基因編輯技術(shù)及CRISPR/Cas系統(tǒng)在草地植物開(kāi)發(fā)中的應(yīng)用

朱麗珍 王芳 王婭麗 何軍 李彥龍 田英

摘要：隨著高通量測(cè)序技術(shù)的興起，功能基因組學(xué)研究得以迅猛發(fā)展。基因組定點(diǎn)修飾技術(shù)作為一項(xiàng)研究特定基因功能的工具，對(duì)功能基因組學(xué)的研究具有極強(qiáng)的推動(dòng)作用。CRISPR/Cas系統(tǒng)是一種適應(yīng)性免疫防御系統(tǒng)，在細(xì)菌、古細(xì)菌的長(zhǎng)期演化過(guò)程中形成，用于對(duì)抗入侵的病毒及外源DNA。通過(guò)對(duì)各種基因編輯技術(shù)的對(duì)比，發(fā)現(xiàn)相比于DNA同源重組、鋅指核酸酶（ZFNs）和轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶（TALENs）等技術(shù)，基于RNA指導(dǎo)的CRISPR/Cas系統(tǒng)為基因組定點(diǎn)編輯開(kāi)辟了一條新的道路，在基因功能研究中具有效率高、成本低、易于操作等顯著優(yōu)點(diǎn)。從作用機(jī)制和發(fā)展歷程等方面對(duì)目前基因編輯的4種技術(shù)進(jìn)行簡(jiǎn)述，進(jìn)一步總結(jié)CRISPR/Cas系統(tǒng)在經(jīng)濟(jì)林木、作物、植物病毒和牧草植物功能基因組編輯中的研究應(yīng)用，以期為促進(jìn)基因編輯技術(shù)在農(nóng)牧生產(chǎn)中的應(yīng)用提供參考。

關(guān)鍵詞：基因編輯;CRISPR/Cas系統(tǒng);草地植物開(kāi)發(fā);生產(chǎn)應(yīng)用;功能基因組

中圖分類號(hào)：S188; Q78? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2021）20-0022-08

收稿日期：2021-02-01

基金項(xiàng)目：寧夏自然科學(xué)基金（編號(hào)：2018AAC03223）;寧夏高等學(xué)校科學(xué)研究項(xiàng)目（編號(hào)：NGY2018008）;寧夏農(nóng)林科學(xué)院農(nóng)業(yè)高質(zhì)量發(fā)展和生態(tài)保護(hù)科技創(chuàng)新示范課題（編號(hào)：NGSB-2021-2-01）。

作者簡(jiǎn)介：朱麗珍（1990—），女，山東菏澤人，博士研究生，助理研究員，主要從事植物資源開(kāi)發(fā)利用研究。E-mail：lizhenzhu916@163.com。

通信作者：田 英，博士，副研究員，主要從事逆境植物資源開(kāi)發(fā)利用研究。E-mail：tianying_1982@126.com。

結(jié)構(gòu)基因組學(xué)和功能基因組學(xué)是基因組學(xué)的兩大主要研究?jī)?nèi)容，其中結(jié)構(gòu)基因組學(xué)研究旨在揭示基因的結(jié)構(gòu)、序列信息及基因的定位和編輯機(jī)制等;功能基因組的研究旨在揭示基因的功能和進(jìn)化原理。近年來(lái)，動(dòng)植物物種全基因組測(cè)序飛速發(fā)展，測(cè)序結(jié)果陸續(xù)公布，大大推動(dòng)了各組學(xué)的研究進(jìn)展，功能基因組研究成為了研究的主流。基因組定點(diǎn)修飾技術(shù)是在基因組的精確位點(diǎn)上進(jìn)行靶向修飾改造的技術(shù)，是目前研究基因功能的有利工具，對(duì)改造和驗(yàn)證特定基因的功能具有重要意義。

基因組編輯（genome editing，GE）作為基因組定點(diǎn)修飾技術(shù)，是當(dāng)前生命科學(xué)研究的前沿領(lǐng)域[1]。目前，基因組編輯方法主要包括DNA同源重組技術(shù)、鋅指核酸酶（zinc finger nucleases，ZFNs）技術(shù)、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶（transcription activator-like effector nucleases，TALENs）技術(shù)以及CRISPR/Cas（clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated proteins） 技術(shù)等，其中CRISPR/Cas9系統(tǒng)最便捷、高效，應(yīng)用也最廣泛[2]。目前，CRISPR/Cas9技術(shù)已應(yīng)用于人類遺傳病治療[3]、細(xì)胞個(gè)性化治療[4]、新藥開(kāi)發(fā)[5]及作物遺傳改良[6]等領(lǐng)域。這些基因編輯技術(shù)的使用，使得生物體基因組DNA的靶向修飾成為可能。

