阿特拉津降解菌ATR3的分離鑒定與土壤修復

楊立杰，施德志，彭 湃，吳 迪，楊君子，李彥成，王恩彪，孟 垚，魏小娜，李婷婷*

(1.沈陽化工研究院有限公司，遼寧 沈陽 110021；2.遼寧石油化工大學 環(huán)境與生物工程學院，遼寧 撫順 113001)

阿特拉津因效率高、價格低廉，是我國玉米田施用最廣泛的除草劑之一。但阿特拉津的使用量大，半衰期長(在水體中的半衰期為41～237 d，在土壤中的半衰期為8～99 d)，且存在條件不同其半衰期也存在差異[1-2]。同時由于阿特拉津溶解性較好，遷移率高，很容易造成水體和環(huán)境的污染，因此阿特拉津作為一種典型的有機污染物所引發(fā)的生態(tài)和環(huán)境問題也日益嚴重[3]。阿特拉津在土壤和水體中的主要降解方式為生物降解[4]。隨著研究的深入，已有很多降解阿特拉津的單一菌株或者復合菌株被發(fā)現(xiàn)，由于氣候和生態(tài)環(huán)境因素對微生物有較大的影響，所以同一菌株在不同土壤不同環(huán)境條件下的降解能力存在較大差異[5]。同時，對于阿特拉津的吸附、解吸附、毒性及在水體中的降解途徑也做了大量研究[6-8]。然而，目前已有的研究多集中在降解菌株的篩選，降解試驗也局限在培養(yǎng)基[9-10]。由于不同區(qū)域、不同土壤類型中的阿特拉津降解菌的特征存在差異，土壤環(huán)境相較于培養(yǎng)基營養(yǎng)相對貧瘠，成分更為復雜，在培養(yǎng)基中具有高效降解活性的微生物往往無法在土壤中維持較高的數(shù)量，也就無法體現(xiàn)出其修復功能[11]。這就使得理論研究與實際土壤修復工作出現(xiàn)斷層。室內模擬修復實驗可以避開原位實驗中很多不可控因素(如溫度、濕度等)，消除了隨機誤差對實驗結果的影響，同時又能模擬大田的土壤環(huán)境，是連接理論研究與原位修復工作的重要橋梁[12]。本研究旨在從長期接觸阿特拉津的污染土壤中馴化分離可利用阿特拉津為唯一氮源、具有高效修復能力的細菌，并對其進行菌種鑒定和降解特性的研究。在此基礎上，通過室內模擬的污染土壤修復實驗，考察降解菌對土壤中阿特拉津的殘留及對植物的解毒效果。以敏感作物玉米為研究對象，觀察不同土壤類型中阿特拉津對玉米植株生長發(fā)育的影響以及降解菌株對玉米的解毒作用，為阿特拉津污染土壤的原位修復提供必要的參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試土壤 菌株篩選土壤采自遼寧省沈陽市施用阿特拉津10余年的玉米田表層土(0～10 cm)，盆栽試驗土壤采自遼寧省沈陽市、遼寧省朝陽市、黑龍江省大慶市從未施用過阿特拉津的土壤，采樣點信息和基本理化性質見表1。

表1 供試土壤基本理化性質

1.1.2 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基和基礎無機鹽培養(yǎng)基采用常規(guī)方法配置。唯一氮源培養(yǎng)基(g/L)：K2HPO41.79，KH2PO40.45，MgSO4·7H2O 0.10，NaCl 0.40，葡萄糖10.00，1 mL微量元素儲存液，pH 7.0。根據(jù)實驗要求加入一定量的阿特拉津原藥。微量元素配方(g/L)：FeSO4·7H2O 2.0，MnSO4·H2O 2.0，CuSO4·5H2O 0.8，ZnSO4·7H2O 10.0，Na2MoO4·2H2O 0.5，Na2B4O7·10H2O 0.4，EDTA 5.0。配置固體培養(yǎng)基時，瓊脂粉添加量為15 g/L。115 ℃滅菌20 min備用。

