小麥鐮刀菌毒素的超高效液相色譜-串聯質譜檢測方法研究及應用

雷欣宇 李 曦 趙 珊 鄭幸果 仲伶俐

（四川省農業科學院農業質量標準與檢測技術研究所，農業農村部農產品質量安全風險評估實驗室（成都），成都610066）

小麥赤霉病又稱麥穗枯、爛麥頭、紅麥頭，是一種典型的流行性氣候型病害，是威脅麥類生產的主要病害之一[1]。鐮刀菌是小麥赤霉病的主要病原菌。經鐮刀菌浸染后的小麥不僅品質和產量受到嚴重損失，其次級代謝物鐮刀菌毒素留存于小麥籽粒中，還會嚴重危害人畜健康[2～4]。鐮刀菌毒素主要包括單端孢霉烯族毒素、玉米赤霉烯酮、串珠鐮刀菌素、伏馬菌素和一些丁烯酸內酯、倍半萜類化合物[5]。小麥易受浸染的毒素中以脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）、3－乙酰基脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（3－ADON）、15－乙酰基脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（15－ADON）和雪腐鐮刀菌烯醇（NIV）等單端孢霉烯族化合物為主，其中又以DON污染范圍最廣，污染情況最嚴重，對小麥產品的品質安全產生極大的威脅。

由鐮刀菌引起的小麥赤霉病在我國麥區均有發生。韓小敏等[6]調查了安徽、北京、河南、吉林和山東小麥粉中10種鐮刀菌毒素的污染情況，發現小麥粉易受B類單端孢霉烯族化合物和玉米赤霉烯酮的污染，其中又以DON的污染最為嚴重，受3－ADON、15－ADON和NIV污染水平較低。馬玉彤等[7]對我國11個麥區的小麥中7種鐮刀菌毒素含量調查發現，小麥毒素污染以NIV為主，NIV含量在各麥區間無顯著差異；DON和3－ADON的含量在長江中下游冬麥區中最高；15－ADON含量較低，在各麥區間差異不明顯。陳新元等[8]研究發現，四川小麥毒素污染種類以NIV為主，DON其次，3－ADON、15－ADON和鐮刀菌烯醇（4ANIV）發生較輕。四川是我國小麥主產區之一，也是小麥赤霉病常年流行區域，持續關注四川地區小麥鐮刀菌毒素污染情況，對今后開展小麥赤霉病的預報和防治工作，以及小麥品質安全風險預警研究具有重要意義。

目前，真菌毒素的檢測方法主要有薄層色譜法[9]、 酶聯免疫法[10]、 高效液相色譜法[11～12]和液質聯用法[13～16]等，上述方法除液質聯用法外均只能檢測單一或同一類毒素。液質聯用法可實現多組分的同時測定，具有高靈敏度、高分離度和高精密度的優勢，成為近幾年熱門的分析手段。本研究采用QuEChERS凈化技術結合超高效液相色譜－串聯質譜法（UPLC－MS/MS）建立小麥中4種鐮刀菌毒素的分析方法，并利用該方法對四川地區450份小麥樣品中DON、3－ADON、15－ADON和NIV 4種鐮刀菌毒素進行含量測定，以了解四川小麥鐮刀菌毒素污染水平，以期為四川小麥質量安全風險監測工作提供監測手段和數據支持。

一、材料與方法

（一）材料與試劑 乙腈、甲醇（色譜純），美國Fisher公司；實驗用水為超純水，四川優普超純科技有限公司；DON（200μg/mL）、3－ADON（100μg/mL）、15－ADON（100μg/mL）、NIV（100μg/mL）標準品溶液，ROMER公司；乙酸銨（色 譜 純），QuEChERS凈 化 管 （貨 號SBEQCA8805－H，含無水硫酸鎂200 mg、氯化鈉100 mg、檸檬酸鈉100 mg、C18100 mg），0.22μm有機濾膜，上海安譜實驗科技股份有限公司。

（二）儀器與設備超高效液相色譜串聯質譜儀Xevo TQ－XS，美國Waters公司；AUY220型分析天平，日本島津公司；渦旋振蕩器，上海旌派儀器有限公司；TG－1850高速離心機，四川蜀科儀器有限公司。