1 基因編輯技術(shù)

1.1 DNA同源重組技術(shù)

DNA雙鏈之間可發(fā)生核酸信息的交換和重組，根據(jù)這一原理可以進(jìn)行基因組的靶向修飾，亦稱為同源重組。該技術(shù)的具體操作方法是通過(guò)將人為改造后獲得的重組DNA通過(guò)同源重組技術(shù)轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞核內(nèi)，經(jīng)過(guò)同源重組作用，受體細(xì)胞內(nèi)原始的基因序列被重組的DNA序列替換，最終達(dá)到敲除受體細(xì)胞內(nèi)靶基因序列的目的。

DNA同源重組技術(shù)是基因編輯初期的基因組靶向修飾技術(shù)，雖然該技術(shù)能導(dǎo)致目的基因失活，但是難以突破遠(yuǎn)緣雜交不親和的障礙，不能產(chǎn)生新的基因，因此應(yīng)用范圍較為狹窄。Kim等研究發(fā)現(xiàn)，在高等植物和動(dòng)物細(xì)胞中，外源DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞后與靶標(biāo)DNA序列同源重組的概率十分低，僅為0.9%左右，過(guò)低的靶向修飾效率大大影響了DNA同源重組技術(shù)的發(fā)展[7]。

1.2 ZFNs技術(shù)

ZFNs技術(shù)，即鋅指核酸酶技術(shù)，是通過(guò)人工合成核酸內(nèi)切酶，進(jìn)而對(duì)目的基因進(jìn)行定點(diǎn)修飾的技術(shù)[8]。ZFNs技術(shù)在DNA水平上進(jìn)行靶基因的定向修飾，修飾效率可以達(dá)到10%及以上，并且可以穩(wěn)定遺傳給后代[9]。隨著鋅指核酸酶技術(shù)的開(kāi)發(fā)，ZFNs技術(shù)被廣泛應(yīng)用于多種動(dòng)植物中，Sander等利用CoDA（使用標(biāo)準(zhǔn)克隆技術(shù)或自定義DNA合成來(lái)設(shè)計(jì)ZFNs）ZFNs技術(shù)，快速改變了斑馬魚、擬南芥和大豆的20個(gè)基因[10]，CoDA的簡(jiǎn)單和有效使用，促使ZFNs技術(shù)的廣泛應(yīng)用成為可能，并為該技術(shù)運(yùn)用到多基因通路或全基因組改變等方向成為可能。此外，ZFNs技術(shù)還被應(yīng)用到人體培養(yǎng)細(xì)胞上，并從基因上改變了CD4+T細(xì)胞對(duì)HIV-1的抗性[11]。此外，該技術(shù)還被應(yīng)用到小鼠、果蠅[12]及黑麥草[13]、水稻[14]等的研究中。

然而，ZFNs技術(shù)在基因操作的過(guò)程中，由于隨機(jī)插入外源基因，容易出現(xiàn)突變和不易調(diào)控等，并且脫靶效應(yīng)較為嚴(yán)重，因此缺乏DNA靶定特異性[15]，而這種DNA的靶定非特異性，易引發(fā)細(xì)胞毒性效應(yīng)[16]，對(duì)受體細(xì)胞的活性產(chǎn)生不利影響。

1.3 TALENs技術(shù)

TALENs技術(shù)是一種新型的基因定點(diǎn)修飾技術(shù)，是基于TALE核酸酶的一種嶄新的分子生物學(xué)工具[17]，被稱為2012年度十大科學(xué)突破之一。Cermak等對(duì)TALENs技術(shù)進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，它主要由TALE蛋白和FokⅠ核酸內(nèi)切酶2個(gè)元件組成，并且2個(gè)元件分工不同，隨后將TALE蛋白與Fok Ⅰ核酸內(nèi)切酶融合，發(fā)現(xiàn)TALE蛋白在此過(guò)程中負(fù)責(zé)特異性結(jié)合DNA序列，F(xiàn)okⅠ核酸內(nèi)切酶負(fù)責(zé)在受體細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮剪切作用[18]。TALE特異性結(jié)合DNA的模式是一種特殊編碼模式，可根據(jù)需求對(duì)任意靶基因的DNA序列進(jìn)行人工設(shè)計(jì)，進(jìn)而合成相應(yīng)的TALE蛋白，無(wú)基因序列、細(xì)胞、物種的限制[18-19]。

