唑來膦酸在白色脂肪組織棕色化中的作用

沈亞芳，曹 華

(1.南京市江寧區婦幼保健計劃生育服務中心，江蘇 南京 211199；2.南京市江寧醫院檢驗科，江蘇 南京 211199)

隨著經濟的發展和人們生活方式的轉變，肥胖和2型糖尿病在全球范圍內迅速流行，并已成為我國面臨的重大公共衛生問題之一。脂肪組織是機體重要的能量儲存和內分泌器官，根據功能和形態學的不同可分為白色脂肪組織和棕色脂肪組織兩種類型。進一步研究發現，在冷刺激或β3腎上腺素能受體激動劑作用下，白色脂肪組織中部分脂肪細胞會轉變為解偶聯蛋白1(UCP1)陽性的米色脂肪細胞，其產熱耗能能力雖小于經典的棕色脂肪細胞，但遠遠大于白色脂肪細胞，這一生物學現象稱為白色脂肪棕色化。不同于白色脂肪細胞，棕色脂肪細胞和米色脂肪細胞的脂滴小而密集，線粒體內高表達UCP1，在靜息狀態下能夠發揮強大的非戰栗產熱作用并消耗大量熱量。目前，探尋增強棕色脂肪細胞功能和促白色脂肪棕色化的有效手段已成為治療肥胖及其相關代謝性疾病的新策略[1]。

越來越多的證據表明，棕色脂肪組織與骨代謝間存在密切聯系。骨密度與體內棕色脂肪的含量呈正相關[2]，機制研究進一步發現，脂肪組織和骨均可釋放多種具有生物活性的物質實現器官間的互調，如成纖維細胞生長因子21、血管內皮生長因子、骨鈣素和硬骨抑素等[3]。重要的是，脂肪細胞、軟骨細胞和骨細胞均起源于中胚層，這提示，作用于骨組織的藥物可能對脂肪細胞存在潛在的作用。

目前，超過50%的糖尿病患者合并有骨密度減低，骨質疏松骨折已成為老年糖尿病患者致殘致死的主要原因之一。唑來膦酸(Zoledronic acid，ZA)是臨床上治療骨質疏松的一線藥物，它能抑制破骨細胞的功能，從而抑制骨吸收。作為糖尿病合并骨質疏松癥患者常用的臨床治療藥物，早期給予唑來膦酸治療可顯著預防糖尿病性骨質疏松的發生[4]。值得注意的是唑來膦酸可顯著緩解肥胖小鼠的肝臟脂質沉積和脂肪變性，發揮代謝改善作用。但是，唑來膦酸是否具有調控白色脂肪棕色化的作用尚不清楚。本研究使用高脂喂養的肥胖小鼠模型和C3H10T1/2誘導分化的脂肪細胞，在動物和細胞水平探究唑來膦酸在白色脂肪棕色化中的作用。

1 材料與方法

1.1材料：C57BL/6小鼠(上海斯萊克有限公司)，唑來膦酸(美國Sigma-Aldrich公司)，RNA逆轉錄試劑盒、SYBR Premix Ex Taq TM(大連Takara公司)，UCP1、CIDEA、PGC1-α和PRDM16基因引物(上海英濰捷基有限公司)，高脂飼料(美國Research Diet公司)，UCP1、CIDEA、PGC1-α和PRDM16抗體(美國Abcam公司)，小動物PET/CT(德國Siemens公司)。

1.2實驗方法

1.2.1動物分組：8周齡SPF級C57BL/6小鼠40只，分為普通飲食組(熱量比：蛋白質26%，碳水化合物64%，脂肪10%)和高脂飲食組(熱量比：蛋白質14%，碳水化合物32%，脂肪54%)，高脂喂養4周后將高脂組分為唑來膦酸干預組(HFD+ZA)和高脂對照組(HFD+PBS)，干預組腹腔注射唑來膦酸50 μg/kg，每周注射一次，正常對照組和高脂對照組腹腔注射等體積PBS，持續4周。本次研究經過本院醫學倫理委員會同意。

