烘焙配方對1,2-二羰基化合物及晚期糖基化終末產物的影響

宋小莉，李普，張秋婷，馮莎莎，代潔，呂麗爽

(南京師范大學 食品與制藥工程學院，江蘇 南京，210023)

食品加工中蛋白與糖類之間的美拉德反應在賦予食品獨特風味與色澤的同時，也會產生一些潛在有害產物，如反應中級階段產生的1,2-二羰基化合物乙二醛(glyoxal，GO)會抑制細胞中DNA的合成，引起線粒體功能紊亂[1]；甲基乙二醛(methylglyoxal，MGO)通過產生凋亡物質誘導細胞死亡[2]；賴氨酸或精氨酸與GO、MGO反應生成的晚期糖基化終末產物(advanced glycation end products，AGEs)與AGEs受體結合，誘導機體發生氧化應激與炎癥反應[3]。LEVINE等[4]發現，過多地攝入熱加工的食品可導致糖尿病和腎病，并且誘發炎癥，增強氧化應激，促進動脈粥樣硬化的發生。傳統調控烘焙食品美拉德反應產物中AGEs的形成非常依賴于產品及加工參數，成分(如前體含量、pH值和含水量)的任何變化或抑制劑的添加都會影響食品的質量[5]。然而，在許多食品中，對其進行加熱是保持味道和外觀及提高消費者接受度必不可少的過程。加工過程會對美拉德反應中有害產物含量產生影響，因此，必須進行產品配方的優化以控制有害產物的產生。

根據面粉中谷朊蛋白的含量可將面粉分為3類，高筋面(12%～15%)、中筋面(9%～12%)和低筋面(7%～9%)，根據其特性差異，可將其用于蛋糕、面包、餅干等不同烘焙產品[6]。然而，谷朊蛋白是水沖洗生面團后去除淀粉和水溶性蛋白之后剩下的復雜黏性蛋白[7]，其氨基酸組成較齊全，是營養豐富的植物性蛋白源，內含40%～50%麥醇溶蛋白和30%～40%麥谷蛋白[8]，在面制品加工中起決定性作用，影響面制品的結構、口感、色澤等。谷朊蛋白對面制品的結構與性質方面的影響研究比較廣泛，谷朊蛋白的薄膜成型性、黏彈性、延伸性、乳化性和吸水性等，使其具有明顯的應用和加工優勢[9-10]。GO和MGO是表征1,2-二羰基化合物的最廣泛的標志物[11]。AGEs的種類繁多，結構復雜，尚未有明確組成。目前加工因素對以羧甲基賴氨酸作為非熒光性AGEs組分的影響已有廣泛研究[12]。但是，對AGEs中其他代表物質如戊糖素、精胺嘧啶、甲酰蘇阿糖吡咯等未見系統研究。因此類物質均具有自發熒光性，可以測定其熒光強度變化來相對定量地分析AGEs的含量，且該方法簡單、有效[13]。

本文以不同谷朊蛋白含量的面粉為研究對象，并通過氣相色譜法和熒光光譜法(λex/λem=340 nm/465 nm)測定模擬體系中GO、MGO和熒光性AGEs生成量，研究不同配料(淀粉、卵白蛋白、玉米油)對美拉德反應中的GO、MGO以及熒光性AGEs產生量的影響。探討美拉德反應中產物形成的各種原料因素相關性，為小麥谷朊蛋白的應用以及小麥制品安全化加工生產提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲基乙二醛(40%水溶液)、乙二醛(40%水溶液)、鄰苯二胺、小麥谷朊蛋白、卵白蛋白，美國Sigma-Aldrich公司；二氯甲烷、鹽酸、十二烷基硫酸鈉、β-巰基乙醇、三羥甲基氨基甲烷、2,3-丁二酮、淀粉、無水葡萄糖、NaH2PO4、Na2HPO4，均為分析純，甲醇(色譜純)，上海國藥集團化學試劑有限公司提供；玉米油，邦基(南京)糧油有限公司。

7820A氣相色譜儀(配有HP-5色譜柱和FID檢測器)，美國Agilent公司；Infinite 200 Pro TECAN酶標儀，瑞士Tecan公司；CentriVap 離心濃縮儀，美國Labconco公司；Biofuge Stratos離心機、ULT1 386-3V超低溫冰箱，美國Thermo公司；KQ-300B超聲波清洗器，昆山超聲儀器有限公司；SHZ-82 水浴振蕩器，常州華怡儀器制造有限公司；AUY220分析天平，日本島津公司；PHS-3C數字式pH計，上海三信儀表廠；XW-80A微型漩渦混合儀，上海滬西分析儀器廠有限公司；DHG-9140型電熱恒溫鼓風干燥箱，上海精宏實驗設備有限公司；FW177高速萬能粉碎機，天津市泰斯特儀器有限公司；JEM-2100F 掃描電子顯微鏡，日本JEOL公司；CHIRASCAN 數字式圓二色譜儀，英國Applied Photophysics公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 美拉德反應產物的制備

