黑木耳改善高脂飲食引起的小鼠肥胖及腸道菌群紊亂

祝莉娜，胡錦宏，張婷，岳田利，宋微*

1(西北大學 食品學院，陜西 西安，710069) 2(陜西省營養健康食品個性制造工程實驗室(西北大學)，陜西 西安，710069) 3(陜西省食品安全風險識別控制技術研究中心(西北大學)，陜西 西安，710069)

近年來，隨著人們生活水平的提高及膳食習慣的變化，高脂飲食逐漸增加，其過量攝入會導致脂肪蓄積從而形成肥胖[1]。脂肪過多不僅影響行動，還會增加慢性疾病的患病率和死亡率[2]。研究表明，高脂飲食可以誘導結腸癌[3]、非酒精性脂肪肝[4]、認知障礙[5]等。因此，形成良好的飲食習慣、利用食物來源的功能成分預防肥胖及其相關疾病具有十分重要的意義。

腸道微生物可以產生短鏈脂肪酸、膽汁酸和色氨酸等代謝產物，從而參與宿主免疫代謝過程[6]。短鏈脂肪酸可以調節固有免疫細胞參與炎癥性腸病的發生與發展[7]；膽汁酸可以乳化脂肪，促進脂溶性食物的消化吸收；色氨酸通過調節芳香烴受體的活性來調節宿主對急性肝功能衰竭的敏感性[6]。因此，通過對腸道菌群的研究可以進一步明確腸道微生物與機體代謝之間的關系。

黑木耳(Auriculariaauricula)又稱木耳、云耳、木菌等，木耳子實體中含有多種活性物質，是一種營養豐富的藥食同源食用菌，具有較高的營養價值及醫用價值。目前，關于木耳活性物質的研究主要集中在黑木耳多糖、黑色素、膠原蛋白、多酚和黃酮類化合物以及鈣、鐵、鋅、錳等微量元素[8]。黑木耳活性物質具有抗氧化、降血脂、降血糖、抑菌、抗凝血、抗腫瘤、抗輻射等功效[9]。本文采用柞水黑木耳為原料，進一步建立Balb/C小鼠高脂肥胖模型，探討膳食補充黑木耳對小鼠肥胖、肝臟脂肪堆積的改善作用以及對腸道菌群的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料：柞水黑木耳，柞水當地經銷商；普通飼料(control diets，CD)參照Research Diets D12450B、高脂飼料(high fat diets，HFD)參照Research Diets D12451，北京維通利華實驗動物技術有限公司。

試劑：4%多聚甲醛溶液，武漢塞維爾生物科技有限公司；無水乙醇(分析純)，天津市天力化學試劑有限公司；異氟烷，深圳瑞沃德生命科技有限公司；生化試劑盒，南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設備

ULTS1368超低溫冰箱，西門子股份公司；BSA2235電子天平，賽多利斯科學儀器有限公司；BJ-150粉碎機，德清拜杰電器有限公司；FD5-3T真空冷凍干燥機，西盟國際公司；Z326K冷凍離心機，賀默儀器科技有限公司；M200 PRO酶標儀，帝肯貿易有限公司。

1.3 肥胖模型小鼠建立與實驗分組

雄性Balb/C小鼠60只(北京維通利華實驗動物技術有限公司)，飼養于西安交通大學醫學院動物實驗中心，環境溫度(25±2)℃，相對濕度(55±5)%，12 h光暗交替循環條件下自由攝食、飲水。小鼠適應性喂養1周后隨機分為正常組和模型組，其中12只喂食普通飼料作正常組，48只喂食高脂飼料作模型組。共15周，每周固定時間稱重。

依據記錄的體重數據，從高脂膳食組選出體重高于普通飼料組20%的小鼠，即為建模成功的小鼠。然后，根據體重均勻原則，將小鼠分為3組(n=10只/組)，其中CD組喂食普通飼料，HFD組喂食高脂飼料，黑木耳組(Auriculariaauricula，AA組)喂食添加了木耳粉的高脂飼料。實驗進行4周，每2 d稱重1次。本動物研究及操作經過西北大學實驗動物管理及倫理委員會批準(NWU-AWC-20210315M)。實驗設計如圖1所示。

圖1 實驗設計及測定指標Fig.1 Experimental design and tested indexes

1.4 木耳粉的添加方式及添加量的確定

清洗干凈的黑木耳預凍后用真空冷凍干燥機冷凍干燥48 h，將凍干的黑木耳經粉碎后過80目篩。得到的黑木耳粉末加入高脂飼料中混勻，制成條狀后再次凍干，即得含有黑木耳粉的高脂飼料。

