轉谷氨酰胺酶為交聯劑固定化漆酶及其在蘋果汁澄清中的應用

魏勝華，湯中勛，張威，郭良昊

(安徽工程大學 生物與食品工程學院，安徽 蕪湖，241000)

多酚類物質是植物生長過程中合成的次級代謝產物，許多水果中富含多酚類成分，但在果汁的貯存期間，由于多酚類物質的存在，往往會導致果汁混濁和風味變化[1]。因此，在果汁的加工過程中往往需要降低其中多酚的含量以保持其在貯藏期間的澄清。目前，常采用明膠、膨潤土和硅藻土等作為吸附劑降低果汁中多酚的含量[2-4]。但是物理吸附處理時間長，吸附效果差，多酚殘量較高，導致果汁后期易變混濁[5]。

漆酶(laccase, E.C.1.10.3.2)是一種以銅離子為活性中心的多酚氧化酶，該酶能夠利用氧氣為最終電子受體，高效轉化偶氮類、酚類、甾體類和芳胺類等化合物形成醌類化合物、羰基化合物和水[6]。因此，利用漆酶的這一催化性能，可以有效地降低果汁中多酚的含量，使其貯藏期間依然保持澄清[7]。然而漆酶作為一種外源添加劑是不適宜留在果汁中的。將漆酶固定在載體上，不僅可以實現漆酶與果汁的有效分離，同時也能夠提高漆酶的穩定性，實現重復使用。大孔吸附樹脂是一種具有多孔立體結構、人工合成的高聚物，其穩定性好，常用于天然產物中活性成分的分離提取[8]。由于其具有較大的比表面積，該樹脂也經常被用作固定化酶的載體，通過范德華力、靜電吸引和氫鍵等分子間作用力對酶進行吸附，實現酶的固定化。但是單純的吸附容易使酶在反應過程中脫落，一般再輔以戊二醛作為交聯劑對酶蛋白進行交聯，以提高固定化酶的穩定性[9]。然而戊二醛有一定的毒性，因此將其應用在食品行業上具有潛在的危害性。轉谷氨酰胺酶(transglutaminase，TGase)可以催化蛋白質的谷氨酰胺殘基發生轉酰基的反應，能夠使蛋白質分子間形成共價交聯聚合。與戊二醛相比，TGase具有安全高效和生物相容性好的優點，已經運用在α-淀粉酶[10]、β-葡萄糖苷酶[11]和堿性磷脂酶[12]等酶的固定化中。本研究以大孔吸附樹脂AB-8為固定化的載體材料，利用TGase作為交聯劑，采用吸附-交聯法固定化漆酶，探究了影響酶固定化的因素和固定化酶的酶學性質，并且以蘋果汁為研究對象，考察了固定化漆酶在蘋果汁澄清中的作用，為拓寬漆酶在食品工業中的應用提供了新方法。

1 材料與方法

1.1 試劑與設備

蘋果，當地農貿市場；漆酶(酶活力25.5 U/mL)，本實驗室采用固態發酵法制得[13]；AB-8大孔吸附樹脂、果膠酶、淀粉酶，麥克林試劑有限公司；轉谷氨酰胺酶，江蘇一鳴生物有限公司；其他試劑，國藥集團上海試劑公司，均為分析純。

JYL-C022E榨汁機，山東九陽電器有限公司；754-PC紫外可見分光光度計，上海奧譜勒儀器有限公司；85-2恒溫磁力攪拌器，金壇市杰瑞爾電器有限公司；BHS-2恒溫水浴鍋，寧波市鄞州群安實驗儀器科技有限公司；ZQZY-78BN雙層恒溫振蕩培養箱，上海知楚儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 蘋果汁的制備

將蘋果洗干凈，放入-4 ℃冰箱中冷藏30 min，取出切成小塊用榨汁機攪碎勻漿，隨后將勻漿液加熱到100 ℃保持5 min，然后冷卻至約50 ℃，加入0.1%(體積分數)的果膠酶和淀粉酶酶解30 min，用紗布進行粗過濾，濾液在4 ℃、8 000 r/min下離心10 min，即得到蘋果汁原液，4 ℃冰箱中儲存待用。

1.2.2 漆酶的固定化

稱取1 g預處理后的樹脂加入到10 mL的漆酶溶液中，并在30 ℃，150 r/min恒溫振蕩水浴中吸附一定時間后，加入一定量的TGase溶液，并在30 ℃，150 r/min恒溫振蕩水浴中反應120 min，過濾并用緩沖液洗滌3次，用濾紙吸干水分后得到固定化酶，儲存在4 ℃的冰箱中待用。

1.2.3 酶活力和蛋白含量的測定

游離酶：取200 μL酶液，加入pH 4.0的醋酸鹽緩沖液800 μL，置于40 ℃水浴鍋中溫浴2 min，加入等體積0.8 mmol/L愈創木酚溶液繼續反應10 min，冰浴終止反應，立即在465 nm處測吸光度值的變化，酶活力定義為：在40 ℃下，1 mL酶液中1 min氧化1 μmol愈創木酚所需酶量為1個酶活力單位(U)。

