荷葉黃酮對(duì)D-半乳糖誘導(dǎo)小鼠肝損傷的改善作用

李沖,勾玉婷,騫宇，趙欣*

1(重慶第二師范學(xué)院 重慶市功能性食品協(xié)同創(chuàng)新中心，重慶，400067) 2(重慶市功能性食品工程技術(shù)研究中心，重慶，400067) 3(功能性食品研發(fā)重慶市工程實(shí)驗(yàn)室(重慶第二師范學(xué)院)，重慶，400067) 4(重慶第二師范學(xué)院 生物與化學(xué)工程學(xué)院，重慶，400067)

荷葉為蓮科蓮屬植物蓮(NelumbonuciferaGaertn)的葉子，其直徑最大可達(dá)60 cm，盾狀或圓形，表面深綠色、被蠟質(zhì)白粉，背面灰綠色、呈波狀，葉柄圓柱形、密生倒刺。荷葉自古以來(lái)就被應(yīng)用于食品、藥品方面，具有安全、無(wú)毒副作用的優(yōu)點(diǎn)，主要分布在中亞、西亞、北美、東亞、南亞等亞熱帶和溫帶地區(qū)。黃酮類(lèi)化合物是一類(lèi)存在于自然界，具有2-苯基色原酮結(jié)構(gòu)的化合物，在植物體中通常與糖結(jié)合成苷類(lèi)，小部分以游離態(tài)(苷元)的形式存在。絕大多數(shù)植物體內(nèi)都含有黃酮類(lèi)化合物，它在植物的生長(zhǎng)、發(fā)育、開(kāi)花、結(jié)果以及抗菌防病等方面起著重要作用。近代研究表明，荷葉的生物活性和生理功能主要與其含有的生物堿、黃酮類(lèi)等功能性成分有關(guān)[1]，荷葉黃酮具有降脂減肥、抗自由基、抗氧化、抑菌、抗病毒等作用[2]。在生命活動(dòng)的氧化代謝過(guò)程中，不斷產(chǎn)生各種自由基。人體的有氧代謝離不開(kāi)能量轉(zhuǎn)換，而自由基在能量傳遞過(guò)程中起著載體的作用。自由基是具有未配對(duì)電子的獨(dú)立化學(xué)物質(zhì)，當(dāng)自由基的數(shù)量超過(guò)抗氧化保護(hù)系統(tǒng)的范圍時(shí)，會(huì)發(fā)生過(guò)度氧化[3]，促使自由基攻擊身體的細(xì)胞獲取電子以維持自身的穩(wěn)定性，對(duì)細(xì)胞的構(gòu)象和功能造成損害，并引發(fā)炎癥[4]、分子降解和其他類(lèi)型的疾病，如心血管疾病、神經(jīng)疾病和癌癥。生物體對(duì)自由基損傷的防御體系中有一類(lèi)非酶促防御體系，天然存在許多對(duì)自由基起作用的物質(zhì)，有些可作為延緩衰老的良好佐劑，此類(lèi)物質(zhì)將具有廣泛的開(kāi)發(fā)背景。衰老是生命過(guò)程中的一個(gè)必然階段，肝主疏泄、調(diào)節(jié)氣機(jī)[5]，是保持機(jī)體氣機(jī)正常出入升降的重要臟器。因此，研究肝臟衰老的機(jī)制對(duì)延緩肝臟衰老具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)采用D-半乳糖誘導(dǎo)的小鼠肝損傷模型[6]，評(píng)價(jià)荷葉黃酮的保護(hù)作用，并測(cè)定其生物活性物質(zhì)，旨在為荷葉的食用藥用價(jià)值的開(kāi)發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

