普洱茶多糖對健康小鼠短鏈脂肪酸代謝與腸道菌群組成的調節作用

許凌凌，程旺開，周小楠

1(蕪湖職業技術學院 生物工程學院，安徽 蕪湖，241002) 2(蕪湖市生命健康工程技術研究中心，安徽 蕪湖，241000)3(皖南醫學院 基礎醫學院，安徽 蕪湖，241003)

人類腸道中大約有100萬億個微生物，它們共同組成了一個復雜的群落，其中擬桿菌門(Bacteroidetes)和厚壁菌門(Firmicutes)是最豐富的微生物群[1]。眾所周知，腸道菌群不僅影響食物的消化吸收和能量供應，還調節宿主的生理代謝和疾病反應[2-3]。宿主生理代謝受基因和腸道菌群的共同調節。日常飲食可以通過改變腸道菌群的組成、代謝物及代謝功能來影響宿主對大多數慢性病的易感性[4-5]。

多糖由10多個單糖分子通過糖苷鍵組成，可以從多種天然產物中提取[6]。研究表明，非淀粉多糖可顯著改變腸道菌群的組成[4]。雖然非淀粉多糖不能在小腸中直接吸收和消化，但可被微生物轉化為短鏈脂肪酸等具有生物活性的代謝物[7]。ZHAO等[8]發現海參中提取的多糖可促進高脂飲食喂養的小鼠體內乙酸、丁酸和戊酸含量的增加[8]。除了對人體組織的保護作用外，多糖及其代謝物還可以改變腸道微生物的組成，從而發揮益生元作用。然而，多糖種類的不同會對健康小鼠腸道菌群造成不同程度的影響。

普洱茶通常以云南大葉種曬青毛茶為原料，經渥堆發酵、干燥等工藝加工而成[9]，具有抗氧化、降血糖、降血脂、抗突變、防癌等功能[10]。為更好地了解普洱茶相關生物活性物質，研究多集中在普洱茶中天然活性成分的活性及結構，如多糖、黃酮和多酚類化合物[11-12]。普洱茶多糖(Pu-erh tea polysaccharide，PEP)具有多種生物活性，如抗氧化[9]、抗衰老[11]、抗肥胖[13]及免疫調節作用[14]。目前，關于PEP對腸道菌群的調節研究還鮮見報道。

本研究采用16S rRNA高通量測序技術結合氣相色譜鑒定技術對連續35 d接受PEP的健康小鼠糞便中的短鏈脂肪酸、腸道菌群多樣性及組成進行綜合分析。最后，利用基于標記基因序列來預測功能豐度(phylogenetic investigation of communities by reconstruction of unobserved states，PICRUSt2)軟件預測腸道菌群的代謝功能，并確定與脂質代謝相關的微生物，初步探討了PEP的益生效果。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料：普洱生茶，云南程健茶業有限公司；24只雄性無特定病原(specified pathogen free，SPF)級C57BL/6 J小鼠，上海斯萊克實驗動物有限責任公司[許可證號：SCXK(粵)2020-0001]。

試劑：乙酸、丁酸、丙酸、戊酸(色譜純)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；小鼠糞便DNA提取試劑盒，美國MP Biomedicals公司；Q5?高保真DNA聚合酶，英國NEB公司。

1.2 儀器與設備

9560氣相色譜儀，美國Agilent公司；MiSeq高通量測序系統，美國Illumina公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 PEP提取

參考董亮等[15]的方法提取PEP。普洱茶葉經水提、丙酮沉淀、石油醚洗滌、超純水透析、冷凍干燥得到PEP。PEP由鼠李糖(26.36%)、巖藻糖(5.69%)、阿拉伯糖(12.67%)、甘露糖(5.97%)、葡萄糖(40.77%)和半乳糖(8.54%)等6種單糖組成，分子質量為103 kDa。

1.3.2 動物實驗

24只(20±2)g雄性SPF級C57BL/6 J小鼠置于溫度20～22 ℃，相對濕度55%～65%的動物實驗室中，所有小鼠經過1周的適應后進行實驗。24只小鼠隨機分為4組(每組6只)：1組為對照組(normal contrast，NC)，每日給予飼料及無菌水(1 mL/10 g體重)，連續35 d；剩下3組分別為低劑量PEP組(low dose PEP，PEP-L)、中劑量PEP組(medium dose PEP，PEP-M)和高劑量PEP組(high dose PEP，PEP-H)，分別每日給予100、200和300 mg/kg體重，連續35 d。每周檢測小鼠的體重。最后1次灌胃后，所有小鼠禁食16 h。第2天，收集小鼠糞便，并存儲于-80 ℃冰箱中，用于DNA提取。所有動物實驗方案及操作均經蕪湖職業技術學院動物實驗中心倫理委員會批準。

