蜂房栓劑制備工藝及抑痔藥效學研究

王紹仙 趙若丹 王 瑩 王玉新 陳旭冰

大理大學藥學院，云南 大理 671000

痔瘡是直腸下端的肛墊出現病理性肥大的表現，民間常說“十人九痔”，可見痔瘡是一種常見病，其臨床表現為局部炎癥、水腫、疼痛、糜爛、便血，甚則脫肛[1-2]。在痔瘡的諸多治療方法中，局部給藥能直接作用于發病部位，更好地發揮藥效，是一種較理想的給藥途徑，其中以栓劑應用最為廣泛。栓劑對初期內痔及二、三期內痔有止血、止痛、收斂、消炎等作用，對全身癥狀和直腸炎癥也有治療作用。蜂房是胡蜂的巢，《本草綱目》、《本草綱目彩色藥圖》記載，蜂房具有祛風、攻毒、殺蟲、止痛的功效，可以治療痔瘡[3-4], 《神農本草經》也記載，蜂房能治腸痔。現代研究[5]發現，蜂房中含有黃酮類化合物，黃酮類化合物具有抗炎的作用，為古籍療法提供了一定的科學依據。為了探討蜂房對痔瘡的治療作用，本文將蜂房提取物制成栓劑，并進行了藥效學評價。

1 材料與儀器

1.1 材料 金環胡蜂蜂房購自云南省大理市下關鎮，經云南省昆蟲生物醫藥研發重點實驗室楊自忠教授鑒定為膜翅目(Hymenoptera)胡蜂科(Vespidae)胡蜂屬(Polistes)昆蟲金環胡蜂Vespa mandarinia Smith的蜂房。乙醇為國產分析純，水為蒸餾水，蘆丁標準品(批號：100080-200707，中國藥品生物制品檢定所)，混合脂肪酸甘油酯(批號：20160928，上海源葉生物科技有限公司)。

1.2 儀器 R-210旋轉蒸發儀(瑞士Buchi公司)，JY2002電子天平(上海精其儀器有限公司)，METTLER TOLEDO分析天平(上海梅特勒—托利多儀器有限公司)，HWS-12型電熱恒溫水浴鍋(上海一恒科學儀器有限公司)，DHG-9030A電熱恒溫鼓風干燥箱(鞏義市予華儀器有限責任公司)，搖擺式中藥粉碎機(上海燁昌食品機械有限公司)。

2 栓劑的制備

2.1 浸膏的制備 取金環胡蜂蜂房(如圖1所示)1000 g，加入3000 mL 50%乙醇加熱回流提取2 h，提取液經棉花過濾后用旋轉蒸發儀減壓濃縮后得浸膏，將浸膏置于電熱恒溫鼓風干燥箱內在70℃條件下烘4 h，恒重，得浸膏100 g，研磨，過80目篩，備用。

圖1 金環胡蜂蜂房

2.2 總黃酮含量的測定

2.2.1 蘆丁標準品溶液的制備 精密稱取0.0106 g蘆丁，加入適量50%乙醇完全溶解后轉移至25 mL的棕色容量瓶中，定容，備用。

2.2.2 顯色方法 取待測樣品溶液1 mL于l0 mL比色管中，加50%乙醇定容至2.0 mL。加入5%的亞硝酸鈉溶液0.5 mL，混勻，靜置6 min后加入10%的硝酸鋁溶液0.5 mL，混勻，靜置6 min后再加入4%的氫氧化鈉溶液4.0 mL，用50%的乙醇定容，靜置15 min后測定吸光度。取1 mL 50%乙醇溶液作為待測樣品按上述操作配制空白對照溶液[5]。

2.2.3 標準曲線繪制 分別取蘆丁標準品0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL于10 mL棕色容量瓶中，按上述顯色方法顯色后，在360 nm波長處測定吸光度值。每個樣品重復操作3次取平均值，以濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線[5]。

2.2.4 總黃酮含量的測定 取0.02 g浸膏溶于10 mL甲醇溶液中，取1 mL溶液按上述操作步驟測定吸光度值，測3次取平均值，將吸光度值帶入回歸方程，得到總黃酮的濃度，計算出總黃酮的含量為0.39 mg/g。

2.3 主藥劑量確定 露蜂房浸膏粉在每枚栓中的含量根據總黃酮的含量和臨床栓劑質量確定。

2.4 栓劑的制備

2.4.1 純基質栓的制備 將10 g混合脂肪酸甘油酯置于蒸發皿中，70 ℃條件下水浴加熱至熔化，灌入涂有液體石蠟油的栓模中，靜置凝固，削去溢出部分，啟模(如圖2所示)，選取5枚稱重分別為0.98、0.95、0.96、0.94、0.97 g，平均栓重G為0.96 g。

圖2 純基質栓

2.4.2 含藥栓的制備 將混合脂肪酸甘油酯置于蒸發皿中，70 ℃條件下水浴加熱至熔化，再加露蜂房浸膏粉，灌入涂有液體石蠟油的栓模中，靜置凝固，削去溢出部分，啟模(如圖3所示)，選取5枚稱重分別為1.24、1.23、1.21、1.22、1.20 g，平均栓重M為1.22。