荷葉，采集于云南；DPPH，東京化成工業(yè)株式會(huì)社；二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)，美國(guó)Sigma公司；丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)、谷胱甘肽(glutathione，GSH)、NO試劑盒，南京建成生物工程研究所；白細(xì)胞介素-6(interleukin-6, IL-6)、白細(xì)胞介素-10(interleukin-10, IL-10)、腦腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、白細(xì)胞介素-lβ(interleukin-1β, IL-1β)系列試劑盒，北京誠(chéng)林生物科技有限公司；D-半乳糖，上?；ぴ噭┯邢薰?；ABTS、蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷、槲皮素系列標(biāo)準(zhǔn)品，北京索萊寶科技有限公司；FL-3大孔樹(shù)脂, 上海一基生物有限公司；無(wú)水乙醇, 重慶川東化工(集團(tuán))有限公司。

Ultimate 3 000型高效液相色譜系統(tǒng)、Varioskan LUX型多功能酶標(biāo)儀，美國(guó)Thermo Scientific；KQ-250ES型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器；EYELA N-1 001S型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，日本東京理化器械株式會(huì)社；Centrifuge 5 418R型冷凍離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司；FLUOstar OPTIMA型熒光酶標(biāo)儀，德國(guó)BMG公司；UPH-II-20T型 純水機(jī),四川優(yōu)普超純科技有限公司;HHW21·600AII 水浴鍋,天津市泰斯特儀器有限公司;A0-80A型 干燥箱，施都凱儀器設(shè)備(上海)有限公司；BSA124S型 電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司。

1.2 荷葉黃酮提取物制備

以荷葉為原料，采用乙醇水浴浸提對(duì)其中總黃酮進(jìn)行提取[7]。荷葉經(jīng)粉碎、干燥然后研磨成細(xì)粉。在粉末樣品中加入20倍體積的體積分?jǐn)?shù)為60%乙醇溶液，在水浴中提取2次(60 ℃/1 h)，并將濾液合并。提取物用FL-3大孔樹(shù)脂過(guò)濾，用體積分?jǐn)?shù)為60%乙醇洗脫至無(wú)色，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器蒸發(fā)[8]。去除水和乙醇；然后將得到的樣品冷凍干燥，將樣品封存于離心管中，放置于4 ℃環(huán)境中，備用。

1.3 體外抗氧化實(shí)驗(yàn)

1.3.1 DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)

DPPH自由基是以氮為中心的合成的穩(wěn)定自由基，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，反應(yīng)條件易控制，已廣泛應(yīng)用于各種物質(zhì)提取物或純化合物的抗氧化活性的評(píng)價(jià)[9]和篩選中。

將0.5 mL不同質(zhì)量濃度(0.2，0.4，0.6 mg/mL)的荷葉黃酮提取物添加到2 mL的DPPH乙醇溶液(0.309 mmol/L，該濃度通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)得到)中，混合后在室溫、黑暗條件下靜置30 min。在517 nm處測(cè)定溶液的吸光度，然后扣除樣品和背景吸光度。以抗壞血酸(0.2 mg/mL)為陽(yáng)性對(duì)照，每組3個(gè)平行[10]。DPPH自由基清除率計(jì)算如公式(1)所示：

(1)

式中：Ae,DPPH工作液+荷葉黃酮樣液OD值；Af,空白校正，荷葉黃酮樣液+乙醇OD值；Ag,空白對(duì)照，DPPH工作液+乙醇OD值。

1.3.2 ABTS陽(yáng)離子自由基清除實(shí)驗(yàn)

ABTS經(jīng)活性氧氧化后生成穩(wěn)定的藍(lán)綠色ABTS陽(yáng)離子自由基，向其中加入被測(cè)物質(zhì)，如果該物質(zhì)中存在抗氧化成分[11]，則該物質(zhì)會(huì)與ABTS陽(yáng)離子自由基發(fā)生反應(yīng)而使反應(yīng)體系褪色。

ABTS陽(yáng)離子自由基工作液配制。A液：將3 mg ABTS加入0.8 mL雙蒸水中，充分混合使其完全溶解；B液：將1 mg過(guò)硫酸鉀加入1.5 mL雙蒸水中，混合溶解；各取A液、B液0.2 mL，混合，黑暗放置氧化12 h，用無(wú)水乙醇稀釋至A734的OD值為(0.7±0.02)[12]。結(jié)果表明，20倍稀釋時(shí)可達(dá)要求。

