基于高分辨質譜數據分析技術的活性菌天然代謝產物研究

袁智鵬 盧國柱 毛 馨 劉慧慧 顏 碩 肖志明 李彥伸

（1.煙臺大學，山東煙臺264005；2.山東省海洋資源與環境研究院，山東煙臺264005；3.中國農業科學院農業質量標準與檢測技術研究所，北京100081）

高分辨質譜是一種先進的分析工具，被廣泛用于食品、衛生、醫藥領域[1]。高分辨質譜檢測通過獲得待測物的質荷比信息對未知成分進行更好的檢測和分析[2]。由于其高靈敏度和高分辨率，質譜分析經常用來表征和鑒定復雜的有機分子，特別是用于一些存在于復雜基體中的微量物質的檢測和一些非靶向檢測[3]。如今，由于高分辨質譜產生了很多高度特異性的鑒定，并且方便于研究人員回顧性分析一些未知物質的原始數據，高分辨質譜在檢測中的使用正變得越來越普遍[4]。

蠟樣芽孢桿菌屬芽孢桿菌科芽孢桿菌屬[5]。其有些菌株與很多同屬的菌株一樣（如枯草芽孢桿菌[6]、短短芽孢桿菌[7]），能夠分泌多種拮抗細菌、真菌和線蟲的活性物質，是預防植物病害、殺滅致病菌的有效活性菌[8]。比如有研究發現，蠟樣芽孢桿菌對番茄灰霉病菌[9]、枇杷果實炭疽病菌[10]、小麥全蝕病菌[11]、玉米穗腐敗病菌[12]、苜蓿腐爛病菌[13]等真菌性病害都有很強的抑制作用。蠟樣芽孢桿菌的抗菌效果，對于長久以來有效抗生素藥物的嚴重缺乏來說無疑是一個好消息。針對蠟樣芽孢桿菌在新藥研制、抗菌殺菌方面的研究日益增多，并取得了不小的成就。HU等[14]研究發現，當燦爛弧菌感染刺參時，其腸道菌群中的蠟樣芽孢桿菌的比例明顯增加，由此發現了蠟樣芽孢桿菌的強效的抗菌殺菌能力，之后他從日本沼蝦中分離得到一株能夠有效拮抗燦爛弧菌的蠟樣芽孢桿菌。ESTEFANíA等[15]從植物根際中分離出一株蠟樣芽孢桿菌，可以有效拮抗玉米的主要病原真菌擬輪枝鐮孢菌。從微生物體內提取得到可供人類利用的天然產物[16]無疑是近幾年來新型抗生素藥物發掘的又一個新途徑，但是也面臨一個重要問題，那就是提取和純化工作相對復雜且成本較高，如果通過數據分析來省掉復雜且成本較高的先純化后檢測工作，直接得到有效物質的結構信息，那將大大提高新型藥物的研發效率，同時也對非靶向代謝產物的分析具有重要意義。近幾年由于科技的發展，大量的數據分析逐漸成為研究者實驗工作的必備技能。究其原因，一方面主要是因為實驗儀器的更新使得人們可以獲得更多層面的數據。另一方面，通過對相關數據的分析，可以避免一些較為繁瑣復雜的試驗，僅僅通過數據便可以獲得想要的結果。

數據的獲得通過高分辨質譜可以實現，但數據的分析則需要新的數據分析軟件來支持。MZmine是一種用于處理質譜數據的開源軟件，主要針對液相色譜－質譜聯用儀（LC－MS）數據的處理，幾乎涵蓋了LC－MS數據分析處理的整個流程，可去除大量無用的峰從而得到更有價值的分析結果，適合大批量的數據分析[17]。它的起源是2006年生物信息學出版物中描述的一個MZmine工具箱，后來經過多次重新編寫和設計[18]，在非靶向代謝組學分析中具有廣泛的應用。全球天然產物社會分子網絡（Global Natural Products Social Molecular Networking，GNPS）是一個基于網絡的質譜生態系統，旨在成為一個開放獲取的知識庫，供社區組織共享、加工和鑒定串聯質譜原始數據[19～20]。GNPS在天然產物研究領域中的影響不亞于Genbank和Basic Local Alignment Search Tool（BLAST）在DNA和RNA序列領域中的影響[21]。

