紅色諾卡氏菌Nr-8206株培養形態與其有效物質及雜質關系分析

王 丹，閆泉香，章朦玥，薛金艷，竇 恒，王 琳，張怡軒*

(1.沈陽藥科大學 生命科學與生物制藥學院，遼寧 沈陽 110016；2.遼寧格瑞仕特生物制藥有限公司，遼寧 本溪 117004；3.沈陽廣播電視大學，遼寧 沈陽 110003)

在全球范圍內，每年約有50余萬例新發宮頸癌患者，約有20多萬女性死于宮頸癌。據國際癌癥研究機構2018癌癥發病率和死亡率數據報告顯示，在女性中，宮頸癌的發病率和死亡率均排名第四[1]，是危害女性生命健康的主要因素之一。隨著我國“兩癌”篩查的大力推廣及宮頸癌普治工作的開展，發現農村經濟落后地區是我國宮頸癌防治的重點，但是城市女性宮頸癌的防治形勢也不容樂觀[2]。因此為解決女性痛苦，尋求一種價格低、療效好的預防及治療藥物就顯得尤為迫切。紅色諾卡氏菌為好氧菌，革蘭染色陽性，屬于放線菌[3]的一種。紅色諾卡氏菌Nr-8206株主要的有效成分為組成其細胞壁的多糖、胞壁酸和黏肽等。遼寧格瑞仕特生物制藥有限公司生產的外用紅色諾卡氏菌細胞壁骨架凍干粉制劑，以菌株Nr-8206作為生產菌株，經發酵傳代獲得菌體，其菌體經破碎、化學提取后進一步精制加工制得。外用紅色諾卡氏菌細胞壁骨架，是一種非特異性免疫調節劑，能夠提高免疫細胞CD4+T淋巴細胞[4]、CD8+T淋巴細胞[5]、巨噬細胞[6]及自然殺傷細胞[7]的活化作用和增殖促進作用，從而調節人體自身免疫系統，增強宮頸局部免疫功能，可有效清除HPV感染、治療宮頸癌前病變，預防宮頸癌[8]，臨床治療效果良好[9-10]。目前，菌株Nr-8206的不同培養形態對其生物量、有效物質的含量及其雜質殘留量的影響尚無相關研究。本研究擬通過篩選紅色諾卡氏菌株Nr-8206的不同菌株培養形態，結合不同形態生物量，研究不同形態與其有效物質及雜質之間的關系，篩選出最佳的培養形態。為企業提供高產菌株菌體及有效物質產率，從而提升產品的產量及質量，能夠給全國乃至全球女性帶來福音，具有廣泛的社會意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種來源 紅色諾卡氏菌菌株Nr-8206(NocardiarubraNr-8206)，由遼寧格瑞仕特生物制藥有限公司提供。

1.1.2 培養基 ①甘油瓊脂培養基：瓊脂20 g，蛋白胨10 g，牛肉膏5 g，氯化鈉5 g，磷酸氫二鈉0.3 g，甘油10 mL，pH 7.2～7.5，溶于1 000 mL蒸餾水中；②肉湯培養基：蛋白胨10 g，牛肉膏5 g，氯化鈉5 g，磷酸氫二鈉0.3 g，甘油10 mL，pH 7.2～7.5，溶于1 000 mL蒸餾水中。

1.1.3 試劑與儀器 阿拉伯糖對照品(WXBB6540V，SIGMA)；胞壁酸對照品(WXBB8072V，SIGMA)；血清白蛋白(牛)對照品(140619-201622，中國食品藥品檢定研究院)；牛肉膏、蛋白胨(北京奧博星生物技術有限責任公司)；其他試劑均購自國藥集團化學試劑有限公司。電子天平(JA203,上海?？惦娮觾x器廠)；自動電熱壓力蒸汽滅菌器(LDZX-40SBI，上海申安醫療器械廠)；雙人單面超凈工作臺(SW-CJ-ZD，蘇州凈化設備有限公司)；電熱恒溫鼓風干燥箱(DGG-9070A，上海森新試驗儀器有限公司)；全溫振蕩培養箱(HZL-F160，江蘇太倉華大實驗儀器科技有限公司)；臺式離心機(TGL-16B，上海安亭科學儀器廠)；光學顯微鏡(XSP-C204，重慶光電儀器有限公司)；紫外-可見分光光度計(UV-2600，島津儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 菌株復壯培養形態的分離篩選 甘油瓊脂培養基經121 ℃，30 min滅菌處理后，制成甘油瓊脂培養基平板。在超凈工作臺中，取一支菌株Nr-8206凍干管，加入300 μL無菌蒸餾水復溶，制成菌懸液，分別涂布[11]于3個平行平板，33 ℃恒溫培養8 d；依據菌落直徑大小，將所有單菌落分為小菌落(直徑0～1.0 mm)、中菌落(直徑1.0～2.0 mm)、大菌落(直徑2.0 mm以上)三類，在每一類中選取一個典型形態單菌落，分別編號為RY1、RY2、RY3。分別挑取RY1、RY2、RY3單菌落劃線，將菌株Nr-8206菌落(出發菌株)無菌蒸餾水溶解挑一環劃線，分別傳代至甘油瓊脂培養基平板上，每個菌落3個平行，33 ℃培養4 d后，用適量無菌蒸餾水懸浮菌體，5 000 r/min離心3 min，棄上清，稱重，分別配制成100 mg/mL菌懸液，每管加入200 μL該菌懸液制成一個甘油保藏管，-20 ℃保存，用于后續試驗。