自TALE序列被完全破譯后，TALENs技術(shù)開(kāi)始得到普及。TALENs的特異性切割活性在酵母[20]、擬南芥[21-22]、水稻[23]及斑馬魚[10]等多個(gè)動(dòng)植物體系和體外培養(yǎng)細(xì)胞中得以驗(yàn)證。2014年魏文盛所在課題組依托一種自主研發(fā)的TALE蛋白組裝技術(shù)完成了全部TALE元件的解碼工作[24]。自2011年TALENs技術(shù)被首次成功運(yùn)用于基因定點(diǎn)修飾[25]以來(lái)，發(fā)展十分迅速并在全球范圍內(nèi)廣泛應(yīng)用[26]。

與ZFNs相比，TALENs結(jié)合DNA的方式更便于預(yù)測(cè)和設(shè)計(jì)靶向基因序列，TALE蛋白的組裝和構(gòu)建有助于實(shí)現(xiàn)大規(guī)模和高通量的組裝;此外，TALENs的特異性比ZFNs高，且毒性和脫靶性相對(duì)較低[27]。因此可以看出，TALENs技術(shù)是基因定點(diǎn)修飾發(fā)展史上又一新的里程碑，它特異性高、定點(diǎn)突變、穩(wěn)定遺傳等技術(shù)特點(diǎn)，促使它被廣泛應(yīng)用于各種動(dòng)植物的基因定點(diǎn)修飾中。但是，在TALENs技術(shù)的應(yīng)用中也暴露了很多缺點(diǎn)，例如導(dǎo)致細(xì)胞毒性、模塊組裝過(guò)于繁瑣、測(cè)序工作量大，并且一般只能由大型的測(cè)序公司完成，成本和代價(jià)較高等，大大限制了TALENs技術(shù)的完善和發(fā)展[28]。

1.4 CRISPR/Cas技術(shù)

CRISPR指廣泛存在于細(xì)菌和古細(xì)菌基因組中的成簇且具有規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列，與防御機(jī)制相關(guān);Cas能夠以一種序列依賴性的方式對(duì)DNA進(jìn)行靶向切割作用，是一種與CRISPR系統(tǒng)關(guān)聯(lián)的蛋白質(zhì)和基因家族的簡(jiǎn)稱[29]。CRISPR/Cas原理見(jiàn)圖1。CRISPR/Cas9是一種新型基因編輯系統(tǒng)，但其作用與基因定點(diǎn)修飾的機(jī)制與RNA干擾（RNAi）過(guò)程相似，利用小CRISPR RNA（crRNA）分子與目標(biāo)基因的特定DNA區(qū)段發(fā)生結(jié)合，再由相關(guān)內(nèi)切酶Cas蛋白進(jìn)行特異性切割，可以引發(fā)基因組的定點(diǎn)突變[30-31]。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)有助于細(xì)菌對(duì)抗病毒、對(duì)付攻擊者，從而保護(hù)自身[32]。研究者發(fā)現(xiàn)，CRISPR/Cas9作為一種萬(wàn)能基因編輯器，可用來(lái)激活、抑制、刪除或者添加異體生物的目標(biāo)基因[33]。早在1987年，日本的研究人員在調(diào)查細(xì)菌的一種編碼堿性磷酸酶的基因序列時(shí)便發(fā)現(xiàn)了1段短重復(fù)的核苷酸序列，位于鄰近DNA片段中間，且兩側(cè)為短特異片段，但是關(guān)于這些重復(fù)序列的生物學(xué)意義并不清楚[34]。2000年，短重復(fù)的核苷酸序列被命名為短間隔重復(fù)序列[35];2002年SRSR被重命名為CRISPR[36]。2013年2月，《Science》雜志上發(fā)表的2篇文章表明，CRISPR/Cas9系統(tǒng)能有效地靶向酶切293T、K562等多種細(xì)胞，且非同源末端連接同源重組效率為3%～25%，可用于動(dòng)植物及人等基因組的編輯，從而開(kāi)啟了植物新型基因編輯的新紀(jì)元[37-38]。目前，在植物中，CRISPR/Cas9已對(duì)超過(guò)30種植物物種和數(shù)百個(gè)基因?qū)崿F(xiàn)成功編輯，并且在農(nóng)作物抗逆性及抗病蟲害研究中的應(yīng)用廣泛[39-40]，在主要糧食作物中，改變并創(chuàng)造出了眾多有益性狀，可見(jiàn)CRISPR/Cas9技術(shù)作為一種可以在植物上廣泛使用的生物技術(shù)而被迅速推廣[41]。

2 CRISPR/Cas技術(shù)的優(yōu)越性

根據(jù)基因編輯現(xiàn)有研究結(jié)果[7，26，42]，分別對(duì)ZFNs、TALENs和CRISPR/Cas技術(shù)在靶點(diǎn)結(jié)合域、載體設(shè)計(jì)及構(gòu)建難易程度、靶位點(diǎn)要求、細(xì)胞毒性、脫靶率、載體構(gòu)建所需要時(shí)間和成本進(jìn)行對(duì)比，詳見(jiàn)表1。

