銀杏肽對急性酒精性肝損傷小鼠的保護作用

鄭義，李詩穎，糜心怡，陳琳，李闖，梁一凡

1(徐州工程學院 食品與生物工程學院，江蘇 徐州，221018) 2(江蘇省食品資源開發與質量安全重點建設實驗室，江蘇 徐州，221018)

食源性生物活性肽被認為是新一代的生物活性調節劑[1]，主要來源于動物蛋白和植物蛋白。食源性生物活性肽不僅具有易消化吸收、安全性高的特點，還具有抗氧化、抗疲勞、抗炎、抗菌、調節免疫、降血壓、降血脂和抗腫瘤等廣泛的生理功能，是極具開發利用潛力的功能因子[2-3]。活性肽的制備方法主要有化學合成法、微生物發酵法和蛋白酶解法等，其中最常使用的是蛋白酶解法，已應用于數百種食源性生物活性肽的制備[4-5]。

酒精性肝損傷是臨床上最常見的肝病之一，從單純性肝脂肪變性可進展為肝纖維化和肝硬化，酒精性肝硬化的死亡率占肝硬化死亡率的46.7%[17]。我國酒精性肝損傷的發病率逐年升高，由2000年的2.27%增加到2015年的8.74%，據估計，發病率將不斷升高[18]。酒精性肝損傷的發病機制較為復雜，目前尚未完全闡明，但氧化應激和炎性損傷被普遍認為在該病的發生和進展中具有關鍵作用[19-20]。攝入生物活性肽，拮抗酒精代謝誘導的氧化應激和炎性損傷，被認為是一種有效的輔助治療酒精性肝損傷的策略。動物實驗表明，玉米肽[21-22]、海洋膠原蛋白肽[23]和核桃低聚肽[24]等生物活性肽對酒精性肝損傷都有較好的保護作用。目前有關GBP對酒精性肝損傷保護作用的研究未見報道。

本研究建立急性酒精性肝損傷小鼠模型，基于氨基轉移酶、血脂、促炎細胞因子、抗氧化酶和氧化損傷產物水平等生理生化指標，評價GBP對急性酒精性肝損傷小鼠的保護作用，旨在為GBP的開發利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

銀杏采自江蘇省邳州市；雄性昆明小鼠(20±2)g購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司，生產許可證號SCXY (魯) 20190003。

堿性蛋白酶(2.25×105U/g)，丹麥諾維信公司；丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase, ALT)、天冬氨酸氨基轉移酶(aspartate aminotransferase, AST)、甘油三酯(triglyceride, TG)、總膽固醇(total cholesterol, TC)、IL-1β、IL-6和TNF-α，肝臟過氧化氫酶(catalase, CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)、總超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase, T-SOD)、丙二醛(malondialdehyde, MDA)和蛋白質羰基(protein carbonyl group, PCG)試劑盒，南京建成生物工程研究所；還原型谷胱甘肽片(國藥準字H20050667)，重慶藥友制藥有限責任公司；其他試劑均為國產分析純。

FA2104 N電子分析天平、723C可見分光光度計，上海精密科學儀器有限公司；BILON92-IID超聲波細胞破碎儀，上海比朗儀器有限公司；LGJ-18A冷凍干燥機，北京四環科學儀器廠；TGL-16G型臺式離心機，上海安亭科學儀器廠；SHZ-D(Ш)循環水式真空泵，鄭州長城科工貿有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 銀杏蛋白的制備

銀杏去殼后，60 ℃下烘干，粉碎過60目篩，石油醚脫脂，得到脫脂銀杏粉。采用超聲輔助堿提酸沉法制備銀杏蛋白。按液料比20∶1(mL∶g)將脫脂銀杏粉與去離子水混合，調節pH至10.0，超聲功率200 W，提取溫度50 ℃，提取時間40 min。提取結束后，以3 500 r/min離心20 min，收集上清液，調節pH至銀杏蛋白的等電點4.4，4 500 r/min離心20 min，將所得沉淀透析(截留相對分子質量3.5 kDa)72 h，濃縮，冷凍干燥，得到銀杏蛋白，考馬斯亮藍法測得純度為84.63%。

1.2.2 銀杏肽的制備

按液料比15∶1(mL∶g)將銀杏蛋白與去離子水配成懸液，沸水浴10 min滅內源性酶；調節pH至8.5，加入4 000 U/g堿性蛋白酶，50 ℃振蕩酶解，期間不斷補加NaOH溶液，使pH恒定，待水解度至25%時終止反應；酶解后調節pH至7.0，沸水浴5 min滅酶，8 000 r/min離心20 min，將上清液冷凍干燥后得到銀杏肽。水解度的測定采用甲醛滴定法[25]。