1.1.3 主要儀器與試劑 高效液相色譜儀(Agilent 1100，Agilent，USA)；色譜柱(150 mm×4.6 mm)(Ultimate XB-C18，Agilent, USA)；高速冷凍離心機(D3024R，北京大龍興創(chuàng)試驗儀器有限公司)；立式高壓蒸汽滅菌鍋(LDZX-50KB，上海申安醫(yī)療器械廠)；基因擴增儀(ETC811PCR，北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司)；電泳設備(ESP600，上海天能科技有限公司)。阿特拉津原藥購自上海安普科學儀器有限公司(純度98%以上)；其他常規(guī)試劑均購自中國醫(yī)藥集團有限公司，液相色譜儀所用試劑均為色譜純。

1.2 方法

1.2.1 阿特拉津降解菌的富集和分離 10 g 污染土加入盛有 100 mL 唯一氮源培養(yǎng)基(阿特拉津濃度 100 mg/L)的250 mL 三角瓶中，30 ℃，180 r/min 培養(yǎng)7 d，取 10 mL 懸濁液接入100 mL 新鮮的含高濃度阿特拉津(200 mg/L)的唯一氮源培養(yǎng)基中繼續(xù)富集培養(yǎng)，每次富集培養(yǎng)時，培養(yǎng)基中的阿特拉津質量濃度均較前次增加100 mg/L，直至阿特拉津在培養(yǎng)基中的質量濃度達到1 000 mg/L。部分富集的菌懸液于-80 ℃保存，其余用于后續(xù)試驗。最終富集的菌液進行10-2、10-3、10-4、10-5和10-6梯度稀釋并涂布于唯一氮源培養(yǎng)基(含1 000 mg/L阿特拉津)，分別將長出的菌落劃線分離純化并將純化的單菌落斜面保存。

1.2.2 降解菌的篩選及降解能力測定 將分離純化的單菌落分別接入LB液體培養(yǎng)基中，30 ℃，180 r/min 培養(yǎng)過夜，收集菌體，生理鹽水洗滌 2 次，制備成OD600值為1.0 的菌懸液，2%接種量接種到以阿特拉津為唯一氮源的無機鹽培養(yǎng)基中(阿特拉津質量濃度1 000 mg/L)，30 ℃，180 r/min 培養(yǎng)72 h。空白對照不加菌。每個處理3個重復，每隔4 h取樣，測定培養(yǎng)液的OD600值和殘留的阿特拉津含量。高效液相色譜測定農藥阿特拉津殘留量，色譜條件為流動相：V甲醇∶V水=4∶1；流速1.0 mL/min；進樣量 5 μL；檢測波長220 nm；色譜柱Ultimate XB-C18(150 mm×4.6 mm)。根據(jù)對照和各樣品的殘留濃度計算去除率，取去除率最高的菌株進行后續(xù)實驗。

1.2.3 高效降解菌的鑒定 菌株的形態(tài)及生理生化特性測定參照文獻[13]。16S rRNA 基因克隆參照文獻[12]，F(xiàn)ast DNA SPIN Kit for Soil試劑盒提取菌體總DNA，16S rRNA 的通 用 引 物 27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和 1492R(5′-CGGTTACCCTTGTTACGACTTC-3′)進行 PCR 擴增反應，序列測定由上海生工生物工程股份有限公司完成，將測序結果用BLAST軟件與GenBank 數(shù)據(jù)庫中的相關 16S rRNA 基因序列進行同源性比對分析。調取相似性高的菌株16S rRNA 序列，經(jīng)Clasta X軟件包比對后導入 MEGA(version 5.1)軟件中構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 高效降解菌的土壤修復試驗 將采集的棕壤、褐土和黑土過篩，設置3個處理，每個處理3個重復，并分別裝于花盆中。①CK：自然土不做處理；②T1處理：添加阿特拉津4 mg/kg；③T2處理：添加阿特拉津4 mg/kg+降解菌(1.0×108cfu/g)。挑選籽粒飽滿，形狀規(guī)則的玉米種子，播種于各處理土壤中，每盆播種 5粒。室溫培養(yǎng)，觀察并記錄不同處理土壤玉米種子的出苗率、株高、根長、干質量等數(shù)據(jù)。從添加阿特拉津當天開始計時，分別于第 0、7、14天，檢測土壤中阿特拉津的殘留量，檢測方法參照文獻[14]，origin 8.0畫圖，SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 降解菌的富集、分離及其生理生化鑒定