傅思瑞等[10]的研究中，黑木耳粉的灌胃劑量為120 mg/mL；李強等[11]在黑木耳粉抗氧化水平的研究中采用了3種添加劑量，其中高劑量組為8.4 g/(kg·d)，顯著提高了機體抗氧化水平。根據參考文獻中的添加量最后確定本研究飼料中的添加量約為130 g/(kg·d)。

1.5 動物組織樣本采集

小鼠處死后，收集血清，摘取肝臟、脾臟組織稱重，然后用錫紙包裹經液氮速凍后儲存于-80 ℃低溫冰箱中或將需要固定的組織迅速放于固定液中(4%多聚甲醛溶液)固定。臟器指數計算如公式(1)所示：

(1)

1.6 血清生化指標的測定

小鼠禁食不禁水，異氟烷吸入麻醉后，脫頸處死。眼球采血，得到的血樣在4 ℃、3 500 r/min下離心2次，每次10 min，得上清液即為小鼠血清，保存于-80 ℃冰箱，待用。

小鼠血清中總膽固醇(total cholesterol，T-CHO)、總甘油三酯(total triglyceride，TG)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)和高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)含量測定方法按照相應試劑盒的說明書進行操作。

1.7 肝臟組織病理學觀察

取多聚甲醛固定的小鼠肝臟組織，經脫水、包埋、切片、蘇木-伊紅(hematoxylin eosin，HE)染色后，光學顯微鏡下觀察其組織形態及病理變化。

1.8 小鼠腸道菌群高通量測序

收集4周末的小鼠糞便，用無菌離心管收集并標記，放入液氮，30 min后放-80 ℃冰箱保存待測。PCR擴增及高通量測序技術委托杭州聯川生物技術股份有限公司檢測。

1.9 統計方法

實驗數據均以平均值±標準差表示。采用SPSS 22.0軟件進行統計學分析，采用ANOVA及Duncan’ test分析各組間顯著性差異(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 木耳對小鼠體重及臟器的影響

體重是判斷個體肥胖的直觀指標。如圖2-a所示，CD組小鼠的體重在實驗過程中明顯低于HFD組；HFD組小鼠體重相對穩定且保持組間最高；而AA組小鼠的體重整體低于HFD組。實驗開始小鼠對添加了木耳的飼料需要適應，因此小鼠體重輕微下降；但從第2周開始小鼠的體重回升；第3周后小鼠的體重開始下降，說明木耳此時開始發揮體重調節的作用。實驗進行至4周末，AA組小鼠體重顯著低于HFD組。另外，圖2-b結果也顯示，HFD組小鼠的平均體重大于CD組，二者之間存在顯著差異。AA組有所下降，且顯著低于HFD組小鼠的平均體重。綜上表明，膳食補充木耳可以顯著降低小鼠體重。

Lee’s指數是評價肥胖程度的有效指數，數值越大，表明動物肥胖程度越嚴重。圖2-c表明HFD組小鼠的Lee’s指數最大，且顯著高于CD組；AA組Lee’s指數相比HFD組顯著降低，和CD組相近。與上述小鼠體重結果一致，說明膳食補充黑木耳能夠顯著降低肥胖小鼠Lee’s指數，減輕小鼠的肥胖程度。

動物臟器的重量與其體重的比值為臟器指數，如表1所示，其可以反應動物的生理狀態。肥胖可引起肝臟腫大，體現在肝臟指數增加、肝脂肪增多[12]，木耳能夠顯著降低肝臟指數，減輕肝臟內脂質沉積，改善肝脂肪變性程度，保護肝臟。脾臟是機體最大的免疫器官，是機體細胞免疫和體液免疫的中心。長期高脂飲食容易導致機體產生炎癥，降低免疫能力。實驗結果表明，木耳顯著降低了脾臟指數，有效改善高脂飲食對脾臟造成的影響。

a-小鼠體重變化；b-小鼠平均體重；c-Lee’s指數圖2 木耳對小鼠體重的影響(n=6)Fig.2 Effect of Auricularia auricula on body weight of mice (n=6)注：字母不同表示組間存在顯著差異，P<0.05(下同)

表1 各組小鼠臟器指數 單位：%

2.2 血清脂質水平

血清中膽固醇含量主要受到飲食習慣的影響。機體長期攝入高熱量的食物會導致血清中T-CHO含量增加，從而引發其他相關的慢性疾病，例如動脈粥樣硬化、高血脂癥、糖尿病等[13]。而高脂食物中的甘油三酯水解成小分子物質后被腸黏膜吸收，在腸黏膜上又再次合成甘油三酯進入血液循環，從而增加血清中TG的含量。另外，LDL-C被認為是“壞的膽固醇”，由LDL運載而進入外周組織。當LDL過量時，所攜帶的膽固醇就存積在動脈壁上引起動脈硬化。高濃度LDL-C是造成動脈粥樣硬化的危險因素。與之相反的是，HDL-C是“好的膽固醇”，是逆向轉運的內源性膽固醇酯，可以運入肝臟后再清除出血液，因此可以抗動脈粥樣硬化，減少患冠狀動脈性心臟病的危險[14]。

