超高效液相色譜－串聯質譜法同時測定蜂蜜中的多類植物毒素

張 帥 孟 娟 張 晶 許 莉 劉先軍 邵 兵

（1.北京市疾病預防控制中心，食物中毒診斷溯源技術北京市重點實驗室，北京100013；2.北京微量化學研究所，北京100091；3.國際關系學院，北京100091）

蜂蜜是一種深受消費者喜愛的藥食同源產品。隨著人們健康保健意識的不斷提高，其需求量逐年增長，進口數量也呈現明顯遞增趨勢[1]，與此同時，蜂蜜的安全性也受到了廣泛重視[2]。然而，以往的研究多集中于蜂蜜的農獸藥殘留[3]或者外源性的摻假方面，對內源性的污染關注相對較少。由于蜜蜂可在蜂巢周邊平均7 km2范圍內采集多種植物的花蜜[4]，因此極有可能同時暴露在多類有毒生物堿下，如雷公藤類和吡咯里西啶類生物堿。雷公藤類化合物主要來源于衛矛科雷公藤屬植物，主要用于治療自身免疫性疾病，如風濕性關節炎[5～6]和系統性紅斑狼瘡[7]。大部分雷公藤中的萜類化合物除有一定的治療作用外，還對腎臟[8]和肝臟[9]有嚴重的毒副作用，在臨床上其毒副作用發生率接近60%[10]；近年來常有因食用含有雷公藤類生物堿的蜂蜜而中毒甚至死亡的報道[11～12]。吡咯里西啶類生物堿（Pyrrolizidine alkaloids，PAs）在大自然中廣泛存在，KEMPF等[13]總結了蜂蜜和花粉中PAs的基本情況，SCHRAMM等[14]綜述了植物中的PAs的生物合成路徑、毒性和存在情況。德國聯邦風險評估研究所（BfR）指出，PAs不僅會導致嚴重的肝損傷，還具有遺傳毒性[15]。此外，倍半萜內酯類化合物馬桑寧[16]和羥基馬桑毒內酯[17]也都有一定的毒性；異喹啉類化合物小檗堿雖然毒性較低，卻可導致新生兒和胎兒核黃疸或加重[18]。鑒于這些植物毒素可能在蜜源地同時存在，可能會帶來潛在的健康風險，需要建立相應的便捷、快速、靈敏的檢測方法。

現有文獻報道蜂蜜中植物毒素的檢測方法主要有液相色譜－串聯質譜[19]、氣相色譜－串聯質譜[20]和液相色譜－四級桿－飛行時間質譜[21～22]。其中液相色譜－串聯質譜已被證明是定量分析各種殘留物和污染物的有力工具[23～24]，可用于蜂蜜中多種植物毒素的同時準確定性和定量分析。在復雜基質中化合物的準確定量會受到嚴重影響，而樣品的凈化方法也會對靈敏度和準確性造成一定影響。目前蜂蜜樣品凈化方法多是固相微萃取[20]和QuEChERS[21～22]技術。鑒于被測定的多種化合物極性差別較大，固相微萃取不能同時滿足對這些化合物基質去除效果和回收率要求，本文選擇了操作簡便、省時的QuEChERS凈化方法，結合超高效液相色譜－串聯質譜法（UPLC－MS/MS）建立了同時對蜂蜜中多種植物毒素的定量分析方法。

一、材料與方法

（一）儀器超高效液相色譜－Xevo TQ－S三重四極桿串聯質譜儀（美國沃特世公司）；AL204型電子天平（瑞士梅特勒－托利多儀器公司）；Allegra X－22R多功能臺式高速離心機（美國貝克曼公司）。

（二）試劑與樣品甲醇、乙腈（色譜純，美國霍尼韋爾國際公司）；氯化鈉（優級純，國藥集團化學試劑有限公司）；硫酸鎂、甲酸（分析純，百靈威科技有限公司）；N－丙基乙二胺（PSA）、十八烷基硅烷鍵合硅膠（C18）（美國默克公司）。

馬桑寧、雷公藤吉堿、雷公藤次堿、雷公藤定堿、雷公藤春堿、雷酚內酯、雷公藤內酯酮、雷公藤甲素、蘭薊定、克氏千里光寧、倒千里光堿、千里光寧、野百合堿、千里光菲林、小檗堿、荷葉堿、石松胺、羥基馬桑毒內酯（純度≥98%，北京索萊寶科技有限公司）。