1.2.2小動物PET/CT檢查：唑來膦酸干預結束后，小鼠腹腔注射18F-氟代脫氧葡萄糖(18F-FDG，100～140 μCi)，60 min之后麻醉小鼠，采用小動物PET/CT對小鼠進行掃描并采集PET信號，同步采集CT信號用來進行PET圖像的衰減校正，分析小鼠皮下白色脂肪組織(subcutaneous white adipose tissue，sWAT)18F-FDG的最大標準化攝取值(SUVmax)。

1.2.3標本采集：實驗結束后處死小鼠，留取小鼠sWAT，一部分組織4%多聚甲醛固定，進行HE和免疫組化染色分析，剩余組織立即液氮冷凍后保存待測。

1.2.4HE染色:取三組小鼠sWAT樣本4%多聚甲醛固定后脫水并包埋于石蠟中，在二甲苯和梯度酒精中脫蠟后使用蘇木精進行核染色，而后置于伊紅染液中染色后脫水、透明、封片，在光學顯微鏡下觀察和拍照。

1.2.5免疫組化：取小鼠sWAT樣本4%多聚甲醛固定后進行梯度酒精脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、切片、染色、洗脫和封片，在200倍顯微鏡視野下進行觀察和拍照。

1.2.6實時熒光定量聚合酶鏈反應(RT-PCR)：分別取三組小鼠sWAT 30 mg，置于無RNA酶的EP管中，加入1ml Trizol勻漿后，經氯仿抽提、異丙醇沉淀、乙醇洗滌和DEPC水平溶解后提取RNA。取1μg RNA逆轉錄成cDNA，使用cDNA模板在ABI7300型定量PCR儀檢測棕色化相關基因的mRNA水平，使用β-actin作為內參基因，采用Ct比較法(2-△△CT)計算目的基因相對于內參基因的轉錄水平，引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.7蛋白免疫印跡(Western blot)：取三組小鼠sWAT 150 mg，經蛋白裂解、離心后提取總蛋白并使用BCA法檢測蛋白濃度，每個樣本吸取50 μg蛋白進行SDS-PAGE電泳后，經轉膜、抗體孵育、化學發光、顯影和定影后，使用Image-pro plus6.0軟件對目的蛋白與內參β-actin的灰度值進行分析，以相對值進行統計學比較。

1.2.8C3H10T1/2脂肪細胞的誘導分化：C3H10T1/2細胞在培養皿中長滿后加入誘導液A(正常培養液含重組人胰島素5 μg/ml，3-異丁基-1-甲基黃嘌呤0.5 mmol/L，地塞米松1 μmol/L，吲哚美辛125 nmol/L，三碘甲酰原氨酸1 nmol/L，羅格列酮1 μmol/L)，2 d后換成誘導液B(正常培養液含重組人胰島素5 μg/ml，三碘甲酰原氨酸1 nmol/L，羅格列酮1 μmol/L)，過2 d后換成正常培養液，待90%以上的細胞呈現圓形并出現脂滴后，表示C3H10T1/2脂肪細胞誘導成功。

2 結果

2.1唑來膦酸恢復HFD小鼠sWAT中18F-FDG 攝取水平和UCP1表達：小動物PET/CT的結果顯示，與正常對照組小鼠相比，HFD組小鼠皮下脂肪的SUVmax水平明顯減低，而唑來膦酸干預后小鼠sWAT的SUVmax水平顯著升高。見圖1。HE染色結果顯示，與對照組小鼠相比，HFD組小鼠sWAT脂肪細胞的體積增大，而唑來膦酸干預后sWAT脂肪細胞的體積顯著減小。見圖2。進一步利用免疫組織化學染色技術對UCP1蛋白表達進行檢測后發現，相較對照組小鼠，HFD組小鼠sWAT中UCP1的表達下降，而唑來膦酸干預后小鼠sWAT中UCP1的表達明顯恢復。見圖3。

圖2 三組小鼠皮下脂肪組織HE染色形態圖

圖3 三組小鼠皮下脂肪組織UCP1免疫組化染色，黑色箭頭指示陽性染色

2.2唑來膦酸恢復HFD小鼠sWAT中棕色化相關基因mRNA和蛋白的表達：定量PCR的結果顯示，與正常對照組相比，HFD組小鼠sWAT中UCP1、CIDEA、PGC1-α和PRDM16的mRNA水平顯著減低(分別是對照組的0.26±0.04、0.23±0.1、0.19±0.06、0.16±0.05倍，均P<0.01)，而唑來膦酸干預后顯著恢復上述基因的mRNA表達(分別是對照組的0.88±0.05、0.76±0.06、0.48±0.06、0.75±0.04倍)。見圖4。Wes-tern blot結果進一步證實，相較于對照組小鼠，HFD組小鼠sWAT中UCP1、CIDEA、PGC1-α和PRDM16的蛋白表達明顯下調，而唑來膦酸干預可恢復上述蛋白的表達，差異有統計學意義(P<0.01)。見圖5。

