r/min離心10～15 min, 進行產物檢測。

FSCS產物特異性：向500 μL反應體系中加入15 mmol/L MgCl2，100 μg純酶，30 μmol/L FPP, 覆蓋300 μL十二烷，密封，于30 ℃、150 r/min反應1 h，相同反應條件下以空載為對照，進行產物檢測。

FSCS最適金屬離子條件：分別向反應體系中添加終濃度為10.0～80.0 mmol/L Mg2+，10.0～50.0 mmol/L K+，2.0～10.0 mmol/L Mn2+，并以添加50 mmol/L EDTA作為對照組，其余反應條件同FSCS產物特異性。

FSCS最適溫度條件：500 μL反應體系中加入100 μg純酶，30 μmol/L FPP，覆蓋300 μL十二烷，密封，分別在15～45 ℃條件下反應1 h，進行產物檢測。

1.2.5 產物檢測方法

以GC-MS及HPLC對產物進行檢測。

GC-MS條件：色譜柱SH-Rtx-5MS(30 m×0.32 mm，0.25 μm)，流速1 mL/min, 電離方式EI。進樣口溫度260 ℃，起始溫度80 ℃，以5 ℃/min升至180 ℃，再以25 ℃/min升至280 ℃。掃描質量范圍35～800 amu。配制不同濃度法尼烯標準品，確定出峰時間并制作豐度-濃度標準曲線。y=894 139x+436 156，R2=0.999。其中y：豐度，x：質量濃度，mg/L。

HPLC條件：色譜柱(Diamonsil Plus C18，250 mm×4.6 mm, 5 μm)，體積分數70%的甲醇，體積分數30%的乙腈為流動相，流速1 mL/min，檢測波長210 nm，柱溫40 ℃。配制不同濃度法尼烯標準品，確定出峰時間并制作峰面積-濃度標準曲線。y=1.801 2x+1.553 1,R2=0.999。其中y：峰面積，mAU·min；x：質量濃度，mg/L。

2 結果與討論

2.1 FSCS氨基酸序列分析

將大豆來源法尼烯合成酶基因Fsso的氨基酸序列在BLAST進行同源性比對。序列相似度80%以上的多為豆科來源植物，Fscs序列相似度53%，編碼區全長1 831 bp，編碼573個氨基酸。NCBI參考序列號為:LOC102618658。倍半萜合成酶一般編碼550～580個氨基酸，分子質量在50 k～100 kDa[13]。通過DNAMAN對FSCS進行氨基酸序列分析發現，其含有萜類合成酶家族特有的保守結構域DDxxD及NSE/DTE，其中DDxxD為富含天冬氨酸的保守結構域，是底物的結合位點，對酶的活性有重要作用[14]。序列比對結果如圖1所示。

“★”、“▲”分別表示DDxxD及NSE/DTE結構域圖1 FSSO及FSCS氨基酸序列比對Fig.1 Comparison of the amino acid sequences of FSSO and FSCS

2.2 pET28a-Fscs表達菌株的構建及蛋白純化

按照1.2.2.1的方法構建質粒pET28a-Fscs，質粒片段大小為7 078 bp，將質粒用BamH Ⅰ、SalⅠ雙酶切驗證，理論條帶大小為1 722和5 356 bp，結果如圖2所示。電泳條帶大小與理論值一致，重組質粒pET28a-Fscs構建成功。

M-DNA marker；1-重組質粒雙酶切圖2 重組質粒pET28a-Fscs雙酶切驗證Fig.2 Verification of recombinant plasmid pET28a-Fscs through enzyme digestion reactions

將菌株pET28a-Fscs于18 ℃條件下發酵22 h，加入0.5 mmol/L IPTG誘導目的蛋白表達，以空載為對照，將粗酶及純酶液進行SDS-PAGE檢測，結果如圖3所示。在70 kDa位置有目的蛋白條帶，與pET28a-Fscs預測分子質量69.5 kDa相符，獲得了純度較高的目的蛋白，用于后續酶學性質研究。

a-FSCS粗霉SDS-PAGE;b-FSCS粗霉SDS-PAGE M-蛋白質marker；a1-FSCS粗酶；a2-pET28a空載；b1-FSCS純酶圖3 重組蛋白FSCS SDS-PAGE檢測結果Fig.3 SDS-PAGE results of recombinant protein FSCS