模擬傳統烘焙條件，按照下列不同原料配方進行樣品制備[14]，具體反應條件如下：將準確稱量的各原料混合均勻，加入pH為7.0、濃度為0.05 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液保持體系pH一致，最終揉成圓形面團。置于160 ℃烤箱中，反應30 min。冷卻至室溫，粉碎后儲存于-20 ℃備用。

1.2.2 不同原料配方對GO、MGO和熒光性AGEs的影響

將4種主要成分，依據烘焙食品的配方，盡量降低各組分的添加量，設定：2.0 g谷朊蛋白、0.3 g葡萄糖分別與不同質量的淀粉(8.0、12.0、16.0 g)、卵白蛋白(0.02、0.1、0.2、0.4 g)或玉米油(0.1、0.2、0.4、0.6 g)混合，以獲得不同配比的原料配方。將上述混合物體系按1.2.1操作。研究不同原料配方對GO、MGO生成量及熒光特性AGEs的影響規律。

1.2.3 不同原料配方與GO，MGO和熒光性AGEs的相關性分析

根據預實驗結果，選擇淀粉添加量、卵白蛋白添加量、玉米油添加量以及兩兩交互作用作為考察的因素，每個因素3個水平，依據1.2.1操作。以GO和MGO生成量、AGEs的相對熒光強度為考察指標，采用L27(313)正交試驗表得出最佳配方條件。

表1 正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal array design

1.2.4 GO和MGO含量的測定

參照王晨等[15]建立的氣相色譜分析方法，以2，3-丁二酮為內標，鄰苯二胺為衍生化試劑進行檢測。樣品用1 mL 100 mmol/L鄰苯二胺衍生化10 min后，加入1 mL 2 mol/L乙醛混合均勻后置于60 ℃水浴鍋內加熱15 min，取出冰浴，加入2 mL二氯甲烷，超聲波萃取15 min，重復萃取2次。氮吹后用二氯甲烷復溶，取1 μL進入GC檢測。

待測樣品前處理步驟如下：

稱取0.500 0 g不同的樣品于10 mL離心管中，加入5 mL蒸餾水，漩渦振蕩混勻3 min，離心(8 000 r/min)30 min，保留上清液(A)。在剩余沉淀的離心管中加入5 mL體積分數為50%的甲醇水溶液，混勻后超聲1 h，離心(8 000 r/min)30 min，保留上清液(B)，將上清液A、B合并混勻，離心(8 000 r/min) 30 min，保留上清液。取2 mL上清液進行衍生化，根據上述方法，建立標準曲線。

MGO質量濃度在0～40 μg/mL有良好的線性關系，測得MGO的線性回歸方程為：Y=0.031 13X-0.009 21(R2=0.999 6)；GO的質量濃度在0～40 μg/mL有良好的線性關系，測得GO的線性回歸方程為：Y=0.032 65X+0.012 98(R2=0.999 5)。

1.2.5 熒光性AGEs的含量

熒光性AGEs的含量測定參考SCHMITT等[16]的方法略有修改。稱取0.250 0 g粉碎的樣品，加入4.75 mL提取液(0.05% 吐溫-20，1% 十二烷基硫酸鈉，5% β-巰基乙醇，0.05 mol/L pH 7.4的Tris-HCl)，混勻后置于30 ℃，100 r/min恒溫振蕩培養箱24 h。然后，離心(8 000 r/min)30 min，取200 μL上清液進行熒光光譜掃描，設置激發波長為340 nm，發射波長為380～465 nm，狹縫寬度為5 nm，測定上清液的熒光強度。經波長掃描可知在發射波長為425 nm處，待測樣品具有最大吸收，因此，本研究在λex/λem=340 nm/465 nm處熒光值(熒光值以任意單位AU表示)表示樣品中熒光性AGEs的含量。

1.2.6 掃描電鏡分析

用導電膠將1 μg冷凍干燥好的樣品粉末固定在載物臺上，洗耳球輕吹掉粘結不牢固的粉末，用離子濺射儀對樣品進行噴金處理，噴鍍電流為3 mA，噴鍍3次，每次時間為60 s，再用掃描電鏡觀察樣品表面形貌。