（三）樣品采集與制備

1.樣品采集。根據四川小麥種植區域布局情況，選取成都、德陽、綿陽等10個市的小麥種植區為采樣點，抽取2020年收獲小麥樣品共450份。樣品采集信息見表1。每份樣品抽取2 kg，以尼龍網袋包裝，放于陰涼通風處保存。

2.樣品制備。采用四分法將樣品縮減至500 g，高速粉碎后通過20目篩，混勻后裝入樣品密封袋中，于－18℃避光保存備用。

（四）試驗方法

1.色譜條件。色譜柱：Phenomenex Kinetex XB－C18100A（100 mm×2.1 mm，1.7μm）；流速：0.2 mL/min；柱溫：40℃；進樣量：2μL；流動相：5 mmol/L乙酸銨水溶液（A相）、甲醇（B相）；梯度洗脫程序：0～2.5 min，90%A→40%A；2.5～3.5 min，40%A→10%A；3.5～3.6 min，10%A→90%A；3.6～5.5 min，90%A。

2.質譜條件。離子源：電噴霧離子源；電離模式：ESI；檢測模式：多反應監測模式（MRM）；毛細管電壓：3.0 kV；脫溶劑氣溫度：250℃；脫溶劑氣流量：600 L/h；錐孔反吹氣流量：150 L/h。質譜采集參數見表2。

3.樣品提取與凈化。稱取小麥粉5 g于離心管，加入50%乙腈水溶液20 mL，渦旋5 min后，于搖床以200 r/min振蕩30 min。振蕩完成后以4 000 r/min離心10 min，取4 mL上清液到干凈離心管中，加入QuEChERS凈化試劑，快速渦旋1 min再以4 000 r/min離心10 min。取全部上層清液氮吹至近干，用50%乙腈水溶液定容至1 mL，混勻后過0.22μm濾膜，供UPLC－MS/MS檢測。

4.基質標準工作溶液的配制。取不含有DON、3－ADON、15－ADON和NIV的空白小麥樣品，按上文“3.樣品提取與凈化”方法制備空白基質溶液。將4種鐮刀菌毒素標準品用上述空白基質溶液稀釋成基質標準工作溶液，基質標準工作溶液中DON、3－ADON和15－ADON系列濃度為10、50、200、500、1 000 ng/mL，NIV系列濃度為40、100、200、500、1 000 ng/mL。

二、結果與分析

（一）質譜條件優化根據化合物分子的化學電離性質，分別采用正、負離子模式采集化合物響應。經比較，DON、3－ADON、15－ADON在正離子模式下響應較高，NIV在負離子模式下靈敏度更好，因此選擇正負離子同時掃描模式。利用儀器軟件自動調諧功能，對目標化合物子離子、錐孔電壓、碰撞能量進行優化，得到最佳MRM質譜參數（見表2）。

（二）色譜條件優化在液質聯用分析中，流動相組成不僅影響液相色譜的分離效果，還影響目標化合物的離子化效率和質譜靈敏度[17]。本文分別考察了甲醇－水、甲醇－0.1%甲酸水、甲醇－5 mmol/L乙酸銨水和甲醇－0.1%氨水對4種目標化合物的分離效果。結果表明，流動相為甲醇－水和甲醇－0.1%甲酸水時，采用負離子模式的NIV均無質譜響應；采用甲醇－5 mmol/L乙酸銨水和甲醇－0.1%氨水為流動相時，4種化合物均能有效分離。在甲醇－5 mmol/L乙酸銨水條件下，雖然NIV響應強度弱于甲醇－0.1%氨水條件，但其余3種化合物響應強度更優，因此最終采用甲醇－5mmol/L乙酸銨水作為流動相。經優化后4種鐮刀菌毒素MRM色譜圖見圖1。

（三）方法的線性范圍與靈敏度將制備的基質標準工作溶液按上文色譜和質譜條件由低濃度到高濃度依次進樣檢測。以目標化合物峰面積（Y）為縱坐標，濃度（X）為橫坐標，進行線性回歸分析，結果見表3。結果顯示，4種化合物在各自線性范圍內均具有良好的線性關系，相關系數均≥0.997。以3倍信噪比時各化合物對應濃度為檢出限，10倍信噪比時對應濃度為定量限，DON、3－ADON、15－ADON檢出限為5μg/kg，定量限為10μg/kg；NIV檢出限為20μg/kg，定量限為40μg/kg（見表3）。