菌落經(jīng)分離純化以及高效液相色譜定量分析，從長期施用阿特拉津的玉米田土壤中分離出一株高效降解菌菌株ATR3。該菌在添加200 mg/L阿特拉津作為唯一氮源的培養(yǎng)基上形成較明顯的透明圈，接種24 h后，菌落周圍的阿特拉津去除率為96%。

光學顯微鏡下觀察，該菌幼齡菌桿狀，老齡菌球狀，有明顯的桿、球變化，無鞭毛；LB平板上菌落光滑，表面凸起，圓形，呈亮黃色。革蘭染色陽性，M.R(甲基紅實驗)、V.P(乙酰甲基甲醇試驗)陰性，不水解淀粉，不水解明膠，氧化酶陰性，接觸酶陽性。經(jīng)PCR擴增后，得到長約1 500 bp的16S rRNA片段(圖1)。通過NCBI的BLAST比對結果表明，菌株ATR3的16S rRNA基因序列與多株節(jié)桿菌屬(Arthrobactersp.)的同源性在99%以上。系統(tǒng)進化樹(圖2)比對結果表明，菌株ATR3與節(jié)桿菌屬菌株Arthrobacterkeyseri親緣關系最近，在同一聚類分支。結合菌株ATR3生理生化分析和分子鑒定結果，確定菌株ATR3為節(jié)桿菌屬(Arthrobactersp.)。

圖1 16S rRNA 片段的擴增

圖2 菌株ATR3 16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2 培養(yǎng)時間對降解菌ATR3生長和阿特拉津殘留率的影響

利用紫外分光光度計和高效液相色譜對培養(yǎng)基中阿特拉津的含量進行檢測，分別得到菌株ATR3的生長曲線和阿特拉津降解曲線，如圖3所示。從圖3可以看出，0～45 h為菌株ATR3的對數(shù)生長期；72 h后進入穩(wěn)定期。培養(yǎng)12 h后，對阿特拉津的降解效率為50%，培養(yǎng)18 h后，降解效率為62%；培養(yǎng)24 h后，降解效率為92%，培養(yǎng)48 h后，降解效率為97%。

圖3 降解菌ATR3生長和阿特拉津殘留率

2.3 降解菌ATR3對不同類型土壤修復效果

降解菌土壤修復試驗結果顯示，在不添加降解菌ATR3的含農藥土壤中，由于化學水解作用和土壤中土著微生物的分解代謝，棕壤、褐土和黑土中的阿特拉津濃度均有一定量的降解，但阿特拉津降解菌ATR3加入到土壤后，阿特拉津的去除效率明顯提高，14 d后，阿特拉津(4 mg/kg)在土壤中的去除率為98.75%(圖4)。阿特拉津在三種土壤中的去除速率也存在一定的差異，無論是否加入降解菌，阿特拉津在棕壤中降解最快；14 d后，T1和T2處理阿特拉津降解去除率大于99%。7 d后，褐土不添加降解菌的T1處理，阿特拉津殘留率為24.01%，加入降解菌ATR3的T2處理，殘留率為5.25%，14 d后，T1處理阿特拉津殘留率為4.02%，T2處理殘留率為0.15%。14 d后，黑土中殘留率為18.84%，去除速率最慢。加入降解菌的T2處理后，阿特拉津殘留率僅為1.25%。說明阿特拉津去除與土壤pH、黏粒含量和土壤有機質等理化性質密切相關。