圖3 蜂房栓

2.4.3 計算置換價 根據公式DV=W/[G-(M-W)]計算置換價，W為一枚含藥栓中的平均含藥質量，經計算置換價為1.62。

2.4.4 處方最大含藥量確定 稱取3份20 g混合脂肪酸甘油酯于70℃條件下水浴加熱至熔化，分別加入5 g、10 g和15 g露蜂房浸膏粉，灌入涂有液體石蠟油的栓模中，靜置凝固，削去溢出部分，啟模，分別得到含主藥20%、33%和43%的栓劑。以外觀、成型和硬度為指標進行評價，選擇最大含藥量為33%。

2.4.5 融變時限 將自制蜂房栓3枚，分別置于融變儀中測定融變時限。3枚蜂房栓均在(22±2)內融化、軟化，符合油脂性基質要求。

3 蜂房栓對痔瘡的作用

3.1 材料

3.1.1 實驗動物 SD大鼠，6周齡，SPF級，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物合格證號：S(湘)2016-0002。25 ℃室溫喂養，給予大鼠專用標準飼料、純凈水，自由取食飲水，所有實驗研究均符合中國倫理委員會有關動物研究指導原則。

3.1.2 藥品及試劑 IL-1β試劑盒(批號：20170901)、IL-6 試劑盒(批號：20170901)、TNF-α試劑盒(批號：20170901)、iNOS試劑盒(批號：20170901)等均購自南京建成生物工程研究所。

3.2 方法

3.2.1 分組 50只大鼠按隨機數字表隨機分為空白組、模型組、治療組高、低劑量組和陽性藥組(消炎痛栓組)，每組10只。

3.2.2 造模 空白組大鼠未處理，其余組用水合氯醛行腹腔麻醉。模型組和實驗組均用浸吸巴豆油混合液的棉球插入麻醉后的大鼠肚門內，將大鼠頭朝上提起直立，10 s后拔出[6]。

3.2.3 給藥 陽性對照組和受試藥組分別給予消炎痛栓和蜂房栓劑，加熱融化后，按大鼠重量制成小塊納入大鼠肛門，并用膠布固定。除空白組和模型組外，其余組于造模6 h后開始給藥，共給藥2次，每次間隔6 h。末次給藥6 h后，動物處死取肛周組織。

3.2.4 取材 實驗結束后，處死實驗動物，以棉簽插入肛門為指引，沿肛周0.5 cm環形分離肚門，深至直腸上1.0～1.5 cm，剪斷腸管，冰浴上充分研磨，離心后取其上清液移至管中放入冰箱保存。

3.3 結果

3.3.1 肛周組織形態改變 空白組大鼠肛門回縮，無水腫等異常情況；模型組大鼠肛周組可見紅腫，大量分泌物，偶見輕度糜爛，未見出血點。陽性藥組大鼠肛周組織仍有輕度紅腫，但無分泌物、糜爛和出血。蜂房栓劑低劑量組大鼠肛周組中度紅腫，有少量分泌物，無出血和糜爛。蜂房栓劑高劑量組大鼠肛周組輕度紅腫，有少量分泌物，無出血和糜爛。如表1。

表1 蜂房栓劑對肛周組織形態的影響

3.3.2 蜂房栓劑對TNF-α、IL-6、IL-1β和iNOS含量的影響 與正常對照組比較，模型對照組大鼠組織中TNF-α、IL-6、IL-1β及iNOS含量顯著升高(P<0.01)。與模型對照組相比，陽性組大鼠組織中TNF-α、IL-6、IL-1β、iNOS含量顯著降低 (P<0.01)，低劑量組除iNOS含量顯著降低外(P<0.01)，對其它炎癥因子無明顯影響，高劑量組顯著降低組織中TNF-α、IL-6、IL-1β及iNOS含量(P<0.05或P<0.01)。結果見表2。

表2 蜂房栓劑對肛周及直腸組織中炎癥因子的影響

4 討論

栓劑形式給藥既可以避免胃酸和消化道酶對藥物的破壞，又可以避免藥物對胃黏膜的刺激，同時能直接作用于病灶部位而迅速發揮作用，提高患者的生活質量，栓劑在腔道給藥中尤其具有優勢[7]。栓劑的制備過程中，基質的選擇尤為重要，在預實驗時分別選用水溶性基質聚乙二醇(PEG)和脂溶性基質混合脂肪酸甘油酯為栓劑基質，以外觀、成型和硬度為指標進行評價，發現混合脂肪酸甘油酯為基質制備的栓劑優于聚乙二醇為基質制備的栓劑，因此選擇混合脂肪酸甘油酯為栓劑基質。民間常用蜂房喂牛、馬等牲畜來預防疾病?！侗静菥V目》記載，蜂房可以治療痔瘡，但對其抑痔作用的藥效學研究未見報道。為進一步深入挖掘蜂房的藥用價值，本研究將蜂房提取物制成栓劑，并進行了初步的藥效學評價，發現蜂房栓劑明顯減輕痔周組織的炎癥反應，模型動物肛周紅腫范圍明顯縮小，分泌物減少，炎癥因子顯著降低，結果證明蜂房栓劑對痔瘡有一定的治療作用，在治療痔瘡上具有開發價值。另有報道稱其藥效作用物質可能為黃酮類化合物[5，8]，蜂房藥效物質基礎至今仍不明確，還需進一步研究。