本文旨在建立一種快速確定活性菌特異性天然產物的方法，主要是基于高分辨質譜數據分析活性菌的代謝產物差異，獲得活性菌所產抗菌物質的信息。以提取出的活性菌抗菌物質作為依托，驗證該方法的可行性。通過對活性菌單獨培養、致病菌單獨培養（選用大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的標準菌株作為指示菌）、活性菌和致病菌混合培養3種狀態的菌株代謝產物進行匯總分析和差異比較，經組間的差異分析得到活性菌特異性的代謝產物分子信息。將該代謝產物的一二級質譜信息與提取得到的抗菌物質的一二級質譜信息進行對應，以此對所鑒定的抗菌物質進行確定，證明通過數據處理、差異分析確定活性菌的抗菌物質的可行性。

一、材料與方法

（一）材料與試劑所用到的細菌標準菌株有：大腸桿菌Escherichia coliATCC25922、金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureusATCC29213，均由中國農業大學惠贈。

活性菌C2－4、活性菌21－1－1－2，分離自山東煙臺土壤中，均為蠟樣芽孢桿菌，對ATCC25922、ATCC29213均具有抑菌作用。

腦心浸出液（BHI）瓊脂培養基、腦心浸出液（BHI）肉湯，北京陸橋技術股份有限公司；乙酸乙酯、甲醇、氯仿、硫酸銨，國藥集團化學試劑有限公司。

（二）儀器與設備SW－CJ－2DX型雙人單面超凈工作臺，蘇州凈化設備有限公司；D－1－70型自動控制壓力蒸汽滅菌鍋，北京發恩科貿有限公司；電子天平，上海舜宇恒平科學儀器有限公司；SHH－250L生化培養箱，重慶永生實驗儀器廠；RE 5298A旋轉蒸發器，上海亞榮生化儀器廠；SHZ－D（Ⅲ）循環水式真空泵，鞏義市予華儀器有限責任公司；H2050R醫用離心機，長沙湘儀離心機儀器有限公司；恒溫水浴振蕩器，北京市永光明醫療儀器有限公司；渦旋混合器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；KQ5200E型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；空氣泵－氮吹儀，杭州米歐有限公司；Model12300制備液相色譜，美國SSI公司；QExactive HF組合型四極桿Orbitrap質譜儀，美國Thermo公司。

（三）固體培養基中次級代謝產物的提取方法

1.菌株復蘇及種子液制備。用一次性接種環蘸取活性菌和指示菌菌液在BHI固體平板三區劃線，將平板置于37℃恒溫培養箱內培養12 h。用滅菌后的牙簽挑取劃線復蘇后平板上的單菌落，將其接種在裝有1 mL BHI液體肉湯培養基的2 mL離心管中，置于搖床恒溫培養6～8 h。搖床培養條件為溫度37℃，轉速210 r/min。

2.活性菌抗菌活性的驗證。采用雙層瓊脂平板法[22]驗證。用移液槍吸取10μL活性菌菌液點接在BHI固體培養基上，使菌液在平板上形成一個直徑約為1 cm的菌點，倒置培養過夜。向高壓滅菌后還未凝結的上層肉湯培養基內加入指示菌種子液，比例為1∶1 000，搖勻后緩緩倒入已接種活性菌的平板，待上層培養基晾干，將平板倒置于37℃恒溫培養箱內培養過夜。次日觀察結果，出現抑菌圈即證明活性菌具有抗菌活性。

3.待提取平板的制備。（1）單菌培養平板的制備：用移液槍分別吸取活性菌C2－4、活性菌21－1－1－2、ATCC25922、ATCC29213的種子液各200μL，點接在BHI固體培養基上，用無菌棉棒涂抹均勻。在37℃恒溫培養箱內倒置培養3 d。（2）混合培養平板的制備：以活性菌抑菌實驗的雙層瓊脂平板繼續培養3 d作為混合培養平板。（3）以不接種任何菌種的BHI平板作為空白對照，每個平板設置3個平行。

4.次級代謝產物的提取。（1）平板打孔：用無菌的1 000μL移液槍槍頭在長滿菌的固體平板上打孔，單菌培養平板和空白平板分別均勻打孔3～5個，混合培養平板在活性菌的抑菌圈范圍內打孔3～5個。用無菌牙簽挑取打孔處瓊脂塊分裝至10 mL離心管中，置于4℃條件下避光保存。（2）提取次級代謝產物：向每個含有瓊脂塊的離心管中分別加入4 mL乙酸乙酯并充分渦旋混勻，30℃下超聲30 min。再次充分渦旋混勻后，將離心管在室溫下水浴振蕩30 min。振蕩結束后，用移液槍將上清液取出并轉移至新的10 mL離心管中，繼續向含有瓊脂塊的離心管中加入4 mL氯仿。重復上述步驟，將氯仿提取后的上清液與乙酸乙酯提取的上清液合并。合并后的提取液進行氮吹至近干。向提取物中加入75%的甲醇復溶。充分渦旋混勻后將該提取液在4℃下14 000 r/min離心20 min。離心后的上清液經0.45μm濾膜過濾后轉移至進樣小瓶中，再次充分渦旋混勻。將進樣小瓶置于－20℃條件下避光保存，以備檢測。