1.2.2 插片法美藍染色形態觀察 將分離出的單菌落分別接種于甘油瓊脂培養基上并插片，33 ℃恒溫倒置培養4 d后，美藍染色制片于XSP-C204型光學顯微鏡下觀察其形態結構特征。

1.2.3 菌株生理生化特征 針對菌株Nr-8206的特性，設計碳氮源利用試驗、MR試驗、V-P試驗、色氨酸分解試驗、硫化氫產生試驗以及牛奶凝固與胨化、明膠液化、纖維素分解、淀粉水解、硝酸鹽還原、脲酶、淀粉酶和酯酶等生理生化試驗[12]，采用Shirling等[13]方法進行實驗并觀察記錄。

1.2.4 菌體生物量分析 將配制的甘油瓊脂培養基分裝于試管中，121 ℃滅菌30 min后制成試管斜面備用。以菌株Nr-8206(出發菌株)作為對照，分別將對照菌株及不同形態菌株在甘油瓊脂培養基平板劃線傳代，分別挑取大小相同的單菌落接種于試管斜面上，每個菌落接種3個試管斜面，33 ℃培養4 d后，10 mL無菌水清洗菌體，分別轉移至液體培養基(肉湯培養基，每個三角瓶150 mL)中，150 r/min，33 ℃培養4 d，3 000 r/min離心15 min。收集菌體，測定濕菌體含量(g/mL)。

1.2.5 有效物質及雜質測定 ①原液的獲得：取分離篩選時保藏的菌株Nr-8206(出發菌株)、RY1、RY2、RY3甘油管各一支，分別接種于1個試管斜面(甘油瓊脂培養基)，33 ℃培養4 d，每個試管斜面對應轉入1個克氏瓶內(甘油瓊脂培養基)，繼續培養4 d，再分別轉入三角瓶內(肉湯培養基)培養4 d增菌，棄去上清液，加無菌蒸餾水約100 mL，制備成菌懸液。吸取菌懸液加入克氏瓶內(每瓶加入5 mL)，RY1、RY2、RY3各接種20個克氏瓶，33 ℃培養5 d，在超凈臺下，克氏瓶內加少許無菌蒸餾水，刮洗收集菌苔，其菌懸液于3 060 r/min離心10 min，棄上清液，稱濕菌體質量，按濕菌體與無菌蒸餾水的質量比1∶4配制成菌懸液，超聲波破碎至顯微觀察無活菌，獲得產物加入鏈蛋白酶溶液(0.53 mg/mL)和胰蛋白酶溶液(8 mg/mL)聯合作用12 h，16 000 r/min離心30 min，反復清洗離心3次，除去蛋白質,除雜后稱干質量，加無菌蒸餾水將原液配制成50 mg/mL的溶液。②原液多糖含量測定[14]：分別配制20、40、50、60、80、100 μg/mL阿拉伯糖對照品工作液，純化水作空白對照，在水浴冷卻條件下，分別加入2%(質量分數)蒽酮乙酸乙酯溶液0.25 mL、濃硫酸2.0 mL，搖勻，80 ℃水浴30 min，水冷卻至室溫，625 nm波長處測定吸光度值，以吸光度為縱坐標(y)，阿拉伯糖濃度為橫坐標(x)，繪制標準曲線y=0.005 03x-0.026 84，r2=0.992 7。取原液10 μL，加純化水稀釋至1.0 mL置于一具塞試管中，與對照品工作液同法處理，625 nm波長處測定菌株Nr-8206、RY1、RY2、RY3原液濃度，每個樣品測定3份，通過計算獲得糖含量。計算公式：原液糖含量(mg/mL)=原液濃度×原液稀釋倍數/1 000。③原液胞壁酸含量測定：分別配制0.63、1.25、2.50、5.00、10.00、15.00、20.00 μg/mL胞壁酸對照品工作液，純化水作空白對照，分別加入4%硫酸銅溶液100 μL，振蕩20 s，加入6 mL濃硫酸，振蕩20 s混勻，100 ℃水浴10 min，水冷卻至室溫，加入100 μL 1.5%對羥基聯苯溶液，立即振蕩20 s混勻。25 ℃水浴呈色30 min后，100 ℃水浴90 s使溶液澄清。564 nm波長處測定吸光度值，以吸光度為縱坐標(y)，以胞壁酸濃度為橫坐標(x)，繪制標準曲線y=0.015 38x-0.001 35，r2=0.999 3。取原液20 μL，加水使其最終體積為1.0 mL至一具塞試管中，與對照品工作液同樣處理，564 nm波長處測定菌株Nr-8206、RY1、RY2、RY3原液濃度，每個樣品測定3份，計算獲得胞壁酸含量，計算公式：胞壁酸含量(μg/mL)=原液濃度×原液稀釋倍數。④原液蛋白質殘余量測定：分別配制20、40、60、80、100 μg/mL血清白蛋白(牛)對照品工作液，純化水作空白對照，分別加堿性銅試液1.0 mL，搖勻，室溫放置10 min，快速加入福林酚試液4.0 mL，搖勻，室溫放置30 min。650 nm波長處測定吸光度值，以吸光度為縱坐標(y)，以血清白蛋白(牛)濃度為橫坐標(x)，繪制標準曲線y=0.000 15x-0.002 83，r2=0.997 0。取原液50 μL(稀釋倍數為20倍)置試管內，加水至1 mL，與對照品工作液同樣處理，650 nm波長處測定菌株Nr-8206、RY1、RY2、RY3原液濃度，每個樣品測定3份，計算蛋白質含量，計算公式：