通過(guò)對(duì)4種基因定點(diǎn)修飾技術(shù)的理解以及3種基因編輯的綜合分析發(fā)現(xiàn)，DNA同源重組技術(shù)存在特異性低、修飾效率低、不可穩(wěn)定遺傳等較為突出的技術(shù)弊端。相比之下，ZFNs技術(shù)、TALENs技術(shù)以及CRISPR/Cas技術(shù)的發(fā)展前景則更為樂(lè)觀[43]。但在基因組定點(diǎn)修飾方面，TALENs和ZFNs技術(shù)在實(shí)際操作過(guò)程中的技術(shù)難度較大、構(gòu)建載體時(shí)間較長(zhǎng)，不能在常規(guī)實(shí)驗(yàn)室得到高效利用，而CRISPR/Cas技術(shù)相對(duì)操作簡(jiǎn)單，制作成本低，可以在普通的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行廣泛應(yīng)用[44]。CRISPR/Cas技術(shù)能同時(shí)作用于多個(gè)靶位點(diǎn)[6]，并能精準(zhǔn)完成對(duì)緊隨其后的NGG （PAM序列） 20 bp序列的編輯[45]。此外，載體構(gòu)建方面，ZFNs和TALENs技術(shù)對(duì)各基因位點(diǎn)進(jìn)行編輯時(shí)都須設(shè)計(jì)和組裝2個(gè)核酸酶，操作復(fù)雜且成功率低，而CRISPR/Cas系統(tǒng)中由于Cas9基因相同，只需對(duì)特定基因位點(diǎn)設(shè)計(jì)sRNA即可。因此可見(jiàn)，CRISPR/Cas系統(tǒng)更容易得到推廣和應(yīng)用[43]。

3 CRISPR/Cas技術(shù)在草地植物領(lǐng)域中的應(yīng)用

CRISPR/Cas基因組編輯系統(tǒng)由Cas核酸酶蛋白和向?qū)NA 2個(gè)部分組成，其中向?qū)NA能夠與基因組目標(biāo)位點(diǎn)DNA序列互補(bǔ)配對(duì)，并引導(dǎo)Cas核酸酶蛋白對(duì)該互補(bǔ)序列進(jìn)行定向剪切。作為一種簡(jiǎn)單有效的基因組編輯工具，CRISPR已在多種重要作物中實(shí)現(xiàn)了基因定點(diǎn)敲除、等位基因單堿基替換和外源DNA片段定點(diǎn)整合。目前該技術(shù)已被成功應(yīng)用到擬南芥[46]、水稻[47]、小麥[48]、煙草[49]、番茄[50]、大豆[51]、地錢[52]、甜橙[53]、苜蓿[54]等基因組中單個(gè)位點(diǎn)及少數(shù)多個(gè)位點(diǎn)的修飾中。說(shuō)明CRISPR/Cas9 基因組編輯技術(shù)能擺脫無(wú)干細(xì)胞系的限制，可在任何植物中實(shí)現(xiàn)定向、精準(zhǔn)的基因修飾。

由于CRISPR/Cas9、CRISPR/Cpf1（Cas12a）等核酸酶可以針對(duì)特定基因組DNA序列實(shí)現(xiàn)可編程定向剪切[55]，并能以前所未有的精準(zhǔn)度和便捷度進(jìn)行基因組編輯，因此被廣泛應(yīng)用于動(dòng)、植物及微生物的基因功能解析、新種質(zhì)創(chuàng)制、基因治療等基礎(chǔ)研究及應(yīng)用實(shí)踐工作中，被認(rèn)為是21世紀(jì)生物技術(shù)領(lǐng)域的重大突破[56]。CRISPR/Cas系統(tǒng)作為一種全新的基因編輯技術(shù)，除了在動(dòng)物育種和疾病治療中發(fā)揮了優(yōu)勢(shì)外，在植物基因功能的研究中也體現(xiàn)出其簡(jiǎn)便、高效的特點(diǎn)。CRISPR/Cas系統(tǒng)被發(fā)現(xiàn)以后，很快就被應(yīng)用到了高等植物基因功能的研究中。此外，該技術(shù)還被成功用于對(duì)多種植物內(nèi)源基因的編輯[57]，CRISPR/Cas9技術(shù)迅速成為植物研究的一種熱門手段。