蜂蜜樣品92種，購自大型超市、零售店及網上商城，其中2種產自浙江（紫云英蜜和雜花蜜各1種）、3種產自新疆（1種枸杞蜜和2種黑蜂蜜）、3種產自上海（紫云英蜜、洋槐蜜和雜花蜜各1種）、7種是產自河北的洋槐蜜、9種產自北京（7種洋槐蜜、1種荊花蜜和1種棗花蜜）、11種產自遼寧（3種洋槐蜜、3種椴樹蜜、3種黑蜂蜜和2種雜花蜜）、21種是產自山東的洋槐蜜、22種是產自陜西的油菜花蜜、9種是產自新西蘭的麥盧卡蜂蜜、5種產地不明（3種洋槐蜜和2種棗花蜜）。

（三）實驗方法

1.樣品前處理。稱取1 g蜂蜜樣品于10 mL離心管中，用1 mL超純水溶解后，加入6 mL乙腈，渦旋1 min。之后加入1.0 g NaCl，渦旋1 min，5 000 r/min離心10 min。吸取4 mL上清液于含50 mg PSA的凈化管中，渦旋1 min，5 000 r/min離心10 min。準確吸取3 mL上清液，在適當的氮氣流下吹干，用100μL甲醇溶解，再用0.1%甲酸水溶液定容至1 mL，供UPLC－MS/MS測定。

2.儀器條件。（1）色譜條件。色譜柱：BEH C18柱（2.1 mm×100 mm，1.7μm）；流動相：A相為甲醇，B相為0.1%甲酸水溶液；梯度洗脫程序：0～3 min，10%～15%A；3～5 min，15%～25%A；5～5.5 min，25%A；5.5～7 min，25%～62%A；7～10 min，62%～100%A；10～12 min，100%A；12～12.1 min，100%～10%A；12.1～14 min，10%A；柱溫：40℃；流速0.3 mL/min；進樣體積：10 μL。（2）質譜條件。離子源：電噴霧離子源（ESI+）；檢測方式：多反應監測模式（MRM）；干燥氣：氮氣；離子源溫度為150℃；脫溶劑氣流速為800 L/h；脫溶劑氣溫度為400℃；碰撞氣流速為0.14 mL/min；毛細管電壓為2.5 kV；錐孔電壓為35 V。目標物相應的保留時間、監測離子對（m/z）和碰撞能量等參數見表1。

表1 18種植物毒素的MRM模式優化參數

二、結果與分析

（一）色譜條件的優化由于18種目標植物毒素易溶于甲醇和乙腈，因此選擇了反相色譜柱和反相色譜常用的流動相體系甲醇－水和乙腈－水進行考察。本文對18種目標化合物的質譜檢測均采用正離子模式，甲酸的存在有助于促進其離子化，形成[M+H]+，從而提高分析的靈敏度。本實驗主要對比了甲醇－0.1%甲酸水溶液和乙腈－0.1%甲酸水溶液對各待測物的分析效果，結果表明，甲醇－0.1%甲酸水溶液作為流動相時可獲得較好的響應值和分離度。18種植物毒素在兩種分離體系下的總離子流圖如圖1所示。

圖1 18種植物毒素在不同分離體系下的總離子流圖

（二）加水量的優化由于蜂蜜中含水量很少，當用QuEChERS方法提取時，如直接加入有機溶劑進行提取，會因分散性不佳、黏合共沉淀等原因而降低提取效率，因此需要先加入一定量的水把蜂蜜溶解。本文考察了加水量對目標物回收率的影響，結果如圖2所示，用0.5 mL水溶解1 g蜂蜜時，多個化合物的回收率都比較低；當加入的水多于1 mL時，野百合堿、石松胺和倒千里光堿的回收率隨水體積的增加而下降；用1 mL水溶解時，大多數生物堿可得到理想的回收率，因此本文最終選擇用1 mL水溶解1 g蜂蜜。

圖2 加水量對回收率的影響

（三）鹽析劑的優化MARTINELLO等[22]和TANNER及CZERWENKA[25]在測定蜂蜜中吡咯里西啶生物堿時所使用的鹽析試劑為無水MgSO4、NaCl、二水合檸檬酸三鈉和一水合檸檬酸二鈉的混合物，與市售的鹽析試劑配方基本一致。由于QuEChERS前處理過程中加入的鹽析試劑主要是使有機相和水相分層，因此考慮盡可能地簡化鹽析試劑的組成，進而比較了上述組合的鹽析試劑（1 g無水MgSO4、0.5 g NaCl、0.5 g二水合檸檬酸三鈉和0.25 g一水合檸檬酸二鈉）和1.0 g NaCl的鹽析試劑對回收率的影響。結果表明，使用混合鹽析劑時野百合堿、石松胺和倒千里光堿的回收率為88.1%、58.3%和86.3%，稍高于氯化鈉作為鹽析劑的體系，而兩體系對其他生物堿的回收率幾乎沒有差異。因此，從操作簡便和降低成本方面考慮，選擇NaCl作為鹽析試劑。