式中：原液濃度單位為μg/mL；原液稀釋倍數為20倍；原液固體總量(g/mL)=烘干后樣品質量/樣品體積×100%(105 ℃烘干至恒質量)；兩個103(即106)為原液濃度(μg/mL)與固體總量的單位換算。

2 結果與分析

2.1 菌株復壯培養形態的分離篩選

通過對菌株Nr-8206進行復壯培養(圖1)和形態統計，小菌落(直徑0～1.0 mm)占比3.63%，中菌落(直徑1.0～2.0 mm)占比58.10%，大菌落(直徑2.0 mm以上)占比38.27%。小、中、大菌落中各選出1個，共選出3個典型形態(圖2)，分別編號為RY1(圖2A)、RY2(圖2B)、RY3(圖2C)。RY1菌落直徑0.60 mm，淡黃色，突起不明顯，無褶皺，圓形；RY2菌落直徑1.68 mm，橘色，有突起，有褶皺，菌落邊緣呈絲狀；RY3菌落直徑2.56 mm，橘紅色，有突起，有褶皺，菌落邊緣呈放射狀。

圖1 紅色諾卡氏菌Nr-8206株在3個平行甘油瓊脂培養基上培養8 d的形態

圖2 紅色諾卡氏菌Nr-8206株在甘油瓊脂培養基上培養8 d挑選出的單菌落形態

2.2 菌體形態

將RY1、RY2、RY3分別接種于甘油瓊脂培養基上并插片，33 ℃培養4 d后，美藍染色光學顯微鏡下放大1 000倍觀察其結構特征(圖3)，RY1(圖3A)菌體球狀或短桿狀有橫膈膜，RY2(圖3B)菌體呈球狀或短桿狀有橫隔膜，RY3(圖3C)菌體見分支狀，可見明顯橫膈膜，菌體大部分為長鏈(或桿)狀。三種形態的菌體在顯微鏡下觀察，橫徑無明顯差別，說明遺傳穩定性高。RY1(圖3A)、RY2(圖3B)結構無明顯差別，RY3(圖3C)菌體見分支狀且多長鏈(或桿)，說明三種形態可能處于不同的生長期。

圖3 RY1、RY2、RY3三種形態的菌株培養4 d的光學顯微鏡形態

2.3 菌株生理生化特征

通過對RY1、RY2、RY3生理生化特征分析，發現三種形態的菌株生理生化特征完全一致，無差別，均表現為具有過氧化氫酶，能催化過氧化氫分解；產生脂酶能夠分解Tween-20、40、60形成暈圈，但不能分解Tween-80；硝酸鹽還原結果陽性，能夠還原硝酸鹽為亞硝酸鹽；不產生氧化酶、脲酶、淀粉酶和纖維素酶；不產生硫化氫，不能使脫脂牛奶產生凝固與胨化現象，不能使明膠產生液化現象，不能分解色氨酸，MR、V-P試驗均為陰性。能夠利用葡萄糖、果糖、巖藻糖、D-甘露糖生長代謝，對L-鼠李糖、D-半乳糖、D-木糖呈現出弱利用特征，不利用棉子糖、阿拉伯糖、麥芽糖。能夠利用纈氨酸，弱利用賴氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、丙氨酸和脯氨酸4種氮源，不利用甲硫氨酸和谷氨酸(表1)。