1.2.3 動物分組與處理

該研究遵循的程序符合本院實驗動物倫理委員會所制定的倫理學標準，得到該委員會批準。60只雄性昆明小鼠經適應性飼養后，隨機分為6組：正常組、模型組、3組GBP組和陽性對照組。低、中和高劑量GBP組分別灌胃GBP 50、100和200 mg/kg，連續21 d。陽性對照組每天灌胃100 mg/kg還原型谷胱甘肽；正常組和模型組每天灌胃等量去離子水。第22天，除正常組外，其余組小鼠每隔12 h灌胃體積分數50%酒精(12 mL/kg)，連續3次[26-28]。末次灌胃12 h后，頸椎脫臼法處死小鼠，無菌摘取肝臟和脾臟，稱量小鼠體質量和臟器質量，根據臟器質量與體質量比，計算臟器系數。

1.2.4 血清生理生化指標測定

小鼠眼眶后靜脈叢采血，37 ℃水浴1 h，3 500 r/min離心10 min，收集上清液即為血清，按照試劑盒說明書測定ALT、AST、TG、TC、IL-1β、IL-6和TNF-α水平。

1.2.5 肝臟抗氧化酶與氧化損傷產物水平測定

取肝臟，置于玻璃組織勻漿器，加入一定體積的生理鹽水，制備質量濃度100 g/L組織勻漿，3 500 r/min離心10 min，收集上清液，按照試劑盒說明書測定CAT、GSH-Px、T-SOD、MDA和PCG水平。

1.2.6 數據處理與統計分析

采用SPSS 24.0軟件進行數據統計與分析，結果以平均值±標準差表示，組間多重比較采用Duncan法。

2 結果與分析

2.1 對小鼠臟器系數的影響

肝臟系數和脾臟系數可反映肝脾腫大的程度，而肝脾腫大是酒精性肝損傷臨床上常見的癥狀[29]。由圖1可知，模型組小鼠血清肝臟系數和脾臟系數顯著高于正常組(P<0.05)，提示酒精暴露造成了小鼠肝脾腫大。與模型組相比，GBP組小鼠肝臟系數和脾臟系數顯著下降(P<0.05)，中劑量GBP組脾臟系數以及高劑量GBP組肝臟系數和脾臟系數恢復至正常組水平(P>0.05)，表明GBP緩解了酒精暴露導致的小鼠肝脾腫大。

圖1 銀杏肽對酒精性肝損傷小鼠臟器系數的影響Fig.1 Effects of G.biloba peptides on organ index in acute alcoholic liver injury mice *P<0.05，表示與模型組比較；#P<0.05，表示與正常組比較; (n=10)(下同)

2.2 對小鼠血清氨基轉移酶水平的影響

酒精既有脂溶性又有水溶性，極易造成細胞膜損傷，可改變細胞膜的結構，使細胞膜介電常數、流動性、通透性等物理性質發生變化，造成細胞膜脂質過氧化[30-31]。ALT和AST分別存在于生物體肝細胞的胞漿和線粒體中，生理狀態下血清中ALT和AST水平極低；當肝細胞膜受損后，ALT和AST滲漏至血清，導致血清ALT和AST水平急劇升高，ALT和AST水平是監測肝功能是否受損的敏感標志物。

圖2為GBP對急性酒精性肝損傷小鼠血清ALT和AST水平的影響。模型組小鼠血清ALT和AST水平分別是正常組的3.8和4.7倍，2種氨基轉移酶水平顯著升高(P<0.05)，表明酒精暴露造成了小鼠肝細胞受損，致使血清ALT和AST水平升高。

圖2 銀杏肽對酒精性肝損傷小鼠血清ALT和 AST水平的影響Fig.2 Effects of G.biloba peptides on serum ALT and AST levels in acute alcoholic liver injury mice

GBP組小鼠血清ALT和AST活性顯著低于模型組(P<0.05)，且呈劑量依賴性，高劑量GBP組小鼠血清AST恢復至正常水平(P>0.05)，提示GBP可緩解酒精暴露導致的小鼠肝細胞損傷。陽性對照還原型谷胱甘肽也能顯著降低小鼠血清中這2種氨基轉移酶的水平(P<0.05)。

2.3 對小鼠血清血脂水平的影響

脂質代謝紊亂是酒精性肝損傷的常見癥狀，酒精代謝過程中可誘導脂肪變性，導致脂肪沉積在肝細胞中，同時酒精可影響血脂轉運，造成血清TG和TC水平異常[32]。圖3為GBP對急性酒精性肝損傷小鼠血清TG和TC水平的影響。模型組小鼠血清TG和TC水平分別是正常組的2.2和2.5倍，顯著高于正常組(P<0.05)，提示酒精暴露可導致脂質代謝紊亂，這與前人的研究結果一致[33-34]。給藥GBP后，小鼠血清TG和TC水平顯著低于模型組，表明GBP干預緩解了急性酒精暴露誘導的脂質代謝紊亂。

圖3 銀杏肽對酒精性肝損傷小鼠血清TG和TC水平的影響Fig.3 Effects of G.biloba peptides on serum TG and TC levels in acute alcoholic liver injury mice