取5 mL具塞試管，加入1 mL的ABTS自由基工作液，加入0.4 mL不同質(zhì)量濃度(0.03，0.04，0.05 mg/mL)的荷葉黃酮提取物，補(bǔ)齊溶劑，黑暗放置30 min，于734 nm處測(cè)定OD值，然后扣除樣品和背景吸光度。以抗壞血酸(0.2 mg/mL)為陽(yáng)性對(duì)照，每組3個(gè)平行[13]。ABTS自由基清除率計(jì)算如公式(2)所示：

(2)

式中：Ai，ABTS工作液+荷葉黃酮樣液OD值；Aj，空白校正，荷葉黃酮樣液+乙醇OD值；Ao，空白對(duì)照，ABTS工作液+乙醇OD值。

1.4 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

1.4.1 動(dòng)物

40只昆明小鼠(6周齡，雄性),重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。小鼠被安置在恒溫(25±2)℃和相對(duì)濕度(50±5)%的控制設(shè)備中，光照/黑暗周期為12/12 h，灌胃期間可以自由地獲得標(biāo)準(zhǔn)小鼠的飲食和水。每隔3 d更換1次墊料，光照充足。

1.4.2 小鼠肝損傷模型的誘導(dǎo)

小鼠適應(yīng)環(huán)境1周后，分為4組(正常組、模型組、低劑量組、高劑量組)，每組10只，以研究荷葉黃酮對(duì)D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老模型的改善作用。所有組均正常飲食、飲水(2～6周)；正常組不給予D-半乳糖，另外3組小鼠腹腔注射D-半乳糖120 mg/(kg·d)[14]，同時(shí)低劑量組小鼠口服250 mg/(kg·d)荷葉黃酮，每日1次。高劑量組小鼠口服500 mg/(kg·d)荷葉黃酮，每日1次。通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)證明荷葉黃酮的劑量范圍對(duì)小鼠無(wú)任何毒性作用。本研究經(jīng)重慶市功能性食品協(xié)同創(chuàng)新中心倫理委員會(huì)批準(zhǔn)實(shí)施(20200630B)。

1.4.3 樣本的收集

6周后，最后1次灌胃并注射D-半乳糖，小鼠禁食18 h后處死。迅速分離肝臟，切除周?chē)竞徒Y(jié)締組織，用生理鹽水清洗殘余血液，準(zhǔn)確稱(chēng)量器官質(zhì)量，并做好記錄。部分肝臟被固定在體積分?jǐn)?shù)為10%福爾馬林溶液中以制作切片。剩余組織液氮預(yù)凍后儲(chǔ)存在-80 ℃冰箱以便后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4.4 荷葉黃酮對(duì)小鼠肝損傷細(xì)胞的MDA、SOD、GSH-Px、NO及GSH含量的影響

肝臟置冰生理鹽水中洗凈血液，用濾紙吸去水分稱(chēng)重剪碎，按照肝臟組織質(zhì)量∶體積(g∶mL)=1∶9的比例加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9%的生理鹽水，冰水浴條件下機(jī)械勻漿，制備成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的勻漿液，4 000 r/min離心10 min，取上清液[15]按照相關(guān)試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定肝組織細(xì)胞勻漿中MDA、SOD、NO、GSH-Px、GSH的含量。

1.4.5 小鼠肝臟組織中細(xì)胞因子的測(cè)定

取1.3.4中備用的勻漿液，按照酶聯(lián)免疫吸附試劑盒說(shuō)明書(shū)，測(cè)定細(xì)胞因子IL-6、IL-10、IL-1β、TNF-α的水平。

1.5 HPLC分析荷葉黃酮的主要有效成分

目前，荷葉中黃酮類(lèi)化合物檢測(cè)多采用紫外可見(jiàn)光光度法[16]，但是該法適用于定量但無(wú)法分析黃酮類(lèi)化合物的具體成分，為了解決該法無(wú)法定性以及定量不準(zhǔn)確的缺點(diǎn)，采用HPLC法測(cè)定荷葉中黃酮類(lèi)[17]的化合物，以此分析荷葉中具體黃酮類(lèi)成分[18]。