1.2.7 圓二色譜分析

取1 mg冷凍樣品于10 mL容量瓶中，溶解介質為0.01 mol/L NaOH溶液。樣品溶液注入0.1 cm厚的橢圓形石英比色皿中，放入圓二色譜儀的比色光區，在 25 ℃和連續充氮的條件下，在遠紫外區域(190～250 nm)掃描，速度為50 nm/min，狹縫為2 nm，光譜間隔1 nm，掃描3次取平均值。二級結構的含量按楊氏公式計算[17]。

1.2.8 數據分析與統計數據

分析采用ANOVA，通過SPSS Statistics 20.0 進行Duncan分析及交互分析。使用偏最小二乘回歸分析不同原料之間的潛在相關性。每次實驗重復3次，數據表示為平均值±標準偏差。

2 結果與分析

2.1 不同原料配方對GO，MGO和熒光性AGEs的影響

2.1.1 淀粉添加量對小麥谷朊蛋白中GO,MGO和熒光性AGEs形成的影響

谷朊蛋白-糖模擬體系中由不同淀粉添加量引起的GO，MGO和熒光性AGEs的含量變化如圖1所示。GO的含量隨著淀粉添加量的增加而顯著降低(P<0.05)，當m(谷朊蛋白)：m(淀粉)=1∶4時，GO的生成量由14.40 μg/g降至6.75 μg/g，下降率約為53%。分析可能的原因是加熱后淀粉為片狀網狀結構，顆粒表面存在一些不均勻的孔洞，增大了其包裹小分子物質的能力[18]，不僅減少了谷朊蛋白與糖的接觸機會，同時降低了初級代謝產物之間的反應機率，顯著降低了美拉德反應程度，進而降低GO的生成量[19]。然而，當進一步增加淀粉的添加量(由1∶6增加至1∶8)時，GO的生成量沒有顯著性變化，分析可能是由于葡萄糖是小分子，而淀粉是生物大分子，具有一定的空間位阻不能夠完全阻止谷朊蛋白與葡萄糖的反應，由此得出，隨著淀粉添加量的增大，GO的生成量會逐漸趨于穩定[20]。

由圖1可知，MGO的生產量隨著淀粉的添加是顯著降低的，尤其是當m(谷朊蛋白)：m(淀粉)由1∶0增加為1∶4時，MGO的生成量由67.74 μg/g降至34.09 μg/g，下降率可達50%。且隨著淀粉量的增加進一步降低，當m(谷朊蛋白)：m(淀粉)=1∶8時，MGO產生量為11.85 μg/g，下降率可達82.5%。這與GO生成量的變化趨勢有所不同，可能是因為除淀粉的空間位阻外，糊化后淀粉唯一的還原性末端還可以與谷朊蛋白的游離氨基發生美拉德反應，減少了參與和葡萄糖發生美拉德反應的谷朊蛋白的游離氨基，使反應產物中MGO的含量進一步減少。

圖1 淀粉對小麥谷朊蛋白-葡萄糖體系GO、MGO和 AGEs含量的影響Fig.1 Effect of starch on the ontent of GO, MGO and AGEs in the gluten-glucose reaction system注:不同小寫字母表示數值間存在顯著差異，P <0.05(下同)

隨著淀粉添加量的增加，熒光性AGEs的含量顯著降低，且當m(谷朊蛋白)∶m(淀粉)=1∶8時，下降率達到最大，約為76.2%，與MGO的變化趨勢一致。由此，熒光性AGEs是美拉德反應的晚期終末產物的主要代表之一，它的主要前體物質為3-脫氧葡萄糖醛酮[21]，雖然羧甲基賴氨酸(CML)的反應前體為GO，但是熒光性AGEs仍具有相似的變化趨勢。有研究表明，在小麥面團中,谷朊蛋白通過二硫鍵和非共價鍵形成面筋網絡結構[22]，淀粉則填充在面筋網絡結構之中，與谷朊蛋白間有相互作用，加固了蛋白的三維網狀結構，減緩了蛋白糖基化的發生[23]。

2.1.2 卵白蛋白添加量對小麥谷朊蛋白中GO，MGO和熒光性AGEs形成的影響

根據烘焙制品常用配方選擇卵白蛋白添加量為0.01～0.2 g/g。圖2顯示對照組的GO和MGO含量分別為19.52 μg/g和71.22 μg/g。隨著卵白蛋白添加量增加，三類有害物的生成量有不同程度地降低。當卵白蛋白添加量在0.01～0.1 g/g時，MGO的生成量差異性不顯著(P>0.05)，推測其原因可能是加入少量的卵白蛋白，主要增加面團的黏性，對MGO產生量無多大影響。在卵白蛋白添加量為0.05～0.2 g/g時，GO生成量沒有顯著性變化，可能是因為少量卵白蛋白的加入僅與谷朊蛋白在美拉德反應過程中形成競爭作用。