2.3 FSCS酶學性質研究

2.3.1 產物特異性探究

按1.2.4配制酶反應體系，以FPP為底物與純酶進行反應，以空載作為對照，探究產物特異性。反應后檢測到α-法尼烯生成，GC-MS檢測結果如圖4所示。FPP與空載反應未檢測到產物生成，證明FSCS具有法尼烯合成酶功能。

圖4 α-法尼烯GC-MS檢測結果Fig.4 GC-MS detection results of α-farnesene

2.3.2 金屬離子對產物的影響

多數萜類合成酶需要在Mg2+或Mn2+的參與下發揮作用[15]。為探究FSCS所需的金屬離子及最適離子條件，按1.2.4方法檢測產物生成情況。單獨添加Mg2+時，檢測到法尼烯生成，在30 mmol/L Mg2+條件下產物濃度最高。以50 mmol/L EDTA為對照，未檢測到產物生成，如圖5-a所示。部分萜類合成酶存在H-α1結構域，K+的存在能夠增強底物與酶的結合，從而增強酶的活性[16]。因此在30 mmol/L Mg2+濃度的基礎上，添加不同濃度K+檢測產物生成情況。如圖5-b所示，K+對產物生成有顯著促進作用，40 mmol/L K+條件下產物質量濃度達到最高為3.86 mg/L，相較于單獨添加Mg2+提升近6.3倍。隨后在30 mmol/L Mg2+、40 mmol/L K+基礎上加入不同濃度Mn2+，對產物生成無顯著促進作用，且較高濃度的Mn2+對產物生成有輕微抑制作用，如圖5-c所示。單獨添加Mn2+基本未檢測到產物生成，說明FSCS對Mg2+親和度高于Mn2+。上述實驗結果表明，Mg2+為酶必需的輔因子，且K+對產物生成有顯著促進作用。大豆、梨等來源的法尼烯合成酶需要Mg2+與K+共同作為輔因子參與反應，而多數萜類合成酶僅需要Mg2+作為輔因子[17]，萜類合成酶對金屬離子的親和性應與蛋白特定結構有關。

圖5 不同金屬離子對法尼烯生成的影響Fig.5 Effects of different metal ions on the formation of farnesene

2.3.3 最適反應溫度探究

如圖6所示，在20 ℃條件下，法尼烯濃度最高，45 ℃以上基本檢測不到產物生成。說明FSCS對高溫耐受性差，在較低溫度下能保持一定活力。研究表明，多數萜類合成酶對高溫耐受性較差，蘋果來源的一種FS最適反應溫度為10～20 ℃，且在0 ℃仍保持一半活性[18]。

2.4 釀酒酵母重組表達菌株WH4-Fscs的構建及產物檢測

按照1.2.2.2的方法構建Ts gal80-xtpfscs表達盒，以GAL80為位點進行釀酒酵母染色體整合。分別以BamH Ⅰ、SalⅠ、XbaⅠ及NcoⅠ進行酶切驗證。BamH Ⅰ、SalⅠ酶切理論條帶大小分別為1 722和6 570 bp；XbaⅠ酶切理論條帶大小分別為4 692和2 700 bp；NcoⅠ酶切理論條帶大小分別為2 692和5 600 bp，均與圖中條帶位置相符。提基因組進行PCR驗證，理論片段大小為2 500 bp，與條帶位置相符，重組表達菌株構建成功，結果如圖7所示。

a-單雙酶切驗證;b-基因組PCR驗證 M-DNA marker；a1-Sal Ⅰ、BamH Ⅰ酶切；a2-Xba Ⅰ酶切； a3-Nco Ⅰ酶切圖7 Ts gal80-xtpfscs單雙酶切及基因組PCR驗證Fig.7 Verification of recombinant plasmid Ts gal80-xtpfscs through enzyme digestion reactions and genome PCR