(1)標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制。精密稱(chēng)取適量的蘆丁[19]、紫云英苷[20]、異槲皮苷、槲皮素對(duì)照品，用甲醇溶液配制成質(zhì)量濃度為1.5、1、2.8、1.3 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。分別精密吸取0.05 mL，再用甲醇配制成混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

(2)樣品溶液的配制。精密稱(chēng)取20 mg荷葉黃酮提取物粉末于10 mL容量瓶中，再加入1 mL DMSO溶液，混勻30 s，用0.22 μm濾膜過(guò)濾至棕色小瓶中，待測(cè)。

(3)色譜條件。色譜柱：Accucore-C18(5 μm，4.6 mm×250 mm)；流動(dòng)相A為體積分?jǐn)?shù)為0.5%乙酸水溶液；流動(dòng)相B為乙腈；流速1.2 mL/min;柱溫25 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)225 nm；進(jìn)樣體積10 μL；按照表1進(jìn)行梯度洗脫。

1.6 方法學(xué)考察

(1)標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定。精密量取標(biāo)準(zhǔn)品溶液，置于色譜瓶中，分別進(jìn)樣2、4、6、8、10 μL，按照1.5的色譜條件進(jìn)行測(cè)定。以進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)(x)，以樣品峰面積為縱坐標(biāo)(y)進(jìn)行線性回歸。

(2)重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)。精密稱(chēng)取樣品，按照1.5的方法配制成2 mg/mL的樣品溶液，過(guò)濾，用移液槍吸取1 mL樣品溶液，置于色譜樣品瓶中，重復(fù)進(jìn)樣6次，每次進(jìn)樣10 μL，并按照1.5中的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算6次峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation，RSD)值。

(3)回收率實(shí)驗(yàn)。精密稱(chēng)取荷葉黃酮試樣，按照1.5的方法配制成2 mg/mL的樣品溶液，取1 mL樣品液于10 mL容量瓶中，用體積分?jǐn)?shù)50%甲醇定容至10 mL。分別取1.5蘆丁、紫云英苷、異槲皮苷、槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品溶液50 μL于色譜樣品瓶中，再分別加入0.5 mL樣品溶液。按照1.5中的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率。

1.7 數(shù)據(jù)處理

通過(guò)SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)重復(fù)3次，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(standard deviation，SD)。采用Duncan多重范圍檢驗(yàn)的單因素方差分析(analysis of variance，ANOVA)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，P<0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 荷葉黃酮體外抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在0.2、0.4和0.6 mg/mL質(zhì)量濃度下，評(píng)估了荷葉黃酮對(duì)DPPH自由基的清除能力。自由基清除活性值分別為19.4%、50.9%、93.1%(圖1)。DPPH自由基是一種以氮為中心，十分穩(wěn)定的自由基，其穩(wěn)定性主要來(lái)自共振穩(wěn)定作用以及3個(gè)苯環(huán)的空間障礙[21]，而使其夾在中間的氮原子上的不成對(duì)電子不能發(fā)揮其應(yīng)有的電子成對(duì)作用。DPPH自由基乙醇溶液呈紫色，最大吸收波長(zhǎng)為517 nm，如果有其他物質(zhì)提供1個(gè)電子使此孤電子被配對(duì)，吸收能力消失或者減弱，導(dǎo)致溶液顏色變淺，在517 nm處的吸光度變小，其變化程度與自由基清除程度呈線性關(guān)系。不同濃度荷葉黃酮清除DPPH自由基的能力見(jiàn)圖1。隨著荷葉黃酮濃度的增加，對(duì)DPPH自由基的清除能力逐漸增強(qiáng)，說(shuō)明荷葉黃酮提取物對(duì)DPPH自由基清除能力與其濃度存在明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。荷葉黃酮的清除能力與其中含有的抗氧化活性成分有關(guān)。