圖3-a～圖3-c表明，HFD組小鼠血清中T-CHO、TG以及LDL-C的含量顯著高于CD組，AA組顯著降低，且與普通組無顯著差異。說明日常飲食中補充黑木耳有利于降低血液中膽固醇、甘油三酯和LDL-C的含量，降脂效果良好。相反，圖3-d中HFD組小鼠血清中HDL-C含量顯著低于CD組，AA組顯著增加。由此看來，木耳有助于機體HDL-C含量增加，加強抗動脈粥樣硬化的能力，減少患病機率。

a-T-CHO；b-TG；c-LDL-C；d-HDL-C圖3 小鼠血清脂質含量(n=5)Fig.3 Serum lipid levels of mice (n=5)

2.3 木耳對小鼠肝臟的影響

肝臟是脂質代謝的重要場所，一旦脂質代謝紊亂就會導致脂肪肝、高血脂癥和動脈粥樣硬化等慢性疾病。正常的肝組織，由于肝細胞脂質的合成和排泄維持動態平衡，一般并無脂質堆積。當大量脂質在胞漿內，就會形成大小不等的脂滴，破壞肝臟正常結構，影響肝臟功能。

圖4為各組小鼠肝臟切片的HE染色圖，CD組小鼠的肝臟切片中基本沒有觀察到脂滴的存在；HFD組小鼠的肝臟組織中，脂滴數量多且體積大；而AA組脂滴數量減少且體積縮小。結果表明黑木耳能有效改善小鼠肝臟中的脂質代謝紊亂，減少肝臟中的脂滴，抑制肝臟中脂肪堆積。這可能是因為黑木耳中多糖含量高，且何嘉烽[15]的研究發現黑木耳多糖可以降低血脂，預防高脂血癥。

a-CD組；b-HFD組；c-AA組圖4 各組小鼠肝臟病理切片Fig.4 Liver pathology of mice in each group

2.4 木耳對小鼠腸道菌群結構的影響

飲食習慣會引起腸道菌群改變。周青青等[16]的研究表明，高脂高膽固醇飲食使小鼠腸道菌群α多樣性降低，厚壁菌門和擬桿菌門的比例顯著增高。王家妮等[17]也通過探究高脂飼料對腸道的影響，發現高脂飼料對腸道發育及腸道菌群都有不同程度的影響。

α多樣性是指1個特定區域生態系統內的多樣性，是反映豐富度和均勻度的總和指標。表2展示了各組小鼠α多樣性的指數，其中HFD組小鼠Shannon指數顯著低于CD組，而AA組顯著上調，但與CD組仍存在明顯差異；CD組Simpson指數和Chao1指數都顯著高于HFD組，但是AA組Simpson指數顯著增加，與CD組無差異，而AA組Chao1指數雖增加，但與HFD組沒有顯著差異。由此看出，高脂膳食使得腸道菌群多樣性降低，而日常補充木耳則豐富了腸道內微生物的種類，使腸道菌群多樣性增加，改善高脂飲食引起的腸道菌群變化，從而可以減輕高脂飲食對腸道的損傷。

表2 腸道菌群α多樣性統計表(n=4)Table 2 Statistic of gut microbiota α-diversity (n=4)

β多樣性通過微生物群落結構來度量不同樣本間菌群組成的相似度。如圖5所示，橫坐標主成分1方向貢獻了8.59%的差異度，縱坐標主成分2貢獻了7.24%的差異度。在主成分1水平上，AA組更接近于HFD組；從主成分2維度來看，AA組與CD組的差異比HFD組更小，說明CD組和AA組物種組成更為接近，而這兩者與HFD組存在明顯差異。

圖5 β多樣性分析：主成分分析(n=6)Fig.5 β-diversity index:PCA (n=6)

2.5 木耳對小鼠腸道菌群門水平的影響

研究表明腸道菌群中厚壁菌門、擬桿菌門及二者的比例與肥胖密切相關[18]。如圖6-a所示，小鼠腸道菌群中厚壁菌門和擬桿菌門占菌群的絕大部分。且結合圖6-b來看，HFD組小鼠擬桿菌門顯著高于CD組，而AA組又顯著高于HFD組，與CD組沒有明顯差異；圖6-c中，HFD組厚壁菌門顯著高于CD組和AA組；圖6-d顯示，HFD組厚壁菌門與擬桿菌門的比例顯著低于CD組，AA組二者的比例又顯著增加，與CD組沒有差異。與現有研究結果一致，腸道菌群與肥胖密切相關，厚壁菌門降低、擬桿菌門增加或者是二者的比例降低都有助于促進肥胖[18]。總體看來，日常補充黑木耳能夠減輕高脂飲食引起的腸道菌群門水平紊亂，抑制肥胖對機體帶來的危害。

a-門水平的相對豐度；b-擬桿菌門的相對豐度；c-厚壁菌門的相對豐度；d-厚壁菌門與擬桿菌門的比例圖6 木耳對小鼠腸道菌群門水平的影響(n=4)Fig.6 Effects of A.auricula on intestinal flora in mice at phylum level (n=4)

