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轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶為交聯(lián)劑固定化漆酶及其在蘋果汁澄清中的應(yīng)用

2021-11-17 09:56:46魏勝華湯中勛張威郭良昊
食品與發(fā)酵工業(yè) 2021年21期
關(guān)鍵詞:漆酶蘋果汁總酚

魏勝華,湯中勛,張威,郭良昊

(安徽工程大學(xué) 生物與食品工程學(xué)院,安徽 蕪湖,241000)

多酚類物質(zhì)是植物生長(zhǎng)過(guò)程中合成的次級(jí)代謝產(chǎn)物,許多水果中富含多酚類成分,但在果汁的貯存期間,由于多酚類物質(zhì)的存在,往往會(huì)導(dǎo)致果汁混濁和風(fēng)味變化[1]。因此,在果汁的加工過(guò)程中往往需要降低其中多酚的含量以保持其在貯藏期間的澄清。目前,常采用明膠、膨潤(rùn)土和硅藻土等作為吸附劑降低果汁中多酚的含量[2-4]。但是物理吸附處理時(shí)間長(zhǎng),吸附效果差,多酚殘量較高,導(dǎo)致果汁后期易變混濁[5]。

漆酶(laccase, E.C.1.10.3.2)是一種以銅離子為活性中心的多酚氧化酶,該酶能夠利用氧氣為最終電子受體,高效轉(zhuǎn)化偶氮類、酚類、甾體類和芳胺類等化合物形成醌類化合物、羰基化合物和水[6]。因此,利用漆酶的這一催化性能,可以有效地降低果汁中多酚的含量,使其貯藏期間依然保持澄清[7]。然而漆酶作為一種外源添加劑是不適宜留在果汁中的。將漆酶固定在載體上,不僅可以實(shí)現(xiàn)漆酶與果汁的有效分離,同時(shí)也能夠提高漆酶的穩(wěn)定性,實(shí)現(xiàn)重復(fù)使用。大孔吸附樹(shù)脂是一種具有多孔立體結(jié)構(gòu)、人工合成的高聚物,其穩(wěn)定性好,常用于天然產(chǎn)物中活性成分的分離提取[8]。由于其具有較大的比表面積,該樹(shù)脂也經(jīng)常被用作固定化酶的載體,通過(guò)范德華力、靜電吸引和氫鍵等分子間作用力對(duì)酶進(jìn)行吸附,實(shí)現(xiàn)酶的固定化。但是單純的吸附容易使酶在反應(yīng)過(guò)程中脫落,一般再輔以戊二醛作為交聯(lián)劑對(duì)酶蛋白進(jìn)行交聯(lián),以提高固定化酶的穩(wěn)定性[9]。然而戊二醛有一定的毒性,因此將其應(yīng)用在食品行業(yè)上具有潛在的危害性。轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(transglutaminase,TGase)可以催化蛋白質(zhì)的谷氨酰胺殘基發(fā)生轉(zhuǎn)酰基的反應(yīng),能夠使蛋白質(zhì)分子間形成共價(jià)交聯(lián)聚合。與戊二醛相比,TGase具有安全高效和生物相容性好的優(yōu)點(diǎn),已經(jīng)運(yùn)用在α-淀粉酶[10]、β-葡萄糖苷酶[11]和堿性磷脂酶[12]等酶的固定化中。本研究以大孔吸附樹(shù)脂AB-8為固定化的載體材料,利用TGase作為交聯(lián)劑,采用吸附-交聯(lián)法固定化漆酶,探究了影響酶固定化的因素和固定化酶的酶學(xué)性質(zhì),并且以蘋果汁為研究對(duì)象,考察了固定化漆酶在蘋果汁澄清中的作用,為拓寬漆酶在食品工業(yè)中的應(yīng)用提供了新方法。

1 材料與方法

1.1 試劑與設(shè)備

蘋果,當(dāng)?shù)剞r(nóng)貿(mào)市場(chǎng);漆酶(酶活力25.5 U/mL),本實(shí)驗(yàn)室采用固態(tài)發(fā)酵法制得[13];AB-8大孔吸附樹(shù)脂、果膠酶、淀粉酶,麥克林試劑有限公司;轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶,江蘇一鳴生物有限公司;其他試劑,國(guó)藥集團(tuán)上海試劑公司,均為分析純。

JYL-C022E榨汁機(jī),山東九陽(yáng)電器有限公司;754-PC紫外可見(jiàn)分光光度計(jì),上海奧譜勒儀器有限公司;85-2恒溫磁力攪拌器,金壇市杰瑞爾電器有限公司;BHS-2恒溫水浴鍋,寧波市鄞州群安實(shí)驗(yàn)儀器科技有限公司;ZQZY-78BN雙層恒溫振蕩培養(yǎng)箱,上海知楚儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蘋果汁的制備