（四）吸附劑的選擇QuEChERS凈化過程中，最常用的吸附劑包括C18和PSA，其中前者對非極性組分具有很強的吸附性，后者可有效去除甲酸、脂肪酸、極性色素等雜質。MARTINELLO等[22]和TANNER及CZERWENKA[25]在測定蜂蜜中吡咯里西啶生物堿時使用了氨基填料，因此，本研究將凈化填料總量設為50 mg，比較了C18、PSA和C18與PSA不同比例組合時對18種植物毒素的凈化效果和回收率的影響。結果表明，不同比例的C18和PSA并沒有對回收率產生明顯影響，但隨著PSA比例的降低，蘭薊定、克氏千里光寧、小檗堿、雷公藤甲素、雷公藤內酯酮和雷酚內酯的基質抑制作用明顯增強（見圖3），推測與PSA的結構和吸附性能有關。PSA為N－丙基乙二胺，屬于胺基類吸附劑，對有機酸、色素、糖類等極性物質的去除效率較高。當吸附劑中PSA的比例增高時，提取液中的糖類等雜質的去除效果更好，從而改善了基質抑制。因此，從降低基質效應的角度考慮，本研究選擇的凈化材料為50 mg PSA。

圖3 不同比例C18和PSA組合對目標物基質效應的影響

（五）方法的線性范圍、檢出限和定量限采用未檢出目標化合物的蜂蜜樣品所配制成的不同濃度的基質匹配標準溶液，對本試驗的方法學參數進行考察。以目標化合物的峰面積（y）對應相應的質量濃度（x，μg/L）繪制基質匹配標準曲線。以信噪比（S/N≥3）確定方法檢出限（LOD）；以信噪比（S/N≥10）確定方法定量下限（LLOQ）。18種目標物質的線性范圍見表2，從結果可得，18種植物毒素在給定的濃度范圍內有良好的線性關系，相關系數（R2）均＞0.99。

表2 18種植物毒素的方法線性范圍、檢出限和定量下限

（六）方法的回收率與精密度本研究對低、中、高3個加標濃度水平的蜂蜜樣品進行分析，考察方法在實際樣品分析中的可靠性與穩定性。結果如表3所示，3個加標水平的實際蜂蜜樣品中，除石松胺的回收率在48%～60%之間，其他目標化合物的回收率均在70%～112.5%之間，所有化合物的日內精密度RSD≤15.1%（n＝6）。結果表明，該方法具有良好的穩定性與重現性，可用于蜂蜜樣品的分析。

表3 18種植物毒素在蜂蜜基質中的回收率和相對標準偏差 （n＝6）

（七）實際樣品測定在大型超市、零售店及網上商城購買了92種蜂蜜，其中進口麥盧卡蜂蜜9種。83種國產蜂蜜的產地包括北京、上海、山東、河北、新疆等；從蜜源上看，有洋槐蜜、荊花蜜、棗花蜜和油菜花蜜。采用本試驗所建立的方法對這些產品進行了檢測，其中26個樣品檢測出了小檗堿，含量為0.2～49.5μg/kg，7個產自新西蘭的樣品中小檗堿含量在3μg/kg以上，僅1個產自陜西的樣品中小檗堿含量為49.5μg/kg，其余國產樣品小檗堿含量均低于1μg/kg；5個樣品檢測出了石松胺，3個樣品為產自新西蘭的樣品、2個為產自陜西的樣品，含量為5.45～16.6μg/kg；3個產自新西蘭的產品和1個產自陜西的產品同時檢測出了小檗堿和石松胺；其他16種植物毒素均未檢出。

由于小檗堿廣泛存在于小檗科、罌粟科和毛茛科植物中，且這幾個科的植物屬種繁多，普遍存在于溫帶和亞熱帶地區；石松胺是吡咯里西啶類生物堿中非常常見的一種，且主要存在于紫堇科（菊科）、紫草科和夾竹桃科植物中，這幾個科的植物在世界各地較普遍，在我國特別是山西、陜西、甘肅等省較多，在澳大利亞、美國、加拿大、新西蘭等國也廣泛分布。蜜蜂很容易采集到這幾類植物的花粉或花蜜，這也許是有些蜂蜜中含有小檗堿和石松胺的原因。

三、結論

本研究利用乙腈提取蜂蜜樣品，用改良的QuEChERS方法凈化，并結合超高效液相色譜－串聯質譜檢測技術，建立了蜂蜜中吡咯里西啶類、雷公藤類、小檗堿、荷葉堿、馬桑寧和羥基馬桑毒內酯等共18種化合物的快速、高靈敏度定量分析方法。該方法具有較高的重現性和精密度，各項指標均可達到蜂蜜中目標化合物痕量分析的要求，為蜂蜜中植物毒素的污染監測提供了技術支持。