固定化酶：取0.05 g固定化酶加入1 mL pH 4.0醋酸鹽緩沖液，置于40 ℃水浴鍋中溫浴2 min，加入等體積0.8 mmol/L愈創木酚溶液繼續反應10 min，冰浴終止反應，立即在465 nm處測吸光度值變化。酶活力定義為：在40 ℃下，1 g固定化漆酶1 min氧化1 μmol愈創木酚所需酶量即為1個酶活力單位(U)。

蛋白含量的測定以牛血清白蛋白為標準蛋白，采用Bradford法[14]。

1.2.4 固定化漆酶的酶學性質研究

1.2.4.1 最適pH值和最適溫度

最適pH值：固定化酶和游離酶分別在pH 3.0～8.0緩沖液中測定酶活力，考察其相對催化活力。

最適溫度：固定化酶和游離酶分別在30～70 ℃測定酶活力，考察其相對催化活力。

1.2.4.2 固定化酶pH和溫度耐受性

pH耐受性：固定化酶和游離酶分別放置在50 mmol/L、pH 3.0的檸檬酸-檸檬酸鈉和50 mmol/L、pH 8.0的磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉的緩沖液中，定時取樣測定酶活力，計算其剩余酶活力。

溫度耐受性：固定化酶和游離酶分別放置在80 ℃的條件下，定時取樣測定酶活力，計算其剩余酶活力。

1.2.5 蘋果汁的澄清

在250 mL三角瓶中裝入100 mL蘋果汁和1.0 g固定化酶，在35 ℃水浴鍋中以150 r/min振蕩反應180 min，中間過程定時取樣測定果汁中各項指標的變化。處理后的蘋果汁經過巴氏殺菌后，在25 ℃下放置14 d，考察蘋果汁總酚和濁度的變化。

總酚的測定采用Folin-酚顯色法[15]；濁度的測定采用分光光度法[16]，測定果汁640 nm處吸光值的變化。

1.2.6 數據處理

每個實驗重復3次，采用Origin 2018對實驗數據進行統計分析并作圖。

2 結果與分析

2.1 固定化過程的研究

2.1.1 吸附過程條件的選擇

大孔樹脂吸附對固定化影響的實驗結果如圖1所示。由圖1-a可以看出，pH 4.0時酶活力回收率最高，可能是在此pH條件下，蛋白的帶電狀態使其與樹脂上活性基團之間的吸附力最強；圖1-b顯示，最佳吸附溫度為30 ℃，酶活力回收率可以達到80.1%；圖1-c表明吸附的最佳時間是4 h，時間太短，吸附不夠徹底，但是時間過長，由于振蕩作用反而會使已經吸附上的酶脫落；由圖1-d可以看出，在樹脂含量一定的情況下，相對酶活力隨著加酶量的增加而增加，當加酶量為10 mL時達到平衡。

2.1.2 交聯條件的選擇

TGase對固定化影響的實驗結果如圖2所示。由圖2-a可以看出，隨著TGase用量的增加，酶活力回收率也隨之增加，但當用量超過200 U時，由于漆酶被過度交聯，使酶活性中心被覆蓋，致使酶活力回收率下降；圖2-b顯示，酶活力回收率在pH 4.0時達到最大。TGase可以在酶蛋白的谷氨酰胺殘基的γ-羧基與賴氨酸的ε-氨基之間形成肽鍵，文獻報道其最適pH一般是6.0～8.0[17-19]，但是在這個條件下，可能會對漆酶的活性產生不利的影響，因此pH 4.0是同時滿足TGase活性和漆酶活性保持最佳的平衡點；圖2-c顯示溫度對于固定化的影響，在20～30 ℃，酶活力回收率隨溫度而提高，當溫度高于30 ℃，酶活力回收率逐漸降低，這是因為溫度影響TGase的催化能力，進而影響漆酶的交聯度，導致酶活力回收率呈現先升高后降低的趨勢；圖2-d顯示了不同交聯時間對于固定化的影響，最適的交聯時間為2 h，時間過短會使吸附的酶分子未充分交聯而脫落使得固定化酶活力低，而時間過長可能使酶的結構剛性較強或者過度交聯使酶的活性中心被反應導致酶活力降低。

a-pH；b-溫度;c-吸附時間;d-漆酶量圖1 吸附過程對固定化的影響Fig.1 Effect of adsorption process on immobilization

a-TGase量；b-pH;c-溫度;d-交聯時間圖2 交聯過程對固定化的影響Fig.2 Effect of crosslinking process on immobilization

綜合以上實驗結果確定吸附的最佳條件是：pH 4.0、吸附溫度30 ℃、吸附時間4 h、漆酶的用量為10 mL/g樹脂；交聯的最佳條件是：pH 4.0、交聯溫度30 ℃、交聯時間2 h、TGase的用量為200 U/g樹脂。在此條件下制備的固定化酶的酶活力為210 U/g，酶活力回收率為82.5%。

