基于數據挖掘和網絡藥理學探討桑椹治療女性不孕癥的用藥規律和作用機制

曹禮慧，馮森玲，袁中文，劉麗娟

(廣東省產科重大疾病重點實驗室，廣州醫科大學附屬第三醫院 藥學部，廣東 廣州 510150)

世界衛生組織定義不孕癥為規律性生活、未采取任何避孕措施至少1年仍未受孕。不孕的原因可能在女方、男方或男女雙方。由于社會不斷發展，現代女性生活和工作壓力不斷增大，女性不孕癥的發病率逐年升高，作為一種特殊的生殖健康缺陷，備受關注。現代醫學認為女性不孕癥主要有排卵障礙、輸卵管阻塞或不暢、子宮問題、宮頸問題等原因，中醫學則認為腎氣虧虛，沖任氣血失調可能是導致不孕癥發生的原因，故按照不同的病因病機，中醫將不孕癥分為腎氣虛型、腎陽虛型、腎陰虛型、肝郁型、痰郁型、血郁型等證型[1]。治療不孕癥的藥物和方法層出不窮，其中《黃帝內經》闡述不孕的機理為“腎氣衰，天癸竭，地道不通，故形壞而無子”，因此中醫認為女子受孕需具備三個條件：腎精充足，肝血充盛；胞絡通暢；胞宮寒溫適度。

桑椹記載于《中國藥典》[2](2020年版)，為桑科植物桑的干燥果穗，具有滋陰補血、生津潤燥的功效，用于肝腎陰虛、眩暈耳鳴、心悸失眠、須發早白、津傷口渴、內熱消渴、腸燥便秘。為常用的補肝腎中藥，既可入藥，又可食用，具有良好的滋補功效[3]。研究表明[4]，桑椹含有豐富的營養物質，其中蛋白質對于調節生理功能、維持新陳代謝發揮重要作用，一定的糖類是促進機體生長發育不可替代的物質，適量的酸類對于調節酸堿平衡必不可少。同時，桑椹還含有豐富的礦物質，其中鉀含量最高，在維持神經和肌肉活動及腎上腺方面發揮重要作用，而鋅可以調節血糖代謝與維持性功能。桑椹營養豐富，現代藥理學研究發現[5]，桑椹具有提高免疫力、改善睡眠、延緩衰老、抗氧化、抗感染、降血糖、降血脂等作用[6，7]。

1 資料與方法

1.1 處方來源及篩選

檢索我院2019年7月-2019年12月含桑椹的女性不孕癥中藥處方。檢索關鍵詞為“桑椹”“不孕癥”。納入標準：①處方診斷包含女性不孕癥；②處方用藥信息完整。排除標準：①重復處方，只記錄一次；②外用處方；③錄入錯誤等不規范處方。

1.2 數據處理

參照對中藥名稱、藥物類別、性味歸經等，按照《中國藥典》(2020年版)、地方炮制規范和執行標準進行規范收錄內容進行規范化處理。

1.3 統計學分析

運用Excel 2013對納入數據建立數據庫，對藥物類別、藥物味數和性味歸經進行描述性分析。運用SPSS Statistics 21.0進行聚類分析，SPSS Modeler 18.0進行關聯規則分析，網絡藥理學方法收集中藥的活性成分、靶點以及疾病靶點，將中藥與疾病的交集靶點導入Cytoscape軟件(https：//cytoscape.org/)繪制“疾病-中藥-活性成分-靶點”網絡圖，運用Metascape數據庫(http：//metascape.org/gp/index.html#/main/step1)進行GO和KEGG富集分析。

2 結果

2.1 納入處方情況

納入處方354張，涉及175味中藥，其中按照藥物類別可分為15類，其中補虛藥(42味)、清熱藥(25味)、利水滲濕藥(15味)、活血化瘀藥(15味)、理氣藥(14味)、收澀藥(11味)、解表藥(11味)等。頻數最多的有補虛藥(2 175次，56.13%)、祛風濕藥(314次，8.10%)、活血化瘀藥(266次，6.86%)、收澀藥(249次，6.43%)等。具體見表1、圖1。

2.2 高頻中藥性味歸經及頻數統計

對175味中藥進行頻數分析，頻數共2 193次，其中≥30次的高頻中藥有33味，如桑椹、女貞子、菟絲子、金櫻子等。藥性頻數共2 913次，以溫(963次，33.06%)、平(929次，31.89%)為主；藥味頻數共計5 411次，藥味以甘(2 530次，46.76%)、苦(1 147次，21.20%)和辛(780次，14.42%)為主；含10種歸經，累計頻數7 009次，其中以腎經(2 184次，31.16%)、肝經(2 155 次，30.75%)為主。具體見表2、圖2。