（四）液體培養基中次級代謝產物的提取方法

1.待提取液的制備。（1）單菌培養液的制備：將活性菌C2－4、活性菌21－1－1－2、ATCC25922、ATCC29213的種子液分別按照1‰的比例接種至新的BHI肉湯培養基內，然后置于37℃恒溫振蕩培養箱內培養20 h。（2）混合培養液的制備：將兩株活性菌與兩株指示菌種子液分別等體積混合，按照1‰的接種量接種至新的BHI肉湯培養基內，置于37℃恒溫振蕩培養箱內培養20 h。（3）以不接種任何菌種的BHI肉湯培養基作為空白對照，且每個培養液設置3個平行。

2.次級代謝產物的提取。待提取液在恒溫振蕩培養箱內培養20 h時，用移液槍從待提取液中取出100μL菌液，然后加入900μL50%甲醇（先加入450μL甲醇，充分渦旋混勻，后再加入450μL水），充分渦旋混勻。將該提取液在4℃下14 000 r/min離心20 min。離心后的上清液經0.45μm濾膜過濾后轉移至進樣小瓶中，再次充分渦旋混勻。將進樣小瓶置于－20℃條件下避光保存，以備檢測。

（五）發酵液中抗菌物質的提取與純化方法發酵液中抗菌物質的提取與純化采用有機溶劑萃取法、葡聚糖凝膠層析法、制備型液相層析法[23]。將活性菌種子液按1∶1 000的比例加入高壓滅菌后的BHI肉湯培養基中，37℃恒溫培養20 h。將培養后的菌液離心，條件為25℃下10 000 r/min離心15 min。取出上清液，倒入1 L的分液漏斗中，加入等量的氯仿，振搖3～5 min，靜置分層。水相有機相分離后，將水相重新轉移至分液漏斗中，加入等量的氯仿，相同條件下進行二次萃取。兩次萃取后的有機相混合后，向其中加入約50 g的硫酸銨吸水，待有機相變得清澈透明后過濾至圓底燒瓶中（濾紙中提前加入適量硫酸銨），用旋轉蒸發儀在60℃、60 r/min條件下蒸發，至燒瓶內剩余1～2 mL時停止旋蒸。用玻璃吸管吸取剩余液體至進樣小瓶中（進樣小瓶提前稱量），然后使用空氣泵－氮吹儀吹干，同樣稱量。用甲醇復溶后保存至4℃條件下。使用Sephadex LH－20凝膠對萃取后的粗提物進行層析，用甲醇平衡層析柱，流速控制在1.2 mL/min，將粗提物過膜（0.45μm）后加入層析柱，使用甲醇作為洗脫溶劑，調節流速為0.6 mL/min，每5 min收集1管。活性菌C2－4共收集72管，活性菌21－1－1－2共收集76管。將洗脫液氮吹并稱量。將經過葡聚糖凝膠層析柱純化后的抗菌物質用制備型液相進行分離和進一步純化。使用的色譜柱為ODS制備型色譜柱（22 mm×250 mm，25μm），將樣品溶于甲醇中 （C2－4為12.4 mg/mL；21－1－1－2為16.1 mg/mL），經0.45μm的過濾器過濾后采用乙腈－水（20∶80，V∶V）等度洗脫，進樣量為500μL。檢測波長選擇210 nm，柱溫設定為25℃，流速為20 mL/min。根據不同的出峰時間，收集每個峰下的組分，分別蒸干后用甲醇復溶，以ATCC25922、ATCC29213作為指示菌進行抑菌實驗。有活性的濃縮液4℃條件下保存。