2.2 固定化酶性質的研究

2.2.1 最適pH和最適溫度

分別測定不同pH值緩沖液體系中游離酶和固定化酶的酶活力，結果如圖3所示，游離酶最適pH值為4，固定化酶最適pH值為5，固定化酶最適pH值較游離酶偏大了1個單位。在很多情況下固定化載體材料的性質會改變固定化酶的微環境，從而促使酶的最適pH發生改變[20]。在30～70 ℃內考察酶的最適催化溫度，結果如圖4所示，游離酶最適溫度為50 ℃，固定化酶最適溫度為60 ℃，這可能是因為部分酶分子被固定在大孔樹脂的內部孔徑中，需要較高溫度增加底物擴散效應才能更好的與酶發生反應。

圖3 固定化酶的最適pH值Fig.3 Optimum pH value for immobilized enzyme

圖4 固定化酶的最適溫度Fig.4 Optimum temperature for immobilized enzyme

2.2.2 固定化酶的pH和熱穩定性

圖5顯示了游離酶和固定化酶在2種較為極端pH條件下酶活力的保留情況，可以看出，漆酶在酸性的條件下穩定性較好，在120 min時游離酶的剩余酶活力依然有60%，固定化酶的剩余酶活力為66.8%，而在pH 8.0的堿性條件下，游離酶的酶活力在短時間內降低很快，到了120 min基本消失，而固定化酶的酶活力降低較為緩慢，在最后仍然有13.6%的剩余酶活力。

圖5 固定化酶的pH穩定性Fig.5 pH stability of immobilized enzyme

將游離酶和固定化酶分別在80 ℃條件下放置，間隔一定時間取樣測定酶活力，考察游離酶和固定化酶的熱穩定性，結果如圖6所示，在120 min后游離酶剩余酶活力僅為5.3%，固定化酶剩余酶活力為36.6%，這表明固定后漆酶的熱穩定性得到了顯著改善。

圖6 固定化酶的溫度穩定性Fig.6 Temperature stability of immobilized enzyme

2.3 固定化酶澄清蘋果汁

圖7顯示了采用固定化漆酶處理蘋果汁的過程，考慮到大孔吸附樹脂本身也具有吸附多酚的能力，在實驗中將同等質量的樹脂作為對照。酶處理時間為180 min時，總酚去除率為78.1%，反應基本達到平衡。樹脂本身也可以吸附酚類物質，在一定程度上起到降低總酚含量的作用，但是起主要作用的還是固定化酶。該結果優于采用聚甲基丙烯酸甲酯為載體固定化漆酶45%的去除率[21]，主要原因是聚甲基丙烯酸甲酯對酚類物質沒有吸附作用，AB-8大孔樹脂通過吸附作用把多酚富集在漆酶的周圍，有利于酶的降解反應。重復實驗的結果如圖8所示，可以看出經過8個批次的反應，總酚的去除率依然保持在40%以上，降低的主要原因可能是降解總酚所產生的不溶性聚合物堵塞了樹脂孔徑或者覆蓋在酶的表面，影響了催化反應的進行。

圖7 固定化酶去除總酚的過程曲線Fig.7 Process curve of total phenol removal by immobilized enzyme

圖8 固定化酶重復使用性能Fig.8 Reusability of immobilized enzyme

將經固定化酶處理后的蘋果汁巴氏殺菌后放置在25 ℃考察其穩定性，并將沒有經過酶處理的蘋果汁作為對照，實驗結果如圖9所示。隨著貯存時間延長，未處理的果汁中總酚含量逐漸降低，到第14天果汁中總酚含量降低了50%左右，這是由于總酚與果汁中的蛋白相結合形成了沉淀。沉淀的產生使果汁變渾濁，其濁度上升了20多倍，固定化酶處理后的果汁總酚含量較少，只有微量的沉淀產生，濁度僅比開始上升1倍多，肉眼基本不可見。可見，經過固定化漆酶處理后蘋果汁的穩定性有了極大地提高。

圖9 酶處理后蘋果汁的穩定性Fig.9 Stability of apple juice after enzymatic treatment

3 結論

首次將TGase作為交聯劑應用在漆酶的固定化中，在pH 4.0、吸附溫度30 ℃、吸附時間4 h、漆酶的用量為10 mL/g樹脂以及TGase用量為200 U/g樹脂、pH 4.0、交聯溫度30 ℃、交聯時間2 h條件下，吸附-交聯法制備的固定化酶的酶活力可達到210 U/g。

固定化漆酶對蘋果汁中的多酚類化合物具有良好的去除作用，總酚去除率為78.1%，連續使用8個批次后，去除率依然保持在40%以上。

通過對蘋果汁穩定性研究表明，在14 d的時間內，未處理的果汁濁度上升20多倍，而經過固定化酶處理后的果汁濁度僅上升1倍多，果汁基本保持澄清。本研究為果汁加工行業提供了一個保持果汁澄清的新方法。