城中湖與長(zhǎng)江城區(qū)段超微型真核浮游生物多樣性比較研究

李運(yùn)濤，李 歡，余 思，陳 倩 , 侯建軍

(1.蚌埠學(xué)院，安徽 蚌埠 233030；2.食用野生植物保育與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 黃石 435002)

0 引言

浮游生物在水生態(tài)系統(tǒng)中扮演著重要的角色，它們具有非常重要的生態(tài)作用[1，2]。在淡水研究中，通常將直徑在0.2～5 μm之間的真核浮游生物定義為超微型真核浮游生物，它們數(shù)量龐大、分布廣泛，在淡水生態(tài)系統(tǒng)中扮演著不可或缺的角色[3，4]。水體中的超微型真核浮游生物的多樣性與該水體的營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)有關(guān)，不同營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)的水體中浮游生物會(huì)有不同的群落組成，故水體的營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)可以用超微型浮游生物的群落組成來(lái)判斷[5]。

磁湖位于湖北省黃石市市區(qū)，是黃石市區(qū)內(nèi)最大的淡水湖，面積約為8平方千米；長(zhǎng)江黃石段是黃石地區(qū)最大的活水流，流經(jīng)黃石市區(qū)。磁湖與長(zhǎng)江代表了靜止和流動(dòng)兩類不同的水體，目前關(guān)于這兩類水體浮游生物的對(duì)比研究還較少。

本研究采用高通量測(cè)序方法，對(duì)長(zhǎng)江黃石段和磁湖的超微型真核浮游生物的多樣性以及季節(jié)變化進(jìn)行研究，探究不同流動(dòng)狀態(tài)的水體中浮游生物多樣性的差異，研究結(jié)果可以為闡明區(qū)域水體的生物多樣性特征及水環(huán)境變化規(guī)律提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集

本研究選取湖北黃石市的城中湖——磁湖和長(zhǎng)江黃石城區(qū)段作為目標(biāo)水域，在2015年10月(秋季)以及12月(冬季)采樣，在每個(gè)水域中各設(shè)置三個(gè)采樣點(diǎn)，具體采樣點(diǎn)的設(shè)置如圖1所示。使用不銹鋼分層采樣器采集距離水表約0.5 m處的水樣，每個(gè)采樣點(diǎn)各取500 mL水樣，然后將每個(gè)水域三個(gè)采樣點(diǎn)的水樣混合。混合水樣先經(jīng)篩絹過(guò)濾，接著用5 μm Isopore聚碳酸酯濾膜Isopore (Mil-lip re) 過(guò)濾，收集濾液，濾液接著用0.7 μm GF濾膜(Whatman)過(guò)濾，以收集超微型浮游生物樣品，將過(guò)濾得到的樣品膜于-80℃ 超低溫冰箱保存。四個(gè)樣本分別記為CJwin：長(zhǎng)江冬季樣本；CJaut：長(zhǎng)江秋季樣本；CHwin：磁湖冬季樣本；CHaut：磁湖秋季樣本。

圖1 采樣水域位置 (A: 磁湖; B: 長(zhǎng)江)

1.2 理化指標(biāo)的測(cè)定

本研究測(cè)定的理化指標(biāo)有：總氮(TN)、總磷(TP)、pH、水溫(WT)、化學(xué)需氧量(CODMn)。水溫在采樣現(xiàn)場(chǎng)由溫度計(jì)直接測(cè)取，pH值使用pH計(jì)讀取，其他理化指標(biāo)測(cè)試方法均使用國(guó)家水環(huán)境監(jiān)測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)法。各水域的營(yíng)養(yǎng)化程度采用綜合營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)指數(shù)(trophic level index, TLI)法進(jìn)行評(píng)價(jià)。綜合營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)指數(shù)的計(jì)算選取總氮濃度、總磷濃度、化學(xué)需氧量3 個(gè)指標(biāo)，具體計(jì)算方法及營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參考王鶴揚(yáng)的方法[6]。

1.3 DNA提取，18S rRNA測(cè)序

本研究采用改良CTAB法提取樣品中的總DNA，提取的總DNA 的質(zhì)量用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。檢測(cè)合格的樣品DNA使用Illumina Hiseq PE300平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序由北京諾禾致源生物信息科技有限公司完成。測(cè)序針對(duì)18S rRNA的V4區(qū)，使用通用引物：F-574(GCG GTA ATT CCA GCT CCA A)和R-952(TTG GCA AATGCTTTC GC)進(jìn)行測(cè)序[7]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