圖2 桑椹治療女性不孕癥處方高頻藥物性味歸經統計

2.3 高頻中藥聚類分析

運用SPSS Statistics 21.0軟件對高頻中藥采用組間連接的方法進行聚類分析，如圖3。可分為7類，類1：天山雪蓮、紅芪、桑寄生、艾葉、狗脊、黑豆衣、續斷、大棗、紅景天、香附、淫羊藿、杜仲；類2：金櫻子、茺蔚子、女貞子；類3：菟絲子、沙苑子、枸杞子、秦艽、太子參、鹿角膠、白及、山茱萸、茯神；類4：熟地黃、當歸、山藥、葛根、天冬；類5：白術、茯苓；類6：桑椹；類7：益母草。

圖3 桑椹治療女性不孕癥處方高頻藥物聚類分析譜系

2.4 高頻中藥關聯規則分析

對高頻中藥采用SPSS Modeler 18.0軟件進行關聯規則分析，運用Apriori算法，設置最小支持度30%，最小置信度80%，最大前項數為2時，輸出關聯規則見表3，網絡化展示如圖4。其中二項關聯主要有桑椹-女貞子；三項關聯主要有桑椹-菟絲子-女貞子等。

表3 桑椹治療女性不孕癥處方的關聯規則

圖4 高頻藥物關聯網絡化展示

2.5 核心藥物治療女性不孕癥的網絡藥理學

基于數據挖掘，桑椹-菟絲子-女貞子可能為治療女性不孕癥的核心藥物。運用TCMSP數據庫檢索核心藥物的活性成分和作用靶點，設置口服生物利用度(OB)≥30%以及類藥性(DL)≥0.18，共篩選出30個化合物、98個作用靶點。通過GeneCards 數據庫獲得女性不孕癥3983個靶點。運用Venny 2.1得到核心藥物與女性不孕癥的交集靶點66個。將交集靶點輸入STRING 11.0在線數據庫進行蛋白相互作用分析，物種選擇“Homo sapiens”，隱藏散在靶點，其他參數保持默認設置，將蛋白相互作用的數據導入Cytoscape軟件中，利用Cytoscape的CytoHubba中Maximal Clique Centrality(MCC)拓撲分析方法確定關鍵靶點有JUN、TNF、IL-6、IL-1β、IL-2、IFN-γ、TP53、CCL2、MAPK14、VEGFA。運用Cytoscape 軟件繪制“疾病-中藥-活性成分-靶點”，如圖5。使用Metascape數據庫對66個交集靶點進行GO功能富集和KEGG通路富集分析，GO分析得到1 183條生物過程(Biological process，BP)，主要涉及活性氧代謝過程、細胞對氧化應激的反應、氧化應激反應等生物過程；KEGG通路富集得到243條信號通路，主要涉及癌癥通路、流體剪切應力和動脈粥樣硬化、糖尿病并發癥的AGE-RAGE的信號通路等通路。兩者富集的氣泡圖(前20條)如圖6、圖7。

圖5 “疾病-中藥-活性成分-靶點”網絡

圖6 GO富集分析的生物過程條目氣泡圖

圖7 KEGG通路富集氣泡圖

3 討論

3.1 基于描述性分析探討桑椹治療女性不孕癥的用藥特點

從藥物類別及高頻中藥來看，多用補虛藥，其次是清熱藥、利水滲濕藥、活血化瘀藥等。而頻數≥30次的中藥有33味，超過100次的分別有桑椹、女貞子、菟絲子、金櫻子、沙苑子、茺蔚子、山藥、桑寄生。補虛藥主治氣虛證、陽虛證、血虛證和陰虛證，臨床多為幾種虛證并存，需將兩類及兩類以上補虛藥配伍使用，其中補氣藥多補脾氣、肺氣和心氣等，如山藥，具有補脾養胃，生津益肺，補腎澀精的功效，臨床用于脾虛證、肺虛證和腎虛證，能夠補后天有助于充養先天，補腎名方多含有山藥；補陽藥主入腎經，能補一身之元陽，主要適用腎陽不足之宮冷不孕等，如菟絲子和沙苑子均具有補腎固精之功效，菟絲子為常用補腎中藥，常用于腎虛、腰膝酸軟等病癥，其藥理作用有增強免疫力、降血糖、抗氧化[8]等；補血藥主入心肝血分，肝血虧虛，精血不足，腎中之精不能得肝血以充盈，從而導致不孕癥[9]；補陰藥能滋養肝腎之陰，如桑椹、女貞子等，桑椹和女貞子都具有延緩衰老、抑菌等作用[10、11]。而桑寄生作為祛風濕藥具有祛風濕、補肝腎、強筋骨、安胎元之功效；金櫻子作為收澀藥用于治療遺精滑精，遺尿尿頻，崩漏帶下，久瀉久痢；茺蔚子作為活血化瘀藥能夠活血調經，歸心包、肝經。因此，桑椹配伍補虛藥山藥、菟絲子、沙苑子、女貞子以及祛風濕藥桑寄生、收澀藥金櫻子和活血化瘀藥茺蔚子等均表明有良好的治療女性不孕癥的作用。