3.1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)在木本植物功能基因組中的應(yīng)用

目前，CRISPR/Cas9系統(tǒng)在木本植物中實(shí)現(xiàn)了基因組的編輯和靶位點(diǎn)的突變。佛羅里達(dá)大學(xué)柑橘研究團(tuán)隊(duì)首次采用CRISPR/LbCas12a（LbCpf1）對(duì)柑橘屬中的西柚基因組進(jìn)行了編輯，獲得了可以定向修飾目的基因的轉(zhuǎn)基因西柚，在有效緩解病原菌感染的同時(shí)，沒(méi)有觀察到潛在的脫靶效應(yīng)[58]。此外，研究者在合成sgRNA靶向基因后，通過(guò)農(nóng)桿菌的介導(dǎo)，向甜橙中導(dǎo)入Cas9及該靶向基因，最終獲得目標(biāo)位點(diǎn)靶向基因的突變。此外，有效利用RNA/sgRNA系統(tǒng)及啟動(dòng)子系統(tǒng)等已經(jīng)在木本植物中實(shí)現(xiàn)了基因組序列的精準(zhǔn)編輯和突變體基因的有效敲除。Liu等通過(guò)將CRISPR/cas9和農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化技術(shù)相結(jié)合，設(shè)計(jì)引導(dǎo)RNA靶定基因的不同基因組位點(diǎn)，建立了高效的楊樹多基因靶向誘變技術(shù)，最終在轉(zhuǎn)基因楊樹中獲得了明顯的白化突變表型[59]。

3.2 CRISPR/Cas系統(tǒng)在作物遺傳改良中的應(yīng)用

作物改良對(duì)于產(chǎn)量、品質(zhì)和抗性的提高至關(guān)重要，而遺傳多樣性是其改良的關(guān)鍵。CRISPR/Cas作為快速高效的遺傳操作工具，在作物遺傳改良方面亦表現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力。近年來(lái)，基因編輯在棉花上的應(yīng)用也成為了研究的熱點(diǎn)，其中華中農(nóng)業(yè)大學(xué)金雙俠教授團(tuán)隊(duì)2019年在《Plant Biotechnology Journal》上發(fā)表的2篇棉花基因編輯的文章就是其中的典型代表，該研究利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建了適用于棉花遺傳轉(zhuǎn)化的堿基編輯系統(tǒng)，在全基因組水平預(yù)測(cè)了1 500個(gè)潛在脫靶位點(diǎn)后未發(fā)現(xiàn)脫靶效應(yīng)，進(jìn)一步證實(shí)單堿基編輯系統(tǒng)對(duì)棉花基因組編輯具有較強(qiáng)的特異性[60]。金雙俠教授團(tuán)隊(duì)的另一研究以棉花內(nèi)源葉綠體形成相關(guān)基因（GhCLA）為靶標(biāo)，通過(guò)tRNA-sgRNA轉(zhuǎn)錄單元構(gòu)建了基因編輯載體，對(duì)轉(zhuǎn)化獲得的目標(biāo)位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其突變率達(dá)到87%;進(jìn)一步對(duì)最具潛力的6個(gè)脫靶位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)后，并未發(fā)現(xiàn)脫靶效應(yīng)，這為四倍體棉花建立高效的CRISPR/Cpf1基因編輯系統(tǒng)提供了良好的選擇[61]。韓國(guó)的一個(gè)研究課題組利用雙生病毒多復(fù)制子的特點(diǎn)優(yōu)化了Cpf1介導(dǎo)的CRISPR系統(tǒng)，創(chuàng)建了依賴于CRISPR/Cpf1系統(tǒng)的同源重組插入外源DNA片段的載體表達(dá)系統(tǒng)，通過(guò)同源重組策略高效地在番茄中實(shí)現(xiàn)了基因編輯過(guò)程，為作物改良提供了更好的研究手段[62]。

福建農(nóng)林大學(xué)關(guān)躍峰團(tuán)隊(duì)在前期高通量創(chuàng)制大豆多基因突變技術(shù)體系的基礎(chǔ)上[63]，利用CRISPR/Cas技術(shù)成功地篩選出脂氧合酶 （LOX）失活株系，從根源上解決了大豆的豆腥味問(wèn)題，該技術(shù)的應(yīng)用可快速在主推大豆品種中疊加無(wú)豆腥性狀，提升加工和營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)，在一定程度上避免了基因聚合及親本對(duì)品種選育時(shí)間的限制[51]，因此不影響其他主要農(nóng)藝性狀。在農(nóng)藝性狀改良過(guò)程中，一種不需要轉(zhuǎn)基因的基因組編輯技術(shù)目前也得到了成功應(yīng)用，該研究以小麥愈傷組織細(xì)胞為研究對(duì)象，瞬時(shí)表達(dá)CRISPR/Cas9的DNA或RNA，可獲得純合的小麥突變體再生植株，并且無(wú)任何轉(zhuǎn)基因成分[64]，該技術(shù)的應(yīng)用大大推進(jìn)了小麥品質(zhì)改良或者其他轉(zhuǎn)化困難植物的研究進(jìn)程。