圖1 不同濃度荷葉黃酮對(duì)DPPH自由基的清除率Fig.1 DPPH free radical scavenging rates of flavonoids from lotus leaf at different concentrations注：不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)

如圖2所示，在質(zhì)量濃度為0.03～0.05 mg/mL，荷葉黃酮提取物對(duì)ABTS自由基清除率在48.6%～92.3%，與維生素C對(duì)照組(31.6%)有顯著差異(P<0.05)。綜上，清除率隨濃度的增加而增強(qiáng)，表明荷葉黃酮提取物對(duì)這2種自由基的清除能力具有劑量依賴(lài)關(guān)系。

圖2 不同濃度荷葉黃酮對(duì)ABTS陽(yáng)離子自由基的清除率Fig.2 ABTS cation ion free radical scavenging rates of flavonoids from lotus leaf at different concentrations

當(dāng)自由基數(shù)量超過(guò)抗氧化系統(tǒng)的承受范圍后，會(huì)攻擊機(jī)體細(xì)胞獲得電子以保持自身的穩(wěn)定性，對(duì)細(xì)胞的構(gòu)象和功能造成損害。為了保護(hù)身體免受自由基損傷，人類(lèi)可以通過(guò)增強(qiáng)自身抗氧化系統(tǒng)[22]和攝入外源抗氧化劑[23]來(lái)抵抗機(jī)體的氧化應(yīng)激。

2.2 器官指數(shù)

由圖3可知，小鼠體重未觀察到明顯的差異變化。器官系數(shù)可以直接反映器官的結(jié)構(gòu)變化，間接反映器官功能的變化[24]。因此，觀察小鼠器官系數(shù)的變化對(duì)判斷小鼠衰老具有重要的參考價(jià)值。與正常組比較，衰老模型肝組織系數(shù)有一定程度的下降(表2)。不同劑量的荷葉黃酮治療后，肝臟組織的系數(shù)在一定程度上有所增高，小鼠器官退化延遲，說(shuō)明荷葉黃酮可以拮抗小鼠肝組織萎縮。與正常組相比，模型組、低劑量組和高劑量組P值均大于0.05，說(shuō)明測(cè)定結(jié)果無(wú)顯著性差異。

圖3 小鼠體重變化Fig.3 Weight change of mice

表2 不同濃度荷葉黃酮對(duì)D-半乳糖所致衰老小鼠 器官系數(shù)的影響 單位：mg/g

2.3 組織學(xué)分析

肝是最大的腺體，它產(chǎn)生的膽汁經(jīng)膽管輸入十二指腸，參與脂類(lèi)物質(zhì)的消化，肝列為消化腺。肝細(xì)胞是一種高度分化并具有多種功能的細(xì)胞，胞質(zhì)內(nèi)各種細(xì)胞器豐富而發(fā)達(dá)，并含有糖原、脂滴等內(nèi)含物。小鼠可將剛消化的食物中的糖原快速存儲(chǔ)在小葉中央的肝細(xì)胞中，使胞漿滲透壓增高，增加水分?jǐn)z入，胞漿因而變得透明。這是正常的變化，有時(shí)會(huì)被誤稱(chēng)為“水變性”或“濁腫”[25]。觀察結(jié)果表明，在小鼠衰老過(guò)程中，肝臟組織的形態(tài)也發(fā)生了變化。如圖4所示，正常組肝細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，大小和染色均勻，中央靜脈結(jié)構(gòu)正常[26]，呈較為規(guī)則的圓形，肝竇、肝細(xì)胞和肝小葉結(jié)構(gòu)正常[27]，肝索排列有序、邊界清晰。與正常組相比，模型組肝細(xì)胞排列不整齊，染色不均勻，中心靜脈性狀不規(guī)則，肝索排列雜亂無(wú)序，界限不清。此外，肝竇有明顯擴(kuò)張，細(xì)胞質(zhì)疏松，細(xì)胞呈球囊樣改變，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，細(xì)胞壞死[28]。分別用250、500 mg/kg荷葉黃酮進(jìn)行治療后，小鼠肝細(xì)胞再次排列有序，形態(tài)略有變化，肝細(xì)胞水腫、炎癥有所緩解。由此可見(jiàn)，荷葉黃酮可以減緩細(xì)胞和組織結(jié)構(gòu)的破壞程度，延緩肝細(xì)胞的衰老。