從中藥性味歸經分析，桑椹治療女性不孕癥藥性以溫性與平性較高，體現了女性不孕癥的致病因素以寒邪為主，如《本草綱目》中提到“久則子宮冷，自不孕矣”。藥味則以甘、苦和辛為主，研究發現，甘味藥[12]能通過補益作用治療虛損病癥，以入肝、肺、腎、胃經為主；苦味藥[13-14]具有理氣寬中、活血化瘀、祛風除濕、清熱解毒等功效，多入肝、肺、胃經；《黃帝內經》“肝欲散，急食辛以散之，以辛補之”，《素問·藏氣法時論》“腎苦燥，急食辛以潤之，開腠理，致津液，通氣也”，兩者體現了辛味藥[15]能散、能潤的特點。歸經方面，肝疏泄失常，氣機不暢，沖任二脈失和，女性可出現月經紊亂，甚至痛經、閉經和不孕。肝血不足，則月經量少，甚則閉經等；腎的主要功能是主生長發育和生殖，若腎中精氣虧損，女性則表現為不孕等病癥，肝郁影響腎氣而至腎虛，腎虛產生肝郁，治療女性不孕癥應把肝腎同治作為基本原則[16]。本研究中桑椹治療女性不孕癥處方中各中藥主入肝經和腎經，對肝、腎有特殊的親和作用。

3.2 基于聚類分析探討桑椹治療女性不孕癥的用藥特點

高頻中藥系統聚類采用組間聯接方法得到7類。多為經典方劑如四物湯、八珍湯、六味地黃湯等重要組成成分。其中類1主要為補虛藥和祛風濕藥、止血藥等；類2為補虛藥、收澀藥、活血化瘀藥；類3為補虛藥、止血藥、收澀藥、祛風濕藥、利水滲濕藥；類4為補虛藥；類5為補虛藥、利水滲濕藥；類6為補虛藥；類7為活血化瘀藥。可見，聚類分析中各類中藥物主要為補虛藥，與藥物類別結果一致。

3.3 基于關聯規則的網絡藥理學機制分析

從關聯規則和網絡藥理學藥對分析，支持度高的核心藥對二項關聯有桑椹-女貞子、桑椹-菟絲子、桑椹-金櫻子，三項關聯支持度較高的是桑椹-菟絲子-女貞子。由此可以看出，桑椹治療女性不孕癥核心藥物可能是桑椹-菟絲子-女貞子。將核心藥物進行網絡藥理學分析發現，其治療女性不孕癥的活性成分可能為槲皮素、山柰酚、芝麻素、異鼠李素、β-谷甾醇、桑黃素、木犀草素、β-胡蘿卜素、圣草素等17種活性成分。有文獻報道，槲皮素能緩解多柔比星誘導的雌性不孕[17]，能夠改善卵巢早衰[18]，對孕鼠子宮內膜損傷具有保護作用[19]；木犀草素能有效抑制卵巢過度刺激綜合征大鼠卵巢組織的炎癥反應及血管通透性[20]；克羅米芬聯合β-胡蘿卜素對精索靜脈曲張伴不育高位結扎術后的精子質量和性激素水平改善明顯，提高了手術效果，增加了受孕率[21]。JUN、TNF、IL-6、IL-1β、IL-2、IFN-γ、TP53、CCL2、MAPK14、VEGFA為核心藥物治療女性不孕癥的關鍵靶點，IL-6可能通過胰島素抵抗及慢性炎癥協同作用在多囊卵巢疾病中發揮作用[22]，TNF、IL-1β、IFN-γ為促炎因子，影響了全身炎癥反應，從而影響卵巢功能[23]。GO分析證實了核心藥物對活性氧代謝過程、細胞對氧化應激的反應、氧化應激反應、有毒物質的反應等生物過程有一定的影響，KEGG富集分析證實了核心藥物對癌癥通路、流體剪切應力和動脈粥樣硬化、糖尿病并發癥的AGE-RAGE的信號通路等有調控作用。

通過數據挖掘和網絡藥理學研究發現，桑椹治療女性不孕癥處方，多配伍補虛藥，如女貞子、菟絲子、沙苑子、山藥等，藥性以溫、平為主，藥味以甘、苦為主，多歸肝經和腎經。核心藥物可能是桑椹-菟絲子-女貞子，其治療女性不孕癥具有多成分、多靶點、多通路的作用機制。