1.3.3 糞便短鏈脂肪酸

采用氣相色譜儀檢測短鏈脂肪酸含量。100 mg小鼠糞便溶解于5 mL超純水中，依次進行渦旋、超聲和離心。保留上清液過0.22 μm水系濾膜后待用。色譜條件：DB-WAX石英毛細柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；升溫程序：初始溫度50 ℃，保持3 min，隨后以6 ℃/min升溫到120 ℃，以10 ℃/min升溫到220 ℃，保持5 min；載氣(He)流量1.2 mL/min，分流比10∶1；進樣量10 μL；進樣口溫度230 ℃；檢測器溫度230 ℃[16]。

1.3.4 糞便DNA提取與16S rRNA高通量測序

使用小鼠糞便DNA提取試劑盒提取糞便微生物DNA。使用NanoDrop 2000型超微量分光光度計測定其溶度和純度。將合格的DNA委托廣州基迪奧生物科技有限公司完成建庫及MiSeq雙端測序。使用引物338F和806R進行PCR擴增，擴增區域為16S rRNA擴增子的V3～V4區，測序引物為338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)。

1.3.5 測序數據處理與統計學分析

微生物組生物信息學分析根據QIIME2(2020.2)流程進行，基于官方教程(https://docs.qiime2.org/2019.4/tutorials/)稍加修改。原始序列數據通過demux插件解復，采用cutadapt插件切除引物，使用DADA2插件對序列進行質量過濾、去噪、合并和去除嵌合體得到擴增序列變異體(amplified sequence variants，ASVs)[17]。通過Silva 138數據庫對ASVs進行分類學注釋，將不能注釋到門水平的ASVs刪除。基于ASVs得到分析結果，采用最小抽平的方法，利用diversity plug-in插件對樣品進行多樣性分析[17]。

基于ASVs的物種組成、主坐標分析(principal co-ordinates analysis，PCoA)、非加權組平均聚類分析(unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA)、非度量多維尺度分析(non-metric multidimensional scaling，NMDS)及熱圖繪制均通過R軟件實現。根據代表序列結果，利用PICRUSt2軟件[18]對腸道菌群的基因功能進行預測。

所有箱線圖均用Graphpad Prism軟件繪制。采用SPSS軟件進行配對樣本t檢驗分析，P<0.05 時認為具有顯著差異。

2 結果與討論

2.1 PEP對體重的影響

動物實驗設計如圖1-a所示。所有的小鼠都進行相同的灌胃處理，只是補充不同劑量的PEP。因此，年輕小鼠體重的變化可以直接反映它們身體的異常。小鼠的體重變化如圖1-b所示。經過1周環境適應后，所有小鼠的體重均有所不同，但各組間無顯著差異(P>0.05)。在實驗期間，各組小鼠的體重均呈持續上升趨勢，但體重增加趨勢在28 d后逐漸減緩，且NC組與其他實驗組之間無顯著差異(P>0.05)。說明每日食用不同劑量的PEP對小鼠沒有明顯副作用。

a-動物實驗設計示意圖；b-小鼠的體重變化圖1 動物實驗設計和補充不同濃度PEP 對體重的影響Fig.1 Animal experiment design and impact of supplementation of different concentration PEP on body weight

2.2 PEP對糞便中短鏈脂肪酸含量的影響

糞便中短鏈脂肪酸含量與腸道健康密切相關，圖2反映了PEP對小鼠糞便中幾種主要短鏈脂肪酸的影響。相比NC組，各劑量組均會增加糞便中乙酸的含量，但PEP-L組和PEP-M組的增加無顯著差異(P>0.05)，而PEP-H組中乙酸含量是NC組的1.3倍(P<0.01)，含量(中位數)可達14.11 mmol/L(圖2-a)。乙酸是腸道厭氧菌的代謝產物，主要參與葡萄糖代謝[19]。在連續灌胃PEP 35 d后，PEP-M組和PEP-H組均會顯著增加糞便中丙酸和丁酸含量(P<0.05)，尤其是PEP-H組的丙酸和丁酸含量分別是NC組的1.9和2.9倍，丙酸和丁酸含量(中位數)分別可達2.19和2.99 mmol/L(圖2-b和2-c)。丙酸可參與并影響膽固醇代謝[20]，而丁酸可為腸上皮細胞提供能量，從而影響免疫細胞的增殖，為宿主提供保護[4]。PEP對戊酸的影響呈現出與乙酸一致的趨勢，只有PEP-H組會顯著增加糞便中戊酸的含量(圖2-d)。此外，相比NC組，PEP-M組和PEP-H組均會顯著增加糞便中總短鏈脂肪酸含量(P<0.05)(圖2-e)。上述結果表明，PEP對腸道的影響存在劑量依賴性，300 mg/kg體重的PEP補充35 d，小鼠糞便中4種主要短鏈脂肪酸的含量顯著增加。因此，選擇PEP-H組進行后續的腸道菌群分析。