3.3 CRISPR/Cas9技術(shù)在草地植物抗病毒中的研究應(yīng)用

近年來(lái)，以CRISPR/Cas9系統(tǒng)為首的基因組編輯技術(shù)在植物與病毒互作的基因組研究中也得到了進(jìn)一步的開(kāi)發(fā)與完善。現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，CRISPR/Cas9系統(tǒng)能夠抑制植物DNA病毒的擴(kuò)展和蔓延[65]。Liu等通過(guò)在花椰菜中表達(dá)Cas9/sgRNA，發(fā)現(xiàn)Cas9能夠刪減或者突變花椰菜花葉病毒（CaMV） 基因關(guān)鍵功能區(qū)的核苷酸序列，進(jìn)而抑制CaMV感染[66];而小干擾RNA（siRNAs）抑制CaMV感染的原因并未得到證實(shí)，說(shuō)明CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì) CaMV具有強(qiáng)大的抗病毒特性。另一項(xiàng)研究表明，CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)菜豆黃矮病毒（單鏈DNA病毒）的抑制作用同樣有效[67]，進(jìn)一步證實(shí)CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)植物DNA病毒的抑制作用具有普遍適用性。

3.4 CRISPR/Cas技術(shù)在草類植物中的研究應(yīng)用

CRISPR/Cas9技術(shù)在草類植物功能基因組學(xué)中的研究與柑橘、甜橙等經(jīng)濟(jì)林木和水稻、小麥等主要糧食作物相比嚴(yán)重滯后且處于起步階段，而高通量測(cè)序技術(shù)的飛速發(fā)展大大推動(dòng)了牧草植物基因組學(xué)研究。二穗短柄草（Brachypodium distachyon）是草類禾本科植物功能基因組學(xué)研究的模式植物，CRISPR/Cas9技術(shù)在其基因編輯方面已經(jīng)獲得成功應(yīng)用。例如，李奇等通過(guò)對(duì)Bd ID1 （B. distachyon ID轉(zhuǎn)錄因子）基因不同外顯子分別設(shè)計(jì)敲除位點(diǎn)，運(yùn)用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除目的基因Bd ID1，對(duì)獲得的轉(zhuǎn)基因后代進(jìn)行基因型鑒定，獲得導(dǎo)致Bd ID1功能完全缺失的株系，進(jìn)一步驗(yàn)證ID1是禾本科特有的基因，與調(diào)控開(kāi)花時(shí)間通路相關(guān)[68-69]。此外，劉瑤瑤利用CRISPR/Cas9技術(shù)分別敲除了二穗短柄草的BdVRN1和BdFUL2基因，完成了2個(gè)轉(zhuǎn)錄因子亞家族基因的編輯，并成功獲得單堿基插入/缺失的突變體植株，為基因功能的進(jìn)一步研究提供了基礎(chǔ)材料[70]。CRISPR/Cas9技術(shù)在二穗短柄草基因功能研究中的應(yīng)用，將為其他禾本科植物的遺傳改良和育種提供參考和理論基礎(chǔ)[71]。

目前，CRISPR/Cas9技術(shù)在草類植物中的研究逐步展開(kāi)，其中包括1種重要的牧草資源——蒙古冰草，它不僅是一種重要的資源植物，還具有極高的飼用價(jià)值、遺傳價(jià)值和生態(tài)價(jià)值[72]。此外，蒙古冰草蘊(yùn)含大量抗性基因，對(duì)禾本科牧草或作物的抗逆性研究有重大潛力[73]。但是，相對(duì)于經(jīng)濟(jì)林木和作物研究，蒙古冰草功能基因的挖掘工作開(kāi)展得較晚，尤其是基因編輯及CRISPR/Cas9技術(shù)在牧草方面的應(yīng)用發(fā)展得較為緩慢。關(guān)于此方面的研究，目前僅有張文靜等利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)蒙古冰草原生質(zhì)體基因組進(jìn)行編輯，建立了高效的蒙古冰草CRISPR/Cas9靶位點(diǎn)篩選系統(tǒng)，從而最終在原生質(zhì)體基礎(chǔ)上首次建立了高效蒙古冰草瞬時(shí)轉(zhuǎn)化體系的報(bào)導(dǎo)[74]。對(duì)蒙古冰草功能基因的挖掘及分子育種帶來(lái)革命性的影響，為后續(xù)快速構(gòu)建蒙古冰草穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化植株奠定了基礎(chǔ)。