表1 RY1、RY2、RY3的生理生化特征

2.4 菌體生物量分析

培養及收集出發菌株Nr-8206、RY1、RY2、RY3濕菌體，測定濕菌體生物量分別為0.152 1、0.129 5、0.169 1、0.158 5 g/mL，RY2濕菌體含量最高，較Nr-8206(出發菌株)提高了11%，其次為RY3，其濕菌體含量與Nr-8206相差不多，RY1濕菌體生物量最低，降低15%(圖4A)。

2.5 有效物質及雜質測定

紫外分光光度法測得出發菌株Nr-8206、RY1、RY2、RY3的細胞壁多糖含量分別為4.5、3.4、5.2、2.2 mg/mL(圖4B)；進一步測定，測得菌株Nr-8206、RY1、RY2、RY3的胞壁酸含量分別為384、284、438、231 μg/mL(圖4C)；Nr-8206、RY1、RY2、RY3的蛋白質殘余量為8.8%、13.4%、6.9%、9.6%(圖4D)。對比分析可見，RY2的糖含量最高，是Nr-8206的1.12倍，胞壁酸含量也最高，是Nr-8206的1.14倍，蛋白質殘余量最低，較Nr-8206降低了22%。RY1糖含量、胞壁酸含量高于RY3，但低于RY2和Nr-8206，并且蛋白質殘余量最高，雜質不易去除。RY3糖含量、胞壁酸含量最低，蛋白質殘余量也高于Nr-8206，雜質也相對不容易去除。

將菌株Nr-8206、RY1、RY2及RY3生物量對比(圖4A)，RY2生物量最高，且有效物質糖含量、胞壁酸含量最高，蛋白質殘余量最低，雜質更容易去除，綜合表現最優。

圖4 紅色諾卡氏菌Nr-8206株、RY1、RY2、RY3生物量、糖含量、胞壁酸含量和蛋白質殘余量的對比結果

3 討 論

本研究通過復壯紅色諾卡氏菌Nr-8206株，經涂布后進行形態學統計，發現大、中、小三種菌落形態，每種形態各選一個典型形態進行研究分析。經對三種形態菌株進行生物量分析、有效物質糖含量、胞壁酸含量及雜質蛋白質的殘余量的測定，對比分析結果顯示，RY2為最佳培養形態，其菌落直徑1.68 mm，橘色，有突起，有褶皺，菌落邊緣呈絲狀，光學顯微觀察菌體呈球狀或短桿狀有橫隔膜。RY2發酵生物量明顯高于出發菌株Nr-8206，較其提高11%，且均高于RY1和RY3。RY2有效物質糖含量為出發菌株Nr-8206的1.12倍，胞壁酸含量為出發菌株Nr-8206的1.14倍，且均遠高于RY1和RY3。RY2雜質蛋白質的殘余量較出發菌株Nr-8206降低22%，其雜質也更容易去除，綜合表現較好。

篩選高性能、高質量的菌株，以達到提高目標有效成分產量和產率的目的[15]，為生產高附加值生物制劑提供充足的原料。菌株的優選依賴于合理的篩選途徑，可靠的試驗方法，本研究通過復壯、涂布、形態學觀察及統計分析等經典菌株篩選方法，挑選出具有典型特征的菌落形態，同時結合生物量并對菌株Nr-8206的有效物質和雜質質量指標，通過紫外可見光分光光度法測定分析，進一步確定優勢菌落形態，為今后挑取Nr-8206活性良好的菌株提供標準。通過本研究結果可知，優勢菌株RY2屬于中菌落形態，而中菌落形態占出發菌株復壯總菌落數量的58.10%，說明中菌落形態具有較強活性，選擇中菌落形態能最大限度的發揮其穩產、增產的作用[16]。本研究同時對菌株Nr-8206的三種形態分別進行了生理生化特征分析，三種形態生理生化特征無差別。這些生理生化特性對文獻參閱、種屬特性判斷以及對該菌株生理生化研究信息的補充具有重要意義。同時，本研究對于今后發酵技術的改進和分離純化都有重要的參考作用[17]。