a-乙酸含量；b-丙酸含量；c-丁酸含量；d-戊酸含量；e-總短鏈脂肪酸含量圖2 PEP對小鼠糞便中短鏈脂肪酸的影響(n=6)Fig.2 The effect of PEP on short-chain fatty acids in mouse feces (n=6)注：*P< 0.05，**P< 0.01(下同)

2.3 PEP對腸道菌群多樣性的影響

2.3.1 α多樣性

在本研究中，使用物種豐富度、物種多樣性和物種均勻度來評估PEP對腸道菌群α多樣性的影響，其中物種豐富度用Observed指數和Chao1指數表征，物種多樣性用Shannon指數和PD指數表征，物種均勻度用Pielou指數表征。由表1可知，NC組和PEP-H組都具有較高的覆蓋率(>0.97)，表明測序結果足以表征腸道菌群的多樣性。與NC組相比，PEP-H組具有較高的Observed指數和Chao1指數(P<0.01)，說明PEP-H組具有更豐富的微生物群落。該結果與WU等[19]的研究結果相一致，其發現補充青錢柳多糖可顯著增加小鼠腸道菌群的物種豐富度[19]。此外，PEP-H組Shannon指數極顯著高于NC組(P<0.01),PD指數顯著高于NC組(P<0.05)，而Shannon指數和PD指數對群落豐富度和稀有的ASVs更敏感[19]，說明35 d PEP-H補充會增加小鼠糞便的物種多樣性。

表1 PEP對小鼠腸道菌群α多樣性的影響Table 1 The effect of PEP on α diversity of gut microbiota in mice

基于Pielou指數的物種均勻度分析表明，PEP-H能顯著提高腸道菌群的均勻度(P<0.05)。上述結果表明，連續35 d補充300 mg/kg體重的PEP能夠增加腸道菌群的α多樣性。

2.3.2 β多樣性

采用Bray Curtis距離算法和權重UniFrac距離算法將ASVs縮放至距離矩陣中。隨后分別使用PCoA和UPGMA聚類分析比較NC組和PEP-H組小鼠糞便中微生物菌群的差異。NC組和PEP-H組糞便群落的PCoA第1主坐標和第2主坐標分別占總變異的53.82%和15.17%(圖3-a)，且NC組和PEP-H組在PCoA 1軸上的距離較遠，說明PEP-H組和NC組在PCoA 1軸上差異顯著。UPGMA分析結果表明，NC組和PEP-H組中微生物群落分布在2個分支上(圖3-b)，且組間差異大于組內差異，同樣也說明NC組和PEP-H組中微生物群落組成差異顯著。此外，在NMDS分析中也觀察到類似的結果(圖3-c)，與PCoA的結果相一致。這些結果表明，連續35 d補充300 mg/kg體重的PEP能夠改變腸道菌群的β多樣性。

a-基于權重UniFrac距離的主坐標分析；b-基于Bray Curtis距離的非加權組平均聚類分析；c-基于Bray Curtis距離的非度量多維尺度分析圖3 對照組和PEP-H組小鼠腸道菌群的β多樣性(n=6)Fig.3 The β diversity of gut microbiota in mouse feces between NC and PEP-H group (n=6)