（六）抗菌物質及代謝產物的質譜數據采集用高效液相色譜串聯離子阱高分辨質譜對次級代謝產物及提取出的抗菌物質進行分析鑒定。液相條件為：色譜柱是Hypersil GOLDTMC18色譜柱 （100 mm×2.1 mm，1.9μm）；柱溫設定為25℃；采用梯度洗脫的方式，A相為含0.1%甲酸的水相，B相為含0.1%甲酸的乙腈。梯度洗脫程序為：0.0～1.0 min，5%的流動相B；1.0～3.0 min，5%～30%的流動相B；3.0～4.0 min，30%～40%的流動相B；4.0～5.5 min，40%～55%的流動相B；5.5～7.5 min，55%～95%的流動相B；7.5～9.0 min，95%～5%的流動相B；9.0～12.0 min，95%的流動相B。進樣量為5μL；流速為0.3 mL/min。

質譜檢測條件為：離子源參數為鞘氣的流速45 L/min；輔助氣的流速10 L/min；擋錐氣的流速0 L/min；電噴霧電壓3.5 kV；離子導管的溫度320℃；S－lens RF level設為60；離子源的溫度350℃。

采集的模式為正離子模式下的Full MSddMS2，其中Full MS的具體參數設置為：分辨率：17 500；AGC Target：1e6；Maximum IT：64 ms；Scan range：150～1 800 Da；Spectrum data type：profile。其中dd－MS2的具體參數設置為：分辨率：17 500；AGC Target：1e6；Maximum IT：64 ms；Loop count：15；Isolation window：1.2 Da；NCE：30、45；Scan range：200～2 000 Da；Spectrum data type：profile；dd Settings中，Minimum AGC：1.3e4；Exclude isotope：on；Dynamic exclusion：7.0 s。

（七）基于MZmine代謝產物質譜數據分析通過質譜數據采集，得到固體培養基和液體培養基兩種基質下活性菌C2－4、21－1－1－2和ATCC 25922、29213各菌株的代謝產物信息，以及混合培養狀態下的共同的代謝產物信息。通過MZmine數據分析軟件分析各組間的差異。使用“feature detection”中的 “Mass detection”功能設置檢測器，一級掃描的噪音等級設置為1.0e8，二級掃描的噪音等級設置為1.0e4。使用“feature detection”中的“Chromatogram builder”建立色譜峰，“Min time span（min）”設置為0.1；“Min height”設置為1.0e8；“m/ztolerance”設置為0.04m/z。使用“Feature detection”中的“Chromatogram deconvolution”進行色譜峰的分離，“Min peak height”設置為1.0e8；“Baseline level”設 置 為1.0e4。“m/zrange for MS2scan pairing”設置為0.02 Da；“RTrange for MS2scan pairing”設置為0.1。使用“Isotopes”中的“Isotopic peaks grouper”去除同位素峰，“m/ztolerance”設置為0.04m/z；“Retention time tolerance”設置為0.01；“Maximun charge”設置為3。使用“Alignment”中的“Join aligner”使所有特征峰根據保留時間和特征列表進行對齊，“m/ztolerance”設置為0.04m/z；“Weight form/z”設置為75；“Weight forRT”設置為25；“Retention time tolerance”設置為0.01。最后，導出包含完整一級質譜和二級質譜的特征文件用于GNPS分析。

二、結果與分析

（一）活性菌的抗菌活性圖1顯示了實驗中活性菌的抗菌活性結果，可以看出各平板均出現明顯的抑菌圈，表明活性菌21－1－1－2、C2－4對大腸桿菌 ATCC25922及金黃色葡萄球菌ATCC29213均有較強的抑制作用。

（二）次級代謝產物質譜數據分析實驗中將兩株指示菌分別與活性菌混合培養，但活性菌產生的抗菌物質并沒有因為指示菌的不同而有顯著區別。因此僅選取大腸桿菌作為指示菌進行混合培養時的代謝物差異來分析。以每種代謝物的質荷比作為X軸，以log10（兩組代謝物含量比值）作為Y軸，如log10[（A+1）/（B+1）]，其中A為混合培養組的峰面積，B為指示菌單獨培養組的峰面積，得到差異代謝物的散點圖（見圖2）。由散點圖可以明顯看出差異物質的質荷比分布及差異的倍數大小。圖2中，Y軸的單位2、4、6分別表示了差異的倍數102、104、106；－2、－4、－6即表示了差異的倍數為10－2、10－4、10－6。距離X軸越遠的點表示差異越大。