燕麥作為生長(zhǎng)在溫帶冷涼地區(qū)主要的糧飼兼用作物，不但莖葉多汁、適口性好[75]，而且蛋白質(zhì)、脂肪、可消化纖維的含量都比較高，是理想的糧食和飼料作物[76]。但是燕麥育種發(fā)展緩慢，尤其以基因編輯為主要手段的分子育種較少，與其他作物相比明顯滯后。武志娟首次在燕麥育種中利用 CRISPR/Cas9技術(shù)進(jìn)行基因編輯，構(gòu)建抗拿捕凈除草劑表達(dá)載體后，利用基因槍法建立了高效的燕麥 CRISPR/Cas9基因編輯的最佳靶標(biāo)位點(diǎn)篩選體系，最終獲得2株Cas9編輯所產(chǎn)生的突變植株[77]，從而為基因編輯技術(shù)在草類植物分子育種中的應(yīng)用提供了試驗(yàn)依據(jù)。

此外，紫花苜蓿作為世界上最重要的草地作物，被稱為“牧草之王”。近年來(lái)，激增的家畜養(yǎng)殖對(duì)優(yōu)質(zhì)牧草，特別是紫花苜蓿的需求量極大增加，而國(guó)內(nèi)尚缺乏自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的優(yōu)質(zhì)紫花苜蓿品種資源，優(yōu)質(zhì)苜蓿種子大量依靠進(jìn)口。而且，由于紫花苜蓿具有同源四倍體和異花授粉特性，一直以來(lái)極大阻礙了其基因密碼的破譯和新品種培育。CRISPR/Cas9系統(tǒng)在紫花苜蓿中亦得到了有效應(yīng)用。例如，Gao等應(yīng)用Ⅱ型CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)紫花苜蓿SPL9基因進(jìn)行編輯，并采用微滴式數(shù)字PCR（ddPCR）進(jìn)行亞克隆和測(cè)序，最終成功應(yīng)用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)紫花苜蓿的四倍體基因組進(jìn)行編輯，為紫花苜蓿育種提供了技術(shù)支持[78]，但在如何提高基因編輯效率方面還需要進(jìn)一步探索。近日，研究者首次完成了同源四倍體紫花苜蓿基因組的破譯并建立了基于CRISPR/Cas9技術(shù)的高效基因編輯育種體系，成功獲得一批多葉性狀穩(wěn)定且不含轉(zhuǎn)基因標(biāo)記的紫花苜蓿新材料[79]。此外，研究者利用CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)對(duì)控制花期調(diào)控基因進(jìn)行定點(diǎn)敲除并結(jié)合雜交手段，成功創(chuàng)制出適宜低緯度地區(qū)種植的大豆材料，為豆科植物品種改良提供了新的基礎(chǔ)材料[80]。

通過(guò)分析草地植物的研究現(xiàn)狀，發(fā)現(xiàn)CRISPR/Cas9系統(tǒng)作為新型的植物基因編輯技術(shù)，關(guān)于其功能基因組的研究仍存在很大的研究空間及研究?jī)r(jià)值，尤其是近年來(lái)CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)牧草品種的改良具有巨大潛力和廣泛的應(yīng)用前景。

4 CRISPR/Cas技術(shù)在牧草植物中的應(yīng)用前景及展望

牧草植物作為生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，由于人類長(zhǎng)期過(guò)度放牧和開(kāi)墾等不合理利用造成草地退化、植被密度減小、蓋度下降等，致使草地生態(tài)系統(tǒng)服務(wù)功能減弱、功能價(jià)值減少。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的迅速發(fā)展，越來(lái)越多植物的全基因組序列被公布出來(lái)，但是針對(duì)牧草植物的測(cè)序工作少之又少，并且關(guān)于基因功能研究、遺傳改良、分子育種等研究的技術(shù)手段有限，種種因素都極大地限制了牧草植物分子育種的發(fā)展及功能基因組學(xué)的研究。然而，近年來(lái)已有大量研究者提出了各種有效的草地生態(tài)恢復(fù)手段，其中以CRISPR/Cas9技術(shù)為首的基因編輯技術(shù)在草地植被恢復(fù)過(guò)程中的應(yīng)用是一個(gè)不容小覷的因素，該技術(shù)的應(yīng)用能夠因地制宜地挖掘鄉(xiāng)土品種與抗逆性、高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)等相關(guān)的基因，并能在極大縮短育種年限的情況下，實(shí)現(xiàn)對(duì)優(yōu)良草地植物的收集、開(kāi)發(fā)、利用及草地生態(tài)功能的修復(fù)。