2.4 PEP對腸道菌群物種組成的影響

在門水平上，腸道菌群包括厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門(Proteobacteria)、疣微菌門(Verrucomicrobiota)、放線菌門(Actinobacteriota)、Campilobacterota、Deferribacterota和Desulfobacterota(圖4-a)。相比NC組，PEP-H組中擬桿菌門的豐度明顯較低，而厚壁菌門、變形菌門、疣微菌門的豐度明顯較高。PEP-H組中厚壁菌門與擬桿菌門的比值顯著高于NC組(P<0.05)(圖4-b)，說明PEP會改變小鼠腸道菌群的組成。這一發現與用植物多糖結合益生菌可增加腸道菌群中厚壁菌門相對豐度，并降低擬桿菌門相對豐度的結果是一致的[21]。在綱水平上，相比NC組，補充PEP可顯著增加疣微菌綱(Verrucomicrobiae)和芽孢桿菌綱(Bacilli)的相對豐度，并顯著降低擬桿菌綱(Bacteroidia)和彎曲桿菌綱(Campylobacteria)的相對豐度(P<0.05)(圖4-c)。在目水平上，選取平均相對豐度最高的20個目進行比較，相比NC組，PEP-H組中丹毒絲菌目(Erysipelotrichales)、疣微菌目(Verrucomicrobiales)和雙歧桿菌目(Bifidobacteriales)的相對豐度顯著增加，而擬桿菌目(Bacteroidales)、彎曲桿菌目(Campylobacterales)、乳桿菌目(Lactobacillales)和腸桿菌目(Enterobacterales)的相對豐度顯著降低(P<0.05)(圖4-d)。在科水平上，也選取平均相對豐度最高的20個科進行比較，相比NC組，補充PEP-H組中阿克曼氏菌科(Akkermansiaceae)、丹毒絲菌科(Erysipelothrichaceae)、擬桿菌科(Bacteroidaceae)、Clostridia_UCG_014、普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)和理研菌科(Rikenellaceae)的相對豐度顯著增加，同時顯著降低Muribaculaceae和乳桿菌科(Lactobacillaceae)的相對豐度(P<0.05)(圖4-e)。在屬水平上，同樣也選擇平均相對豐度最高的20個屬進行比較，與NC組相比，PEP-H組中雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、糞桿菌屬(Faecalibaculum)、乳球菌屬(Lactococcus)、擬普雷沃菌屬(Alloprevotella)和阿克曼氏菌屬(Akkermansia)的相對豐度顯著增加，而乳桿菌屬(Lactobacillus)和螺桿菌屬(Helicobacter)的相對豐度顯著降低(P<0.05)(圖4-f)。先前的研究表明，喂食含有高直鏈淀粉的食物可增加小鼠腸道菌群中擬桿菌屬(Bacteroides)、雙歧桿菌屬、阿克曼氏菌屬、乳球菌屬和擬普雷沃菌屬的相對豐度[22-23]。此外，高脂飲食會顯著降低小鼠腸道菌群中擬普雷沃菌屬的相對豐度[24]。綜上可知，PEP-H的補充可改變小鼠腸道菌群的物種組成。

a-門水平上微生物群落的相對豐度；b-厚壁菌門與擬桿菌門的比率；c-綱水平上微生物群落的相對豐度；d-目水平上微生物群落的相對豐度； e-科水平上微生物群落的相對豐度；f-屬水平微生物群落的熱圖分析圖4 對照組和PEP-H組中小鼠腸道菌群的分類組成(n=6)Fig.4 The taxonomic composition of gut microbiota in mouse feces between NC group and PEP-H group (n=6)

2.5 標志性微生物的鑒定

為進一步確定NC組和PEP-H組的標志性微生物，在研究中進行了線性判別分析效應大小(linear discriminant analysis effect size，LEfSe)分析和主成分分析(principal component analysis，PCA)。根據LEfSe結果可知，NC組和PEP-H組分別鑒定出7和8個來自不同屬水平的標志性微生物(LDA>3.6,P<0.05)(圖5-a)。乳桿菌屬、Muribaculaceae、杜氏桿菌屬(Dubosiella)和螺桿菌屬等差異最大的前4個屬在NC組中富集，而糞桿菌屬、擬普雷沃菌屬、阿克曼氏菌屬和另枝菌屬(Alistipes)等在PEP-H組中富集。根據圖5-b可知，NC組和PEP-H組的標志性微生物來自不同的門。乳桿菌科、擬桿菌綱和彎曲桿菌綱是NC組中豐度最高的標志性微生物，而丹毒絲菌目、普雷沃氏菌科、理研菌科、放線菌綱(Actinobacteria)和疣微菌綱是PEP-H組中豐度最高的標志性微生物。普雷沃氏菌科被認為與短鏈脂肪酸的合成相關，短鏈脂肪酸的缺乏減弱了其對于腸道黏膜屏障的保護作用，可能導致腸源性內毒素水平增高[25]。在補充茯磚茶的肥胖小鼠中，觀察到體重減輕與腸道菌群中乳桿菌屬和鏈球菌屬(Streptococcus)的相對豐度下降有關[26]。此外，菊粉可增加肥胖小鼠腸道菌群中阿克曼氏菌屬的相對豐度，從而誘導小鼠的減肥[27]。進一步利用PCA在屬水平上確定不同屬對NC組和PEP-H組差異的貢獻。NC組和PEP-H組在PC1軸(79.53%)上顯示出明顯分離(圖5-c)，這與圖3的結果是一致的。阿克曼氏菌屬、雙歧桿菌屬、糞桿菌屬和螺桿菌屬是導致NC組和PEP-H組之間存在顯著差異的最主要的屬(圖5-d)。蛋氨酸限制飲食會增加肥胖小鼠盲腸內容物中有益菌糞桿菌屬的豐度及降低有害菌螺桿菌屬的豐度，從而增加了盲腸中短鏈脂肪酸的含量[28]。