圖4 不同處理土壤中阿特拉津殘留量

2.4 降解菌ATR3施用后對玉米生長的影響

不同處理玉米幼苗出苗率、根長、株高和干質量隨時間變化結果如表1所示。當玉米種植于阿特拉津含量為4 mg/kg的土壤時，添加降解菌劑、污染處理與未污染處理土壤相比，各處理玉米出苗率存在一定的差異，但差異不顯著。玉米根長和株高與未受阿特拉津污染的土壤處理(CK)相比受到抑制。添加降解菌劑(T2)后，玉米根長與株高受到的抑制作用減小。7 d時三種處理玉米生物量存在一定的差異，變化趨勢與根長和株高結果一致；14 d時，阿特拉津污染條件下玉米生物量與對照相比受到明顯影響，表明隨著種植時間延長抑制效果逐漸增強，而添加修復菌劑處理的污染土壤(T2)，14 d時玉米生物量較污染處理(T1)略有增加，但促進效果不顯著。與棕壤和褐土相比，T1處理的玉米出苗率、株高、根長、干質量均受到抑制，加入降解菌ATR3后，抑制作用明顯緩解，玉米植物的各項指標基本恢復正常，與不添加阿特拉津處理(CK)相比無顯著差異，說明T2處理中殘留的阿特拉津濃度不足以對玉米生長產生抑制作用。

表1 降解菌ATR3施用后對玉米生長指標的影響

3 討 論

阿特拉津作為一種藥效高、用量少的三嗪類除草劑，目前主要用于玉米田闊葉雜草的防治，由于其結構穩(wěn)定，具有隱形藥害，可在土壤中長時間殘留，在水體和土壤中的主要降解方式是微生物降解[2，13]。本研究篩選的阿特拉津降解菌屬于節(jié)桿菌屬，該菌屬細菌具有很強的抗旱性、耐餓性和耐鹽性，通常被認為是土壤中的優(yōu)勢菌[15]，因此本研究篩選的阿特拉津降解菌具有很好的土壤修復前景。國內外研究中報道的阿特拉津降解菌的降解效率不盡相同。主要是農藥的微生物降解受很多因素的影響，例如培養(yǎng)時間、溫度、農藥濃度、pH、濕度、農藥性質、土壤C/N、土壤有機質含量以及碳源和氮源的存在與否等[16-18]。前人對阿特拉津污染土壤的生物修復作用研究，大多集中在菌株(FM326、LY2、MSD6等)[4，7]對土壤中阿特拉津的去除率上，而對后茬敏感作物的修復指標研究的報道較少。李紅梅等[11]和劉春光等[12]的研究表明，菌株在一定時間內能解除阿特拉津對單一土壤敏感作物小麥及水稻產生的藥害。本研究的降解菌ATR3以阿特拉津為唯一氮源，48 h內對1 000 mg/L阿特拉津的降解率達97%，不同土壤類型玉米盆栽試驗結果表明，菌株ATR3在短期內都能有效解除阿特拉津對敏感作物玉米產生的藥害。說明該菌株能有效去除不同類型土壤中阿特拉津殘留。本研究通過測定盆栽玉米的各項生物學指標，表明菌株ATR3處理污染土壤14 d后，可明顯恢復敏感作物玉米的各項生物指標(株高、鮮重、干質量)，且對玉米無明顯藥害，顯示出較好的修復效果，說明菌株ATR3可以修復阿特拉津污染土壤。檢測阿特拉津在土壤中的殘留量結果表明，本研究篩選的阿特拉津降解菌ATR3能有效去除土壤中的阿特拉津殘留，可為阿特拉津的微生物修復提供有價值的菌種資源。另外，除草劑在降解過程中還受到土壤有機質、質地和其他因素影響[20-21]。本研究中的阿特拉津在棕壤、褐土和黑土中的去除速率存在顯著差異，其中阿特拉津在棕壤中去除最快，褐土次之，黑土中去除最慢。由三種土壤的基本理化性質可知，黑土的有機質含量最高，棕壤最低。南超[22]研究發(fā)現(xiàn)，有機質含量與農藥降解能力呈負相關關系，這也是黑土中阿特拉津危害更為嚴重的原因之一，有機質相對含量較高的土壤，阿特拉津更易與其中的有機物發(fā)生相互作用，影響代謝速率，這與本研究結果相似。因此，在今后的研究中，應重點關注黑土中農藥降解菌的篩選以及對土壤的修復效果。