2.6 木耳對小鼠腸道菌群屬水平的影響

飲食習慣對腸道內微生物產生影響，從而引起機體的生理變化。研究發現，嗜膽菌屬(Bilophila)在膽汁酸含量豐富的腸道中大量繁殖，高脂飲食能使其在腸道菌群中所占比例激增，增加炎性腸病和肝膽疾病的風險[19]；瘤胃梭菌屬(Ruminiclostridium_9)豐度與肥胖指標呈正相關[20]；別樣桿菌屬(Alistipes)代謝產生了丁酸、乙酸和丙酸，在抗炎作用中起重要作用[21]。高通量測序結果表明，不同飲食導致各組小鼠的菌屬相對豐度不同(圖7-a)。如圖7-b～圖7-d所示，HFD組小鼠嗜膽菌屬和瘤胃梭菌屬含量顯著高于CD組，而AA組含量顯著低于HFD組；相反的是，別樣桿菌屬在HFD組中，相對豐度顯著低于CD組和AA組。表明高脂飲食會增加與肥胖相關的腸道微生物豐度、降低有益菌的相對豐度，而膳食補充黑木耳則可以改善高脂飲食引起的腸道菌群紊亂，減輕對機體的損害。

a-屬水平相對豐度；b-Bilophila相對豐度；c-Ruminiclostridium_9相對豐度；d-Alistipes相對豐度圖7 木耳對小鼠腸道菌群屬水平的影響(n=3)Fig.7 Effects of A. auricula on intestinal flora in mice at genus leve (n=3)

2.7 腸道菌群功能預測的差異分析

為了進一步探討黑木耳對腸道菌群代謝的影響，對各組樣品進行功能預測分析。如圖8所示，HFD組小鼠的D-葡萄糖醛酸的降解、D-半乳糖醛酸酯的降解、L-精氨酸的合成等途徑均顯著低于CD組；AA組中這3種物質的代謝均顯著上調。由此可知，高脂飲食會使得機體糖代謝紊亂，從而破壞其參與的循環。研究發現，日常補充L-精氨酸改變了腸道微生物，促進了分泌型免疫球蛋白(SIgA)的分泌、激活了腸道免疫，從而增進腸道健康[22]。由此可得，本研究中膳食補充黑木耳顯著提高了小鼠機體的精氨酸合成，但能否有效改善小鼠機體的抗氧化能力和免疫功能還需要進一步實驗驗證。

a-CD與HFD差異代謝途徑；b-HFD與AA差異代謝途徑圖8 腸道菌群功能預測Fig.8 Differential analysis of intestinal flora function prediction

3 結論

本研究通過膳食添加黑木耳粉改善了高脂飲食引起的小鼠體重的增加及血清甘油三酯、膽固醇的積累，同時減少了肝組織脂肪含量。說明黑木耳能有效降低高脂膳食給機體帶來的危害，改善機體組織、器官因肥胖引起的損傷。

高脂飲食導致腸道厚壁菌門、嗜膽菌屬、瘤胃梭菌屬豐度增加，擬桿菌門、別樣桿菌屬豐度降低，而膳食補充黑木耳后腸道菌群豐度有所改善。說明日常飲食中添加黑木耳能有效調節高脂飲食引起的腸道菌群紊亂，減輕其帶來的危害。黑木耳含有豐富的木耳多糖、黑色素、蛋白質及微量元素等，具有抗腫瘤、降血脂、降血糖以及抗動脈粥樣硬化等功效。有研究表明，黑木耳胞外多糖具有促進腸道內有益菌群增殖，增加短鏈脂肪酸含量及上調血清抗炎因子水平的作用[23]；黑木耳中的多糖、黃酮復配物對腸道菌群具有正向調節作用[24]；黑木耳多糖可能通過調控腸道菌群改善高脂血癥[25]。這些研究說明黑木耳中的多糖可以調控腸道中的微生物從而改善機體代謝。但本實驗中改善肝臟脂質代謝并調節腸道菌群的活性成分是否為黑木耳多糖還需要進一步實驗論證。

越來越多的研究表明腸道微生物與機體代謝息息相關。肥胖是一種低度炎癥疾病，往往表現為脂肪組織和腸道微生物引起的全身低級炎癥。但膳食補充黑木耳能否有效降低高脂飲食引起的腸道炎癥，改善腸道代謝及其病理變化，仍有待進一步研究。