測(cè)序原始數(shù)據(jù)經(jīng)拼接、質(zhì)量過(guò)濾并去除嵌合體，得到高質(zhì)量的 Tags 序列。在相似性 97% 的水平上對(duì)序列進(jìn)行聚類(USEARCH ,version 10.0)。選取Silva數(shù)據(jù)庫(kù)(Release128, http://www.arb-silva.de)進(jìn)行物種比對(duì)，物種注釋使用RDP Classifier進(jìn)行，置信度閾值取0.8(version 2.2, http://sourceforge.net/projects/rdpclassifier/)。樣本聚類分析使用非加權(quán)組平均法(Unweighted pair group method with arithmetic mean, UPGMA)，主坐標(biāo)分析(Principal Coordinates Analysis，PCoA)和樣本聚類均基于Bray- Curtis 距離。多樣性指數(shù)計(jì)算、樣本聚類、主坐標(biāo)分析均基于OUT數(shù)據(jù)并使用R語(yǔ)言vegan包進(jìn)行。使用Origin 2018繪制物種相對(duì)豐度柱形圖、熱圖以及韋恩圖。本次研究采用徐兆禮、陳亞瞿提出的優(yōu)勢(shì)度指數(shù)來(lái)判定優(yōu)勢(shì)種的組成，選取優(yōu)勢(shì)度指數(shù)>0.02的類群作為優(yōu)勢(shì)種[8]。優(yōu)勢(shì)度指數(shù)計(jì)算公式為：Y=(Ni/N)fi，式中N為樣品中超微型真核浮游生物總序列數(shù)，Ni表示第i種類群的序列數(shù)，F(xiàn)i為第i種類群在各樣點(diǎn)出現(xiàn)的頻率[8]。

2 結(jié)果與分析

2.1 采樣點(diǎn)基本情況

由各樣點(diǎn)的理化因子判斷，各水域均是秋季營(yíng)養(yǎng)化程度較高(表1)。根據(jù)綜合營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)指數(shù)判斷，長(zhǎng)江和磁湖站點(diǎn)在冬季處于中營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)，兩個(gè)站點(diǎn)在秋季則為輕度富營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)。兩個(gè)水域相比較，秋冬兩季長(zhǎng)江站點(diǎn)的營(yíng)養(yǎng)化狀態(tài)均低于磁湖站點(diǎn)。從季節(jié)上來(lái)看，兩個(gè)水域的營(yíng)養(yǎng)化狀態(tài)均是秋季高于冬季。

表1 各樣本理化因子數(shù)據(jù)

2.2 測(cè)序基本情況

四個(gè)樣本測(cè)序共得到有效序列130 147條，序列平均長(zhǎng)度為340bp左右。各個(gè)樣本的稀釋性曲線均趨向平坦，說(shuō)明本次測(cè)序數(shù)據(jù)量是足夠的。四個(gè)樣本總共得到430個(gè)操作分類單元(operational taxonomic unit，OTU)，其中CHaut樣本包含的OTU數(shù)目最多，為314個(gè)，CHwin樣本包含的OTU數(shù)目最少，為213個(gè)(圖2)。四個(gè)樣本共有的OTU為129個(gè)，CHaut樣本特有的OTU數(shù)目最多而CHwin樣本特有的OTU數(shù)目最少，它們含有的OUT數(shù)目分別為35個(gè)和8個(gè)。對(duì)兩個(gè)樣本共有的OTU數(shù)目進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，CHaut-CJaut樣本共有的OTU最多，為228個(gè)，其次是CJaut-CJwin樣本，共有的OTU為200個(gè)，CHwin-CJwin樣本共有的OTU為 168個(gè)，CHaut-CHwin樣本共有的OTU最少，為165個(gè)(圖2)。

圖2 韋恩圖展示四個(gè)樣本的OUT重疊

2.3 群落多樣性分析

測(cè)序的4個(gè)樣本中，磁湖秋季(CHaut)的Chao1指數(shù)最高，提示CHaut具有最高的群落豐富度(表2)。磁湖冬季(CHwin)的Chao1指數(shù)最低，顯示CHwin 的群落豐富度是四個(gè)樣本中最低的。兩個(gè)水域中的Chao1指數(shù)的總體變化趨勢(shì)均為秋季比冬季高，表明黃石水域中的磁湖及長(zhǎng)江黃石段超微型真核浮游生物物種豐富度都是秋季比冬季高。在長(zhǎng)江站點(diǎn)中Chao1指數(shù)在秋冬兩個(gè)季節(jié)間的變化不大，相比之下，磁湖站點(diǎn)的Chao1指數(shù)隨季節(jié)變化波動(dòng)較大。Shannon指數(shù)和PieLou均勻度指數(shù)最高的樣本是CJaut，但該樣本的Chao1指數(shù)并不是最高的，這說(shuō)明該樣本的群落均勻度較高。長(zhǎng)江站點(diǎn)的群落均勻度較磁湖站點(diǎn)高。群落豐富度方面則是秋季磁湖站點(diǎn)高，冬季長(zhǎng)江站點(diǎn)高。總體來(lái)看，兩個(gè)水域群落多樣性均是秋季大于冬季，而長(zhǎng)江站點(diǎn)的群落多樣性高于磁湖站點(diǎn)。

表2 各樣本多樣性指數(shù)