圖4 荷葉黃酮對(duì)D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老小鼠肝臟形態(tài)的影響Fig.4 Effects of lotus leaf flavone on liver morphology in aged mice induced by D-galactose

2.4 小鼠肝損傷細(xì)胞中NO、MDA、SOD、GSH-Px及GSH含量變化

NO為血管內(nèi)皮舒張因子[29]，在生物體內(nèi)作為反應(yīng)性極強(qiáng)的自由基，兼有信使和神經(jīng)遞質(zhì)作用，同時(shí)又是效應(yīng)分子，在體內(nèi)具有廣泛的生理作用。NO本身半衰期極短，血液中的NO主要由血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、血小板、巨噬細(xì)胞等產(chǎn)生以硝酸鹽及亞硝酸鹽的形式存在，通過(guò)其濃度可以間接測(cè)知NO濃度。

GSH-Px是機(jī)體內(nèi)廣泛存在的重要的催化H2O2分解的酶。它特異地催化還原型GSH對(duì)H2O2的還原反應(yīng)，可以起到保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能完整的作用。GSH-Px的活性中心是硒半胱氨酸，硒是GSH-Px的必需部分，1 g分子酶含4 g分子硒。因此，測(cè)定GSH-Px的酶活力可以作為衡量機(jī)體硒水平的一項(xiàng)生化指標(biāo)。

如圖5所示，不同質(zhì)量濃度(250、500 mg/kg)荷葉黃酮提取物處理后，細(xì)胞中GSH-Px、GSH、SOD的含量明顯提高(P<0.05)，細(xì)胞中NO和MDA含量有所降低(P<0.01)，高劑量荷葉黃酮提取物效果最好。

2.5 細(xì)胞因子IL-6、IL-10、TNF-α和IL-1β的濃度變化

如圖6所示，與正常組相比，模型組(D-半乳糖誘導(dǎo))中促炎因子TNF-α、IL-6和IL-1β的表達(dá)增加(P<0.05)，特別是TNF-α的增加，可促進(jìn)T細(xì)胞產(chǎn)生各種炎癥因子，它是各種信號(hào)通路的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。相反，抗炎因子IL-10的表達(dá)降低(P<0.05)。與模型組相比，低劑量組250 mg/(kg·d)和高劑量組500 mg/(kg·d)對(duì)腫瘤壞死因子TNF-α、IL-6和IL-1β均有下調(diào)作用，但對(duì)IL-10有上調(diào)作用，高劑量組的影響更顯著(P<0.05)。綜上，荷葉黃酮能降低小鼠促炎因子的表達(dá)，促進(jìn)抗炎因子的表達(dá)。

a-MDA；b-NO；c-SOD；d-GSH；e-GSH-Px圖5 荷葉黃酮對(duì)損傷小鼠肝細(xì)胞內(nèi)MDA、NO、SOD、GSH、GSH-Px含量影響Fig.5 Effects of lotus leaf flavonoids on MDA, NO, SOD, GSH and GSH-Px contents in hepatocytes of damaged mice

a-IL-1β；b-IL-6；c-IL-10；d-TNF-α圖6 荷葉黃酮對(duì)損傷小鼠細(xì)胞因子IL-6、IL-10、IL-1β及TNF-α含量的影響Fig.6 Effects of lotus leaf flavonoids on IL-6，IL-10，IL-1β and TNF-α contents in hepatocytes of damaged mice

2.6 荷葉黃酮中主要成分的液相色譜分析

2.6.1 流動(dòng)相的選擇

實(shí)驗(yàn)選擇乙腈-體積分?jǐn)?shù)0.5%乙酸溶液作為流動(dòng)相，該條件下蘆丁、紫云英苷、異槲皮苷、槲皮素等洗脫效果最好，并且添加體積分?jǐn)?shù)0.5%乙酸可以有效減少拖尾現(xiàn)象。