以WH4原始菌株為對照，HPLC檢測法尼烯生成，結果如圖8所示。標準品出峰時間約在4.418 min,WH4-Fscsα-法尼烯出峰時間在4.382 min，WH4原始菌株未檢測到法尼烯生成，釀酒酵母重組菌株WH4-Fscs構建成功。

a- WH4-Fscs；b-法尼烯標準品；c-WH4原始菌株圖8 法尼烯標準品、WH4-Fscs及WH4原始菌株HPLC檢測結果Fig.8 HPLC results of farnesene reference standard, recombinant strain WH4-Fscs and original strain WH4

2.5 FSCS酶學性質在釀酒酵母表達菌株WH4-Fscs中的應用

2.5.1 最適金屬離子條件在釀酒酵母WH4-Fscs產法尼烯中的應用

通過酶學性質實驗，FSCS最適金屬離子條件為30 mmol/L Mg2+, 40 mmol/L K+。將此條件應用于釀酒酵母重組菌株中，以不添加外源金屬離子作為對照，在30 ℃條件下發酵72 h，檢測法尼烯生成情況。如圖9所示，與不添加金屬離子相比，最適離子條件下法尼烯產量有30%的提升，達到43.76 mg/L。相關研究表明，Mg2+能夠緩解葡萄糖分解代謝物的抑制作用，在培養基中添加Mg2+能夠增強釀酒酵母發酵過程中對乙酸的耐受性，增加乙醇產量，提高細胞活力[19-20]。

圖9 金屬離子對WH4-Fscs發酵產法尼烯的影響Fig.9 Effects of metal ions on production of farnesene by WH4-Fscs fermentation

2.5.2 溫度在釀酒酵母WH4-Fscs產法尼烯中的應用

FSCS最適溫度條件為20 ℃，以30 ℃為對照組，實驗組和對照組均在30 ℃發酵24 h，待葡萄糖基本消耗完畢后調整溫度。后續發酵72 h，發酵過程中分別于24、48、60、72、96 h取樣，檢測產物生成以及菌體生長情況。由圖10可知，30 ℃條件下，發酵前60 h 的OD600高于20 ℃條件，最高為7.153。發酵60 h后，20 ℃條件下菌體OD600更高，最高為7.084。

圖10 不同溫度對WH4-Fscs菌體生長及 法尼烯合成的影響Fig.10 Effects of different temperatures on bacteria growth and farnesene synthesis of WH4-Fscs

從法尼烯產量上看，發酵前期30 ℃條件下法尼烯產量維持更高水平，發酵后期20 ℃條件下法尼烯產量更穩定。低溫發酵可促進釀酒酵母中酯類、萜烯類等物質的形成并延長保留時間[21-22]。法尼烯揮發性較強，在發酵后期可通過降低溫度來維持法尼烯產量。

3 結論

本研究對一種甜橙來源的FS進行了功能表征，并將其酶學性質應用于釀酒酵母表達系統中。以FPP為底物時，FSCS能催化生成法尼烯，而部分萜類合成酶不存在明確的產物或底物特異性，可與不同底物反應生成多種萜類化合物。FSCS的催化功能依賴于Mg2+的參與，在K+存在的條件下，對產物生成有顯著促進作用，該特性與蘋果、大豆等來源的FS相似。FSCS對高溫耐受性差，較低溫度下能夠保持活性。將酶學性質應用于釀酒酵母表達菌株，最適金屬離子條件下法尼烯產量有30%提升，且最適溫度條件對發酵后期產物積累及菌體生長有一定促進作用。上述研究結果有助于進一步了解FS的酶學性質，也為FS在釀酒酵母中的高效表達提供了理論指導。在現有研究基礎上，未來對FS的催化機理仍有待進一步解析，其在細胞內與代謝途徑中其他關鍵酶的調控關系也有待探究。