兩個(gè)水域中超微型真核浮游生物種類豐富，涵蓋各大類群，包括藻類、真菌以及原生動(dòng)物。在高階分類單元上(絕大多數(shù)在門水平)，兩個(gè)水域總共包含19個(gè)類群，此外還有大量的未分類序列(圖3)。在磁湖站點(diǎn)中，兩個(gè)季節(jié)相對(duì)豐度最高的均是綠藻，占比分別為50%(冬季)和32%(秋季)。根據(jù)優(yōu)勢(shì)度指數(shù)>0.02的標(biāo)準(zhǔn)，磁湖秋季居于優(yōu)勢(shì)的還有纖毛蟲(chóng)、Protalveolata、金藻、隱藻以及壺菌，而冬季居于優(yōu)勢(shì)的則還有隱藻、Protalveolata、纖毛蟲(chóng)以及隱真菌。長(zhǎng)江站點(diǎn)中秋季Protalveolata處于絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，秋季的優(yōu)勢(shì)類群還有纖毛蟲(chóng)、金藻、隱藻以及綠藻，此外還有一些真菌，如隱真菌和擔(dān)子菌。與秋季不一樣的是，長(zhǎng)江站點(diǎn)中冬季金藻處于絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，冬季優(yōu)勢(shì)類群還有綠藻、Protalveolata、甲藻、纖毛蟲(chóng)和隱藻。這些結(jié)果表明兩個(gè)水域的物種組成差異較大，優(yōu)勢(shì)類群也不一樣，而且優(yōu)勢(shì)類群總體上隨季節(jié)變動(dòng)而變動(dòng)。檢測(cè)到的綠藻中，主要為綠藻綱，Protalveolata主要為帕金蟲(chóng)科。在總共430個(gè)OTU中，相對(duì)豐度最高的10個(gè)OTU占總序列數(shù)的58.41%，這10個(gè)OTU分屬于綠藻、隱藻等，其中OTU3(屬于綠藻綱)在CHwin樣本中占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，而OTU2(屬于色金藻目)在CJwin樣本中占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)(圖4)。

圖3 不同樣本超微型真核浮游生物門水平變化

圖4 熱圖顯示相對(duì)豐度前十的OTU

聚類分析結(jié)果顯示(圖5)，四個(gè)樣本按季節(jié)聚成兩個(gè)大的類群。PCoA分析得到了與聚類分析類似的結(jié)果(圖6)，所測(cè)的4個(gè)樣本沿著第一軸按季節(jié)分開(kāi)，第一軸可以解釋樣品中所有差異的40.03%，表明季節(jié)對(duì)群落結(jié)構(gòu)的影響最大。第二軸將4個(gè)樣本按水域分開(kāi)，第二軸可以解釋樣品中所有差異的33.64%.這些結(jié)果表明空間對(duì)群落結(jié)構(gòu)的影響小于季節(jié)。

圖5 4個(gè)樣本群落結(jié)構(gòu)聚類分析

圖6 4個(gè)樣本群落結(jié)構(gòu)PCoA 分析

3 討論

不同水域的營(yíng)養(yǎng)和水文狀態(tài)會(huì)影響水域中的浮游生物組成[9]。本研究結(jié)果顯示，長(zhǎng)江黃石段水域超微型真核浮游生物多樣性總體上大于磁湖水域，而長(zhǎng)江黃石段水域營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)總體小于磁湖水域，這些結(jié)果提示水體營(yíng)養(yǎng)化加劇可導(dǎo)致浮游生物多樣性降低。造成長(zhǎng)江黃石段水域營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)總體小于磁湖水域的原因，可能一部分是因?yàn)殚L(zhǎng)江水體流動(dòng)性較強(qiáng)，自凈能力較強(qiáng)，而磁湖為靜止水體，自凈能力稍弱。我們的結(jié)果還顯示季節(jié)對(duì)群落結(jié)構(gòu)的影響大于空間，這可能是因?yàn)閮蓚€(gè)水域相距較近，空間因素的影響較弱，季節(jié)變動(dòng)會(huì)引起營(yíng)養(yǎng)元素及水溫的較大變化，而水溫及營(yíng)養(yǎng)元素是影響浮游生物生長(zhǎng)的關(guān)鍵因素[10，11]。金藻多分布于溫度和有機(jī)質(zhì)含量較低、透明度較大的水體，在寒冷季節(jié)生長(zhǎng)旺盛[12]。長(zhǎng)江站點(diǎn)冬季營(yíng)養(yǎng)化程度在四個(gè)樣本中最低(TLI=38.61)，這或許可以部分解釋為什么金藻在長(zhǎng)江站點(diǎn)冬季處于絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。

兩個(gè)水域的優(yōu)勢(shì)類群主要是藻類，但也有原生動(dòng)物和真菌。秋季長(zhǎng)江站點(diǎn)中隱真菌為優(yōu)勢(shì)類群，目前對(duì)隱真菌的了解還不多。隱真菌主要在水環(huán)境中發(fā)現(xiàn)，已知某些隱真菌寄生于壺菌中[13]，而壺菌寄生于初級(jí)生產(chǎn)者中[14]，這提示隱真菌有可能通過(guò)壺菌對(duì)初級(jí)生產(chǎn)者進(jìn)行調(diào)控，并在水體微食物網(wǎng)中發(fā)揮重要作用。然而有關(guān)隱真菌作用于水體微生物網(wǎng)的定量研究還極少[15]。