將蘋果洗干凈,放入-4 ℃冰箱中冷藏30 min,取出切成小塊用榨汁機(jī)攪碎勻漿,隨后將勻漿液加熱到100 ℃保持5 min,然后冷卻至約50 ℃,加入0.1%(體積分?jǐn)?shù))的果膠酶和淀粉酶酶解30 min,用紗布進(jìn)行粗過(guò)濾,濾液在4 ℃、8 000 r/min下離心10 min,即得到蘋果汁原液,4 ℃冰箱中儲(chǔ)存待用。

1.2.2 漆酶的固定化

稱取1 g預(yù)處理后的樹(shù)脂加入到10 mL的漆酶溶液中,并在30 ℃,150 r/min恒溫振蕩水浴中吸附一定時(shí)間后,加入一定量的TGase溶液,并在30 ℃,150 r/min恒溫振蕩水浴中反應(yīng)120 min,過(guò)濾并用緩沖液洗滌3次,用濾紙吸干水分后得到固定化酶,儲(chǔ)存在4 ℃的冰箱中待用。

1.2.3 酶活力和蛋白含量的測(cè)定

游離酶:取200 μL酶液,加入pH 4.0的醋酸鹽緩沖液800 μL,置于40 ℃水浴鍋中溫浴2 min,加入等體積0.8 mmol/L愈創(chuàng)木酚溶液繼續(xù)反應(yīng)10 min,冰浴終止反應(yīng),立即在465 nm處測(cè)吸光度值的變化,酶活力定義為:在40 ℃下,1 mL酶液中1 min氧化1 μmol愈創(chuàng)木酚所需酶量為1個(gè)酶活力單位(U)。

固定化酶:取0.05 g固定化酶加入1 mL pH 4.0醋酸鹽緩沖液,置于40 ℃水浴鍋中溫浴2 min,加入等體積0.8 mmol/L愈創(chuàng)木酚溶液繼續(xù)反應(yīng)10 min,冰浴終止反應(yīng),立即在465 nm處測(cè)吸光度值變化。酶活力定義為:在40 ℃下,1 g固定化漆酶1 min氧化1 μmol愈創(chuàng)木酚所需酶量即為1個(gè)酶活力單位(U)。

蛋白含量的測(cè)定以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白,采用Bradford法[14]。

1.2.4 固定化漆酶的酶學(xué)性質(zhì)研究

1.2.4.1 最適pH值和最適溫度

最適pH值:固定化酶和游離酶分別在pH 3.0~8.0緩沖液中測(cè)定酶活力,考察其相對(duì)催化活力。

最適溫度:固定化酶和游離酶分別在30~70 ℃測(cè)定酶活力,考察其相對(duì)催化活力。

1.2.4.2 固定化酶pH和溫度耐受性

pH耐受性:固定化酶和游離酶分別放置在50 mmol/L、pH 3.0的檸檬酸-檸檬酸鈉和50 mmol/L、pH 8.0的磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉的緩沖液中,定時(shí)取樣測(cè)定酶活力,計(jì)算其剩余酶活力。

溫度耐受性:固定化酶和游離酶分別放置在80 ℃的條件下,定時(shí)取樣測(cè)定酶活力,計(jì)算其剩余酶活力。

1.2.5 蘋果汁的澄清

在250 mL三角瓶中裝入100 mL蘋果汁和1.0 g固定化酶,在35 ℃水浴鍋中以150 r/min振蕩反應(yīng)180 min,中間過(guò)程定時(shí)取樣測(cè)定果汁中各項(xiàng)指標(biāo)的變化。處理后的蘋果汁經(jīng)過(guò)巴氏殺菌后,在25 ℃下放置14 d,考察蘋果汁總酚和濁度的變化。

總酚的測(cè)定采用Folin-酚顯色法[15];濁度的測(cè)定采用分光光度法[16],測(cè)定果汁640 nm處吸光值的變化。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,采用Origin 2018對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 固定化過(guò)程的研究