圖2 卵白蛋白對小麥谷朊蛋白-葡萄糖體系GO、 MGO和AGEs含量的影響Fig.2 Effect of ovalbumin on the content of GO, MGO and AGEs in the gluten-glucose reaction system

熒光性AGEs的產生量變化趨勢與MGO變化趨勢相似，推測該體系中產生的AGEs變化與中間產物MGO誘發的進一步糖基化反應相關。在卵白蛋白添加量為0.2 g/g時，熒光性AGEs降至最低，與RYDBERG等[24]的研究具有相似結果，在模擬餅干體系中直接加入酪蛋白可減少糖基化有害產物的生成量，推測其可能是由于蛋白質的保護作用，有害產物通過與氨基酸側鏈上的親核基團(—SH，—NH2)反應進而減少其產生量。

2.1.3 玉米油添加量對小麥谷朊蛋白中GO、MGO和熒光性AGEs形成的影響

圖3為不同玉米油添加量對GO、MGO和熒光性AGEs含量的影響。當油脂添加量為0.01 g/g時，GO降低約36%，MGO降低約8%左右，AGEs降低2%；但是，繼續增加油脂添加量(0.05～0.2 g/g)，美拉德有害產物生成量卻無明顯差異(P>0.05)。脂肪自身氧化可產生GO、MGO等AGEs前體化合物，但與蛋白糖基化過程中產生的量相比，生成量相對比較低。LIMA等[25]研究證明在相同條件(95 ℃、8 h)下，酪蛋白和葡萄糖反應形成的AGEs比酪蛋白與花生四烯酸產生的AGEs高15倍。由此可推測當玉米油加入到谷朊蛋白-葡萄糖體系中，谷朊蛋白與玉米油相互作用，阻止少量谷朊蛋白不與葡萄糖進行美拉德反應，所以盡管玉米油添加量為0.01 g/g，但3種有害物質量均減少。

圖3 玉米油對小麥谷朊蛋白-葡萄糖體系GO，MGO 和AGEs含量的影響Fig.3 Effect of corn oil on the content of GO,MGO and AGEs in the gluten-glucose reaction system

此外，SREY等[26]發現在添加人造黃油的海綿蛋糕中，AGEs的生成量隨人造黃油的使用量增減變化不太，無明顯差異。而在海綿蛋糕中添加高含量的油(賴氨酸與油的摩爾比為1∶50)時產生的AGEs含量大約是低含量油(賴氨酸與油的摩爾比為1∶1)的3.8倍；但其所添加油脂量遠遠高于實際體系中油脂含量。因此，如果在烘焙食品中添加正常含量的油脂，可以對GO的生成量有顯著性的降低，對MGO和AGEs影響不顯著，而其作用機制有待進一步研究。

2.2 交互作用分析

為了進一步探討影響糖基化過程中GO、MGO和熒光性AGEs的主要因素以及各因素之間是否存在交互作用[27]，在單因素試驗基礎上，研究淀粉添加量、卵白蛋白添加量、玉米油添加量對模擬體系中GO、MGO和熒光性AGEs產生量的影響，以便可以根據應用的要求，選擇更為安全的烘焙原料配比，結果如表2所示。

表2 正交試驗設計與結果Table 2 Design and experimental results of orthogonal array

考慮到小麥制品在加工過程中各組分對美拉德產物形成的影響，對淀粉、卵白蛋白、玉米油添加量及三者對谷朊蛋白-糖之間交互作用進行正交試驗，經極差分析得到各因素對谷朊蛋白-葡萄糖體系產生糖基化產物的影響。直觀分析結果表明，淀粉是影響GO、MGO和熒光性AGEs產生量的最主要因素，綜合分析可知，體系中GO、MGO和熒光性AGEs產生量最低為最優，而對GO、MGO和熒光性AGEs產生量抑制最優條件均為A2B3C1，即淀粉添加量6 g、卵白蛋白添加量0.2 g、玉米油添加量0.05 g時，GO、MGO含量分別為15.117 8 μg/g、20.066 6 μg/g，熒光性AGEs為6 349 RFU，均為各組最低。