圖2 21－1－1－2（A）和C2－4（B）特異性代謝物散點圖

圖2中，X軸以上的點表示混合培養下代謝物含量明顯高于指示菌單獨培養時的代謝物含量（指示菌單獨培養下幾乎為0），即活性菌產生的特異性抗菌物質。X軸以下的點表示指示菌單獨培養時的代謝物含量明顯高于混合培養下的代謝物含量（混合培養下幾乎為0），即為指示菌正常生長所必須的某種物質。由圖2可見，活性菌21－1－1－2和C2－4的差異顯著的點的質量數均主要分布在150～600之間。

結合散點圖及色譜峰圖中各峰形的優劣，選取峰形優秀的差異代謝物進行分析。將固體基質和液體基質培養下的活性菌的特異性代謝產物分析結果合并，得到的活性菌特異代謝物結果如表1所示。

表1 兩株活性菌的特異性代謝產物質譜信息表

由表1發現，21－1－1－2的特異性代謝產物有14種，C2－4的特異性代謝產物有9種，兩種活性菌共有的特異性代謝物有7種。證明兩株活性菌存在共同的代謝產物。

（三）特異性代謝物檢索將16種特異性代謝物的一二級碎片信息上傳至GNPS，用“MASST Search”功能檢索。經“MASST Search”檢索發現，16種特異性代謝物中，只有質荷比為566.426的代謝物檢索到了結果，其余15種特異性代謝物的檢索均匹配不到結果。質荷比為566.426的代謝物的一二級質譜信息與GNPS的數據庫里匹配度最高的結果為Lajollamide A。其“Cosine Score”結果為0.93，“Matched Peaks”為10。其鏡像匹配度如圖3所示。

圖3 代謝物鏡相匹配圖

（四）抗菌物質質譜分析鑒定經與空白樣品對比，最終發現，活性菌C2－4和活性菌21－1－1－2所提取到的抗菌物質的特異性色譜峰是相同的，說明兩株活性菌所分泌的抗菌物質為同種物質（見圖4）。

圖4 抗菌物質的提取色譜圖及二級質譜圖

根據二級質譜圖可知，抗菌物質被打碎成不同質量大小的碎片，且其外側支鏈會優先斷裂。碎片566.4比碎片435.3多131.1，推測碎片566.4比4 35.3多一個亮氨酸（Leu），同樣，碎片435.3與碎片322.2之間，碎片322.2與碎片209.1之間的差值均為131.1，同樣推測是多了一個Leu。可以得出該化合物是一個含有3個Leu的肽類物質。將質譜檢測的數據上傳至GNPS，使用GNPS的“Molecular Networking”功能，“Precursor Ion Mass Tolerance”參數設置為0.02 Da；“Fragment Ion Mass Tolerance”設置為0.02 Da。使用檢索結果里的 “dereplicator+”二次提交工作流進行檢索，結果為Lajollamide A。該結果與通過組間代謝差異檢索出的特異性代謝物結果相同，證明了通過組間差異性代謝物分析也可以對活性菌分泌的抗菌物質進行鑒定。

Lajollamide A是一種具有抗菌活性的環狀五肽化合物，相對分子質量為565.8，分子式為C30H55N5O5。該化合物于2012年由GULDER等[24]首次從海洋絲狀真菌中提取發現。結合對二級碎片的分析，可以得出該抗菌物質Lajollamide A的結構（見圖5）。

圖5 活性菌抗菌物質可能的結構

有關Lajollamide A的文獻報道較少。Gulder等[24]通過核磁共振結合質譜分析獲得了其結構信息，并研究發現了Lajollamide A對革蘭氏陽性菌、枯草芽孢桿菌及表皮葡萄球菌的抑菌活性。Lajollamide A的發現對海洋微生物資源的利用和新型抗生素的發掘具有重要意義。

三、結論

本文建立了一種快速確定活性菌特異性代謝產物的方法。主要是基于高分辨質譜數據，同時借助MZmine分析軟件分析了活性菌的代謝產物差異，將處理后的數據導入GNPS平臺獲得活性菌的特異性代謝產物信息，將該方法應用于抗菌物質的鑒定，尋找到活性菌C2－4的特異性代謝產物9種，只有質荷比為566.426的代謝產物在數據庫中檢索到了結果，為Lajollamide A；尋找到活性菌21－1－1－2的特異性代謝產物14種，同樣只有質荷比為566.426的代謝產物在數據庫中檢索到了結果，為Lajollamide A。此結果與活性菌中提取到的抗菌物質一致。本方法操作簡便，省去了復雜的提取、純化的步驟，可直接得到目標物的信息，能快速準確地確定活性菌的特異性代謝產物。