2.4 對小鼠血清炎性細胞因子水平的影響

庫普弗細胞在酒精性肝損傷的進展中扮演著重要的角色，酒精暴露會刺激庫普弗細胞通過MyD88介導的Toll樣受體4(toll like receptor 4, TLR4)通路產生IL-1β、IL-6和TNF-α等促炎細胞因子，而這些促炎細胞因子會導致脂肪變性，甚至造成肝細胞炎性損傷和凋亡，加劇急性酒精性肝損傷的進展[35-36]。

圖4為GBP對急性酒精性肝損傷小鼠血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平的影響。由圖4可知，模型組小鼠血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平分別是正常組的1.9、2.3和1.9倍，顯著高于正常組(P<0.05)，提示酒精暴露可誘導小鼠肝細胞發生炎性損傷。與模型組相比，GBP組小鼠血清中IL-1β、IL-6和TNF-α水平顯著降低(P<0.05)，且呈劑量依賴性；高劑量GBP組小鼠血清TNF-α可恢復至正常水平(P>0.05)，提示GBP通過抗炎途徑發揮其對急性酒精性肝損傷小鼠的保護作用。與模型組相比，還原型谷胱甘肽也能顯著降低小鼠血清中IL-1β、IL-6和TNF-α水平(P<0.05)。

圖4 銀杏肽對酒精性肝損傷小鼠血清IL-1β、IL-6和 TNF-α水平的影響Fig.4 Effects of G.biloba peptides on serum IL-1β, IL-6 and TNF-α levels in acute alcoholic liver injury mice

2.5 對小鼠肝臟抗氧化酶活性的影響

肝臟是機體內酒精生物轉化的主要場所，也是酒精毒性作用的主要靶器官。酒精代謝過程中會產生過量的活性氧(reactive oxygen species, ROS)，造成機體氧化與抗氧化防御系統的失衡，從而導致氧化應激，這被認為是急性酒精性肝損傷發生與進展的重要機制之一[37]。CAT、GSH-Px和T-SOD是機體抗氧化酶促防御系統的主要組分，過量的ROS可作用于CAT、GSH-Px和T-SOD等抗氧化酶，使其結構和構象發生改變，導致抗氧化酶活性降低[38]。

GBP對急性酒精性肝損傷小鼠肝臟CAT、GSH-Px和T-SOD活性的影響如圖5所示。模型組小鼠肝臟CAT、GSH-Px和T-SOD活性分別比正常組降低了46.4%、32.8%和28.5%，3種抗氧化酶活性均顯著低于正常組(P<0.05)，提示酒精暴露致使小鼠肝臟處于氧化應激狀態。給藥GBP后，小鼠肝臟CAT、GSH-Px和T-SOD活性顯著高于模型組(P<0.05)，高劑量GBP組小鼠GSH-Px和T-SOD活性恢復至正常水平(P>0.05)，表明GBP通過提高抗氧化酶活性，發揮對急性酒精性肝損傷小鼠的保護作用。

圖5 銀杏肽對酒精性肝損傷小鼠肝臟CAT、GSH-Px和 T-SOD活性的影響Fig.5 Effects of G.biloba peptides on liver CAT, GSH-Px and T-SOD activities in acute alcoholic liver injury mice

2.6 對小鼠肝臟氧化損傷產物水平的影響

酒精代謝過程中產生的過量ROS可作用于機體內的蛋白質和脂質等生物分子，造成蛋白質和脂質的氧化損傷。MDA是脂質過氧化的終產物，PCG是蛋白質氧化損傷的產物，MDA和PCG水平是評估脂質和蛋白質氧化損傷的敏感標志物[39-40]。GBP對急性酒精性肝損傷小鼠肝臟MDA和PCG水平的影響如圖6所示。模型組小鼠肝臟MDA和PCG水平顯著高于正常組(P<0.05)，表明酒精攝入造成脂質和蛋白質氧化損傷。灌胃給藥GBP后，MDA和PCG水平以劑量依賴的方式顯著降低(P<0.05)，提示GBP可緩解酒精暴露誘導的肝組織氧化損傷。

圖6 銀杏肽對酒精性肝損傷小鼠肝臟MDA和 PCG水平的影響Fig.6 Effects of G.biloba peptides on liver MDA and PCG levels in acute alcoholic liver injury mice

3 結論

GBP對急性酒精性肝損傷小鼠具有較好保護作用，能緩解酒精性肝損傷小鼠的肝脾腫大，降低小鼠血清ALT和AST活性，抑制血清TG和TC水平，下調血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平，提高肝臟CAT、GSH-Px和T-SOD活性，降低肝臟MDA和PCG水平。結果顯示,GBP通過抗氧化和抗炎途徑發揮其對急性酒精性肝損傷小鼠的保護作用，作用機制與提高機體抗氧化酶活性和抑制促炎細胞因子表達有關。