注：*表示與Control組相比，P<0.01；#表示與HFD+PBS組相比，P<0.01

2.3唑來膦酸上調C3H10T1/2脂肪細胞棕色化基因mRNA和蛋白表達：為探究唑來膦酸對白色脂肪棕色化的直接調控作用，C3H10T1/2脂肪細胞使用唑來膦酸(100 nmol/l)處理48 h后，檢測棕色化相關基因的mRNA和蛋白水平表達。定量PCR結果顯示，UCP1、CIDEA、PGC1-α和PRDM16的mRNA表達在唑來膦酸處理后均顯著升高，差異有統計學意義(分別是對照組的4.26±0.98、3.01±0.16、2.44±0.28、1.95±0.29倍，均P<0.01)。見圖6。Western blot結果進一步發現，唑來膦酸處理后顯著上調UCP1、CIDEA、PGC1-α和PRDM16的蛋白水平。見圖7。

注：*表示與Control組相比，P<0.01；#表示與HFD+PBS組相比，P<0.01。

3 討論

18F-FDG是一種葡萄糖類似物，可被代謝旺盛的器官攝取，使用小動物PET/CT可檢測18F-FDG在體內的分布情況，是評估棕色脂肪功能和白色脂肪棕色化的有力手段。本研究采用PET/CT分析小鼠皮下脂肪的18F-FDG攝取水平，發現唑來膦酸處理后小鼠皮下脂肪代謝活動顯著增強，對18F-FDG攝取增加，免疫組化染色進一步發現皮下脂肪組織UCP1的表達升高。CIDEA、PGC1-α和PRDM16是白色脂肪棕色化中的關鍵轉錄因子和調控因子，筆者對棕色化相關基因的轉錄和蛋白水平分析后，發現唑來膦酸可明顯上調皮下脂肪中棕色化相關基因的表達。這些證據說明，唑來膦酸具有促白色脂肪棕色化的作用。

注：*表示與Control組相比，P<0.01；#表示與HFD+PBS組相比，P<0.01圖5 UCP1、CIDEA、PGC1-α和PRDM16在三組小鼠皮下脂肪組織中的蛋白表達水平

注：*表示與Control組相比，P<0.01圖6 C3H10T1/2脂肪細胞經唑來膦酸(100 nmol/L)處理后，UCP1、CIDEA、PGC1-α和PRDM16的mRNA相對表達水平

唑來膦酸作為一種雙磷酸鹽類藥物，其靶點主要為法尼基焦磷酸合成酶，持續作用于破骨細胞[5]，除外作用于破骨細胞，體外研究還發現，雙磷酸鹽類藥物還可促進骨髓間充質干細胞的成骨分化并抑制其成脂分化[6]，提示其藥理作用的復雜性。既往研究證實，骨細胞分泌的骨形態發生蛋白7和骨硬化蛋白具有促白色脂肪棕色化的作用，成骨細胞來源的神經肽Y同樣參與了白色脂肪棕色化的調節[7]。本研究中唑來膦酸促白色脂肪棕色化是否依賴于骨細胞和成骨細胞分泌的生物活性物質值得進一步探索。筆者的細胞水平研究發現，脂肪細胞經唑來膦酸處理后棕色化相關基因的表達顯示升高，這提示唑來膦酸具有促白色脂肪棕色化的直接調控作用，但其中的具體機制仍有待進一步闡明。

注：*表示與Control組相比，P<0.01圖7 C3H10T1/2脂肪細胞經唑來膦酸(100 nmol/L)處理48 h后，UCP1、CIDEA、PGC1-α和PRDM16的蛋白表達水平

綜上所述，本研究發現唑來膦酸可上調白色脂肪棕色化相關基因的表達，促進白色脂肪棕色化的發生，研究結果有助于為肥胖及相關代謝性疾病的治療提供新的思路。