2.6.2 荷葉黃酮的化合物種類(lèi)分析結(jié)果

荷葉黃酮樣品的UV信號(hào)色譜圖見(jiàn)圖7，根據(jù)對(duì)比保留時(shí)間，荷葉中的黃酮類(lèi)化合物有蘆丁、紫云英苷、異槲皮苷、槲皮素。黃酮類(lèi)的混合UV信號(hào)色譜圖見(jiàn)圖8，蘆丁、紫云英苷、異槲皮苷、槲皮素在255 nm處分離效果較好，峰形也較好。

2.6.3 線性關(guān)系

通過(guò)實(shí)驗(yàn)可知，蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷、槲皮素的線性方程如表3，以進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)(x)，以樣品峰面積為縱坐標(biāo)(y)進(jìn)行線性回歸。

圖7 荷葉黃酮樣品溶液Fig.7 Lotus leaf flavonoid sample solution

圖8 蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷和槲皮素混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液Fig.8 Rutin, isoquercitrin, astragalin and quercetin mixed standard solution

表3 線性關(guān)系實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Experimental results for linear relationships

結(jié)果表明蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷、槲皮素的線性方程擬合度R2分別為0.998 4、0.999 4、0.998 6、0.997 1，呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系。

2.6.4 荷葉中黃酮類(lèi)化合物的含量

由圖7、圖8以及表3可知，荷葉中的黃酮類(lèi)化合物為蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷、槲皮素，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為12.401 4、14.778 0、111.513 9、5.673 8 mg/g，紫云英苷的含量較高，其次為異槲皮苷、蘆丁、槲皮素。

2.6.5 加標(biāo)回收率

由表4可知，蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷、槲皮素的加標(biāo)回收率分別為103.58%、92.93%、110.89%、90.35%。說(shuō)明高效液相色譜法對(duì)荷葉黃酮類(lèi)化合物的質(zhì)量控制有較好的準(zhǔn)確性。

表4 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 Recovery experimental results

2.6.6 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)

在重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)中，蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷、槲皮素的峰面積RSD值分別是2.28%、0.12%、2.34%、0.84%，表明此方法重現(xiàn)性良好。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)初步分析了荷葉中潛在的生物活性成分，并對(duì)這些生物活性成分的體外抗氧化作用以及體內(nèi)改善D-半乳糖誘導(dǎo)的小鼠肝損傷進(jìn)行了評(píng)價(jià)。結(jié)果表明，荷葉黃酮對(duì)DPPH、ABTS陽(yáng)離子自由基具有顯著的清除作用，同時(shí)還能增強(qiáng)小鼠肝組織SOD、GSH-Px、GSH活性，降低MDA和NO含量。酶聯(lián)免疫法實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，荷葉黃酮還可以抑制促炎因子TNF-α、IL-6和IL-1β的表達(dá)，促進(jìn)抗炎因子IL-10的表達(dá)。利用高效液相色譜對(duì)其中的活性成分進(jìn)行了分析，從中檢測(cè)到蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷、槲皮素4種黃酮類(lèi)化合物，蘆丁及其衍生物具有抗氧化活性和廣泛藥理活性[32]，異槲皮苷具有抗炎、抗氧化等生物活性，具有較大的應(yīng)用價(jià)值[33]，紫云英苷是一種天然的黃酮類(lèi)化合物，具有多種生物活性藥理作用[34]，槲皮素因其生物活性強(qiáng)，藥理作用廣泛，具有抗腫瘤、血糖調(diào)節(jié)等多種作用[35]。這些黃酮類(lèi)活性成分的存在可能是荷葉表現(xiàn)出諸多藥理作用的主要原因。荷葉黃酮作為天然植物類(lèi)黃酮化合物，對(duì)人類(lèi)機(jī)體具有多種生理活性，具有較大的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用前景。