a-標志性微生物的LDA效應值柱狀圖；b-基于LEfSe分析的分類樹圖；c-主成分分析的樣本二維排序圖；d-主成分分析的物種載荷圖圖5 對照組和PEP-H組中物種差異及差異物種分析(n=6)Fig.5 Species difference and specific species analysis between NC and PEP-H group (n=6)

2.6 功能預測

將每個樣本的16S rRNA測序獲得的ASVs序列映射到KEGG通路中，預測在PEP調節下微生物組內代謝功能的變化。圖6-a顯示了NC組和PEP-H組腸道菌群映射到KEGG數據庫中第2級功能通路的相對平均豐度。代謝、環境信息處理和遺傳信息處理是腸道菌群最主要的代謝通路，尤其是代謝占整個功能途徑相對豐度的51.77%。碳水化合物代謝、氨基酸代謝和能量代謝是最主要的代謝功能，分別占整個KEGG通路相對豐度的15.56%、9.38%和7.68%，而膜轉運與復制和修復分別占整個KEGG通路相對豐度的10.23%和10.35%。采用LEfSe分析確定NC組和PEP-H組間具有差異的代謝通路(圖6-b)。

a-對照組和PEP-H中代謝通路相對豐度的KEGG分析；b-基于LEfSe分析的代謝通路樹圖；2-第1級代謝通路； 3-第2級代謝通路；4-第3級代謝通路圖6 對照組和PEP-H組中小鼠腸道菌群代謝功能的預測(n=6)Fig.6 The prediction of metabolic function within the microbiome in NC and PEP-H groups (n=6)

與NC組相比，PEP-H組在第1級代謝通路中代謝、環境信息處理和人類疾病通路下的相對豐度顯著降低，而有機系統通路下的相對豐度顯著增加。在第2級代謝通路中，相比NC組，PEP-H組會顯著增加氨基酸代謝、能量代謝、其他次生代謝產物生物合成、輔助因子和維生素代謝、消化系統、內分泌系統及免疫系統通路下的相對豐度，而會顯著降低脂質代謝與生物降解和代謝通路下的相對豐度。

基于相關性分析探究與脂質代謝通路相關的微生物(圖7)。杜氏桿菌屬、Escherichia-Shigella、乳桿菌屬和Muribaculaceae與酮體的合成和降解、甘油磷脂代謝、亞麻酸代謝、初級膽汁酸代謝及次級膽汁酸代謝呈正相關(P<0.05)，而這些代謝通路則與擬普雷沃菌屬呈負相關(P<0.05)。乳球菌屬、另枝菌屬和羅氏菌屬(Roseburia)與亞麻酸代謝、初級膽汁酸代謝和次級膽汁酸代謝呈負相關(P<0.05)。此外，阿克曼氏菌屬與不飽和脂肪酸生物合成及類固醇生物合成呈正相關(P<0.05)，與酮體的合成和降解呈負相關(P<0.05)；雙歧桿菌屬與甘油磷脂代謝和亞麻酸代謝呈負相關(P<0.05)。

圖7 屬水平微生物與脂質代謝通路的相關性分析Fig.7 The correlation analysis between microbiota in genus level and lipid metabolism pathways注：***P<0.001

3 結論

食用PEP 35 d后，小鼠糞便中短鏈脂肪酸(乙酸、丙酸、丁酸、戊酸)含量呈劑量依賴性顯著增加。PEP(300 mg/kg體重)可有效增加健康小鼠腸道菌群的多樣性，調節某些特定細菌的豐度，促進雙歧桿菌、阿克曼氏菌和糞桿菌等益生菌的生長。此外，PEP干預可能有利于腸道菌群的特定代謝功能，如氨基酸代謝、脂質代謝和其他次生代謝產物生物合成。阿克曼氏菌與不飽和脂肪酸生物合成及類固醇生物合成呈正相關，與酮體的合成和降解呈負相關。綜上所述，PEP的早期干預有助于改善健康小鼠腸道菌群的組成和代謝功能。