2.1.1 吸附過(guò)程條件的選擇

大孔樹(shù)脂吸附對(duì)固定化影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。由圖1-a可以看出,pH 4.0時(shí)酶活力回收率最高,可能是在此pH條件下,蛋白的帶電狀態(tài)使其與樹(shù)脂上活性基團(tuán)之間的吸附力最強(qiáng);圖1-b顯示,最佳吸附溫度為30 ℃,酶活力回收率可以達(dá)到80.1%;圖1-c表明吸附的最佳時(shí)間是4 h,時(shí)間太短,吸附不夠徹底,但是時(shí)間過(guò)長(zhǎng),由于振蕩作用反而會(huì)使已經(jīng)吸附上的酶脫落;由圖1-d可以看出,在樹(shù)脂含量一定的情況下,相對(duì)酶活力隨著加酶量的增加而增加,當(dāng)加酶量為10 mL時(shí)達(dá)到平衡。

2.1.2 交聯(lián)條件的選擇

TGase對(duì)固定化影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。由圖2-a可以看出,隨著TGase用量的增加,酶活力回收率也隨之增加,但當(dāng)用量超過(guò)200 U時(shí),由于漆酶被過(guò)度交聯(lián),使酶活性中心被覆蓋,致使酶活力回收率下降;圖2-b顯示,酶活力回收率在pH 4.0時(shí)達(dá)到最大。TGase可以在酶蛋白的谷氨酰胺殘基的γ-羧基與賴氨酸的ε-氨基之間形成肽鍵,文獻(xiàn)報(bào)道其最適pH一般是6.0~8.0[17-19],但是在這個(gè)條件下,可能會(huì)對(duì)漆酶的活性產(chǎn)生不利的影響,因此pH 4.0是同時(shí)滿足TGase活性和漆酶活性保持最佳的平衡點(diǎn);圖2-c顯示溫度對(duì)于固定化的影響,在20~30 ℃,酶活力回收率隨溫度而提高,當(dāng)溫度高于30 ℃,酶活力回收率逐漸降低,這是因?yàn)闇囟扔绊慣Gase的催化能力,進(jìn)而影響漆酶的交聯(lián)度,導(dǎo)致酶活力回收率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì);圖2-d顯示了不同交聯(lián)時(shí)間對(duì)于固定化的影響,最適的交聯(lián)時(shí)間為2 h,時(shí)間過(guò)短會(huì)使吸附的酶分子未充分交聯(lián)而脫落使得固定化酶活力低,而時(shí)間過(guò)長(zhǎng)可能使酶的結(jié)構(gòu)剛性較強(qiáng)或者過(guò)度交聯(lián)使酶的活性中心被反應(yīng)導(dǎo)致酶活力降低。

a-pH;b-溫度;c-吸附時(shí)間;d-漆酶量圖1 吸附過(guò)程對(duì)固定化的影響Fig.1 Effect of adsorption process on immobilization

a-TGase量;b-pH;c-溫度;d-交聯(lián)時(shí)間圖2 交聯(lián)過(guò)程對(duì)固定化的影響Fig.2 Effect of crosslinking process on immobilization

綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定吸附的最佳條件是:pH 4.0、吸附溫度30 ℃、吸附時(shí)間4 h、漆酶的用量為10 mL/g樹(shù)脂;交聯(lián)的最佳條件是:pH 4.0、交聯(lián)溫度30 ℃、交聯(lián)時(shí)間2 h、TGase的用量為200 U/g樹(shù)脂。在此條件下制備的固定化酶的酶活力為210 U/g,酶活力回收率為82.5%。

2.2 固定化酶性質(zhì)的研究

2.2.1 最適pH和最適溫度

分別測(cè)定不同pH值緩沖液體系中游離酶和固定化酶的酶活力,結(jié)果如圖3所示,游離酶最適pH值為4,固定化酶最適pH值為5,固定化酶最適pH值較游離酶偏大了1個(gè)單位。在很多情況下固定化載體材料的性質(zhì)會(huì)改變固定化酶的微環(huán)境,從而促使酶的最適pH發(fā)生改變[20]。在30~70 ℃內(nèi)考察酶的最適催化溫度,結(jié)果如圖4所示,游離酶最適溫度為50 ℃,固定化酶最適溫度為60 ℃,這可能是因?yàn)椴糠置阜肿颖还潭ㄔ诖罂讟?shù)脂的內(nèi)部孔徑中,需要較高溫度增加底物擴(kuò)散效應(yīng)才能更好的與酶發(fā)生反應(yīng)。

圖3 固定化酶的最適pH值Fig.3 Optimum pH value for immobilized enzyme

圖4 固定化酶的最適溫度Fig.4 Optimum temperature for immobilized enzyme

2.2.2 固定化酶的pH和熱穩(wěn)定性

圖5顯示了游離酶和固定化酶在2種較為極端pH條件下酶活力的保留情況,可以看出,漆酶在酸性的條件下穩(wěn)定性較好,在120 min時(shí)游離酶的剩余酶活力依然有60%,固定化酶的剩余酶活力為66.8%,而在pH 8.0的堿性條件下,游離酶的酶活力在短時(shí)間內(nèi)降低很快,到了120 min基本消失,而固定化酶的酶活力降低較為緩慢,在最后仍然有13.6%的剩余酶活力。