由表3可知，淀粉的添加量對GO、MGO和熒光性AGEs生成量的影響均為極顯著(P<0.001)，卵白蛋白的添加對GO和熒光性AGEs具有顯著性影響(P<0.05)；玉米油對3種有害物質均無顯著性影響。同時淀粉添加量與卵白蛋白的交互作用也呈現顯著性。此外，A3B3C2時，具有最高的GO和MGO生成量；A1B3C3時，具有最高的熒光性AGEs含量。有害產物生成量逐漸增加。結合前期數據，淀粉添加量增加將大幅降低體系中美拉德反應GO、MGO和熒光性AGEs含量。但仍需注意其他組分的添加量的影響。

表3 正交試驗方差分析Table 3 Analysis of variance of orthogonal test

2.3 掃描電鏡分析

為表征淀粉在反應中的作用，研究了淀粉添加前后谷朊蛋白在反應中微觀結構的變化，同時研究對照在非糖基化條件下，淀粉對小麥谷朊蛋白結構的影響。冷凍干燥后谷朊蛋白表面呈較均勻的片狀結構(圖4-a)；添加葡萄糖后發生了糖基化反應，產物中結構發生明顯變化，形成疏松的孔洞狀結構(圖4-b)，這可能是在糖基化反應后，谷朊蛋白與糖分子共價結合時，蛋白質分子發生熱聚集行為，糖分子結合在蛋白分子表面導致谷朊蛋白結構被破壞[28]；谷朊蛋白-淀粉體系中，淀粉的添加改變了谷朊蛋白的表觀形貌(圖4-c)，谷朊蛋白與淀粉之間的確發生了相互作用。

a-谷朊蛋白；b-谷朊蛋白+葡萄糖；c-谷朊蛋白+淀粉； d-谷朊蛋白+葡萄糖+淀粉圖4 小麥谷朊蛋白改性前后的掃描電子顯微鏡圖Fig.4 Scanning electron microscopy of gluten before and after modification

與淀粉共存的小麥谷朊蛋白-葡萄糖體系中，盡管也有部分孔洞出現，但孔洞數目明顯減少(圖4-d)，推測淀粉加入后與谷朊蛋白進行相互作用形成復合物，阻擋了小麥谷朊蛋白與葡萄糖的反應，與前文推測一致。

2.4 圓二色譜分析蛋白質結構

由圖5和表4可知，糖基化復合改性小麥谷朊蛋白樣品中α-螺旋含量下降，這是由于穩定α-螺旋的作用力主要是多肽鏈的氫鍵，而糖基化改性影響了氫鍵的穩定；同時，二級結構中的β-折疊和β-轉角及無規則卷曲結構的含量上升，進一步說明糖基化改變了谷朊蛋白的二級結構[24]。在谷朊蛋白中加入淀粉后，兩者之間發生了交聯作用，α-螺旋含量較原來有大幅度下降。而在谷朊蛋白中同時加入葡萄糖和淀粉，谷朊蛋白的α-螺旋含量并未發生變化，推測為淀粉與谷朊蛋白發生交聯，占據蛋白發生糖基化反應的位點，使葡萄糖無法再與谷朊蛋白進行反應；進而再次證明加入淀粉可一定程度阻止谷朊蛋白與葡萄糖發生美拉德反應，從而降低美拉德產物GO、MGO和熒光性AGEs形成。

圖5 圓二色譜研究不同條件下谷朊蛋白二級結構的變化Fig.5 The effect of the different conditions on secondary structure of wheat glutenin by CD spectroscopy

表4 不同條件下谷朊蛋白二級結構的含量 單位：%

3 結論

本文主要研究谷朊蛋白與葡萄糖模擬體系在加工過程中的美拉德反應潛在危害產物的生成量，受淀粉、卵白蛋白和玉米油三大主要配料的影響規律。通過正交試驗進行交互分析，發現淀粉的添加量對GO，MGO和熒光性AGEs生成量的影響均為極顯著；卵白蛋白的添加對GO和熒光性AGEs具有顯著性影響；玉米油對3種有害物質均無顯著性影響。由正交實驗得出，可供參考的谷朊蛋白∶糖∶淀粉∶卵白蛋白∶玉米油最佳質量比例為1∶0.15∶6.0∶0.2∶0.05，此時3類有害產物生成量最低。通過微觀結構和二級結構分析，證明了淀粉的影響原因在于其改變了蛋白質與單糖的接觸機會，形成空間位阻；此外，淀粉的添加在一定程度上改變了谷朊蛋白結構，進而影響了美拉德反應。本文為烘焙小麥制品配方選擇的安全性提供數據支持，并為如何減少美拉德反應潛在有害產物的生成提供了一定的理論依據。