（四）方法的回收率與精密度在空白小麥樣品中分別添加低、中、高3個水平的混合標準溶液，每個水平進行5次平行測定，計算各目標化合物的平均回收率和相對標準偏差（RSD），結果見表4。如表4所示，4種鐮刀菌毒素平均回收率范圍為81.5%～94.5%，RSD范圍為2.4%～8.6%，說明本方法準確度和精密度能夠滿足實際樣品的檢測要求。

表4 4種鐮刀菌毒素的回收率與相對標準偏差 （n＝5）

（五）四川小麥樣品中鐮刀菌毒素的檢測采用本文方法對四川小麥進行鐮刀菌毒素檢測，結果見表5。結果顯示，450份小麥樣品中檢出含4種鐮刀菌毒素樣品334個，總體檢出率74.2%；4種鐮刀菌毒素均有檢出，所有樣品中4種鐮刀菌毒素檢出率按高低順序依次是DON（67.8%）＞NIV（60.9%）＞3－ADON（4.2%）＞15－ADON（0.4%），以DON和NIV的污染情況最為普遍。從檢出含量看，NIV污染程度最嚴重，最大值、平均值和中位值均最高，最大值達4 505.7μg/kg；DON污染程度次之，有13個（2.9%）樣品DON含量高于國家規定的限量值1 000μg/kg，超標值范圍為1 070.3～3 081.1μg/kg；3－ADON和15－ADON污染程度較輕，中位值低于檢出限（LOD），最高值未超過100μg/kg。

表5 四川小麥鐮刀菌毒素含量總體水平

（六）不同地區小麥樣品中鐮刀菌毒素污染情況四川不同地區小麥樣品中4種鐮刀菌毒素含量的檢測結果見表6，經比較數據發現，DON在10個地區均有檢出，檢出率范圍在31.7%～100%，其中綿陽地區受污染范圍較小，雅安地區受污染范圍最大，超標樣品分別來自雅安（3個）和成都（10個），DON含量檢出最高值來自成都，經對比，雅安和成都小麥樣品檢測均值顯著高于其他地區（P＜0.05）；與DON情況相似，NIV在各地區小麥樣品中普遍存在，檢出率范圍在18.3%～100%，綿陽地區受污染較輕，雅安和達州樣品受污染范圍最廣，NIV檢出最高值同樣來自成都，經對比，達州和成都小麥NIV檢出均值較高，與其他地區存在顯著性差異（P＜0.05）；3－ADON僅在眉山、雅安和成都3個地區有分布，15－ADON僅在成都地區有分布，兩種鐮刀菌毒素均檢出量少、含量較低，在各個地區間沒有顯著差異。

表6 不同地區小麥樣品鐮刀菌毒素污染情況

三、結論

本研究建立了UPLC－MS/MS技術檢測小麥中DON、3－ADON、15－ADON和NIV 4種鐮刀菌毒素含量的方法。經方法學驗證后，確認本方法回收率高且穩定、精確度好、結果準確可靠，能夠滿足小麥中鐮刀菌毒素的檢測要求，適用于在我國糧食產品質量風險監測工作中檢測相關真菌毒素。

從檢測結果看，2020年采收的450份四川小麥樣品中鐮刀菌毒素總體檢出率74.2%，超標率2.9%；4種鐮刀菌毒素以NIV和DON污染程度較為嚴重，3－ADON和15－ADON污染較輕，此結果與何珊[18]對四川小麥鐮刀菌毒素化學型的鑒定結果相符。不同麥區間NIV和DON的污染水平存在顯著性差異，達州和成都地區的NIV污染水平及雅安和成都地區的DON污染水平明顯高于其他地區。NIV作為廣泛性污染禾谷類作物的毒素，其化學性質穩定，毒性強于DON[19～20]，對其可能造成的安全風險應當予以重視。總體上，四川小麥產品質量安全受鐮刀菌毒素影響有限，但存在一定風險，關于鐮刀菌毒素污染特點與毒素間相關性還有待作進一步分析。