圖5 固定化酶的pH穩(wěn)定性Fig.5 pH stability of immobilized enzyme

將游離酶和固定化酶分別在80 ℃條件下放置,間隔一定時(shí)間取樣測(cè)定酶活力,考察游離酶和固定化酶的熱穩(wěn)定性,結(jié)果如圖6所示,在120 min后游離酶剩余酶活力僅為5.3%,固定化酶剩余酶活力為36.6%,這表明固定后漆酶的熱穩(wěn)定性得到了顯著改善。

圖6 固定化酶的溫度穩(wěn)定性Fig.6 Temperature stability of immobilized enzyme

2.3 固定化酶澄清蘋果汁

圖7顯示了采用固定化漆酶處理蘋果汁的過(guò)程,考慮到大孔吸附樹(shù)脂本身也具有吸附多酚的能力,在實(shí)驗(yàn)中將同等質(zhì)量的樹(shù)脂作為對(duì)照。酶處理時(shí)間為180 min時(shí),總酚去除率為78.1%,反應(yīng)基本達(dá)到平衡。樹(shù)脂本身也可以吸附酚類物質(zhì),在一定程度上起到降低總酚含量的作用,但是起主要作用的還是固定化酶。該結(jié)果優(yōu)于采用聚甲基丙烯酸甲酯為載體固定化漆酶45%的去除率[21],主要原因是聚甲基丙烯酸甲酯對(duì)酚類物質(zhì)沒(méi)有吸附作用,AB-8大孔樹(shù)脂通過(guò)吸附作用把多酚富集在漆酶的周圍,有利于酶的降解反應(yīng)。重復(fù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果如圖8所示,可以看出經(jīng)過(guò)8個(gè)批次的反應(yīng),總酚的去除率依然保持在40%以上,降低的主要原因可能是降解總酚所產(chǎn)生的不溶性聚合物堵塞了樹(shù)脂孔徑或者覆蓋在酶的表面,影響了催化反應(yīng)的進(jìn)行。

圖7 固定化酶去除總酚的過(guò)程曲線Fig.7 Process curve of total phenol removal by immobilized enzyme

圖8 固定化酶重復(fù)使用性能Fig.8 Reusability of immobilized enzyme

將經(jīng)固定化酶處理后的蘋果汁巴氏殺菌后放置在25 ℃考察其穩(wěn)定性,并將沒(méi)有經(jīng)過(guò)酶處理的蘋果汁作為對(duì)照,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖9所示。隨著貯存時(shí)間延長(zhǎng),未處理的果汁中總酚含量逐漸降低,到第14天果汁中總酚含量降低了50%左右,這是由于總酚與果汁中的蛋白相結(jié)合形成了沉淀。沉淀的產(chǎn)生使果汁變渾濁,其濁度上升了20多倍,固定化酶處理后的果汁總酚含量較少,只有微量的沉淀產(chǎn)生,濁度僅比開(kāi)始上升1倍多,肉眼基本不可見(jiàn)。可見(jiàn),經(jīng)過(guò)固定化漆酶處理后蘋果汁的穩(wěn)定性有了極大地提高。

圖9 酶處理后蘋果汁的穩(wěn)定性Fig.9 Stability of apple juice after enzymatic treatment

3 結(jié)論

首次將TGase作為交聯(lián)劑應(yīng)用在漆酶的固定化中,在pH 4.0、吸附溫度30 ℃、吸附時(shí)間4 h、漆酶的用量為10 mL/g樹(shù)脂以及TGase用量為200 U/g樹(shù)脂、pH 4.0、交聯(lián)溫度30 ℃、交聯(lián)時(shí)間2 h條件下,吸附-交聯(lián)法制備的固定化酶的酶活力可達(dá)到210 U/g。

固定化漆酶對(duì)蘋果汁中的多酚類化合物具有良好的去除作用,總酚去除率為78.1%,連續(xù)使用8個(gè)批次后,去除率依然保持在40%以上。

通過(guò)對(duì)蘋果汁穩(wěn)定性研究表明,在14 d的時(shí)間內(nèi),未處理的果汁濁度上升20多倍,而經(jīng)過(guò)固定化酶處理后的果汁濁度僅上升1倍多,果汁基本保持澄清。本研究為果汁加工行業(yè)提供了一個(gè)保持果汁澄清的新方法。

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