4.1 縮短牧草育種年限、精準(zhǔn)育種，提高牧草產(chǎn)量

基因組編輯技術(shù)可以通過(guò)定向修飾植物基因組，進(jìn)而推動(dòng)植物育種進(jìn)程，在實(shí)現(xiàn)牧草植物精準(zhǔn)育種方面具有極大的開(kāi)發(fā)潛力。然而，牧草許多重要農(nóng)藝性狀是由單個(gè)或少數(shù)核苷酸的改變或突變引起的，具有很多不確定性。牧草植物基因編輯困難重重，主要表現(xiàn)在同源重組在牧草植物中的效率極低，通過(guò)基因編輯的方式獲得高效、穩(wěn)定的基因組的精準(zhǔn)性較差;獲得理想的轉(zhuǎn)基因植株費(fèi)時(shí)且費(fèi)力，傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)只能將外源基因隨機(jī)整合到植物基因組中，插入位點(diǎn)的隨機(jī)可導(dǎo)致內(nèi)源基因破壞和外源基因沉默等不利結(jié)果。與自然進(jìn)化和傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因手段相比，基于CRISPR/Cas系統(tǒng)的基因組編輯可利用外源修復(fù)模板通過(guò)同源重組介導(dǎo)的修復(fù)方式實(shí)現(xiàn)目標(biāo)基因核苷酸的改變，因此，通過(guò)對(duì)控制牧草關(guān)鍵性狀基因的編輯，可加快良種選育的進(jìn)度。此外，在牧草功能基因研究領(lǐng)域，CRISPR/Cas技術(shù)的應(yīng)用對(duì)實(shí)現(xiàn)定向育種，培育高產(chǎn)、抗逆等適應(yīng)性強(qiáng)、生態(tài)價(jià)值高價(jià)的牧草植物具有重大潛力。例如，Chen等開(kāi)發(fā)的基于CRISPR/Cas9的高效基因編輯技術(shù)體系，不僅成功培育了一批多葉型紫花苜蓿新材料，而且重要的是該編輯技術(shù)的應(yīng)用無(wú)需導(dǎo)入外源基因和轉(zhuǎn)基因過(guò)程，僅需獲得自身的突變體即可，該技術(shù)的應(yīng)用將大大加快傳統(tǒng)育種的速度[79]。

4.2 挖掘牧草營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的代謝通路，改良牧草品質(zhì)

目前，對(duì)牧草研究關(guān)注的重點(diǎn)大多是種植管理、適口性及營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)分析等方面，對(duì)相關(guān)基因的研究，尤其是一些營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)代謝通路上基因細(xì)節(jié)方面，如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、抑制子的研究并不深入;此外，絕大多數(shù)牧草的遺傳轉(zhuǎn)化體系還不完善，由于難以建立起有效的遺傳轉(zhuǎn)化體系而無(wú)法開(kāi)展轉(zhuǎn)基因研究。一系列生物技術(shù)應(yīng)用的局限性限制了CRISPR/Cas系統(tǒng)在牧草植物功能基因研究中的應(yīng)用。

吳香瑩等研究了CRISPR/dCas9 系統(tǒng)對(duì)苜蓿中華根瘤菌（Sinorhizobium meliloti）320內(nèi)源hemE基因的作用，可有效促進(jìn)代謝流向維生素B12合成方向轉(zhuǎn)移，不但豐富了可用于分析苜蓿中華根瘤菌的工具庫(kù)，也為苜蓿遺傳和營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)代謝研究提供了新思路[81]。此外，苜蓿中木質(zhì)素含量高是飼料消化率低的限制因素之一。傳統(tǒng)方法可通過(guò)嘗試減少木質(zhì)素的含量來(lái)提高苜蓿飼料的消化率，但效果均不顯著。而CRISPR/Cas9技術(shù)則可以在短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)。Meng等優(yōu)化并開(kāi)發(fā)一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的CRISPR/Cas9系統(tǒng)，成功誘導(dǎo)紫花苜蓿靶向基因組的修飾，并利用該系統(tǒng)，獲得了T0代內(nèi)源基因MtPDS的單等位基因和雙等位基因純合子突變體，進(jìn)一步證明CRISPR/Cas9系統(tǒng)可以作為研究基因功能的有效工具[54]，為CRISPR/Cas9技術(shù)在減少木質(zhì)素的含量、提高苜蓿飼料的消化率方向的應(yīng)用提供了參考價(jià)值。此外，Cai等利用改造后的CRISPR基因組編輯系統(tǒng)，率先實(shí)現(xiàn)了豆科植物基因的單堿基替換，并獲得了表型穩(wěn)定的純合突變系[82]，為豆科植物重要農(nóng)藝性狀的定向改良提供了新技術(shù)、新路徑。

4.3 提高牧草植物對(duì)除草劑的抗性

牧草植物在大面積推廣種植過(guò)程中雜草危害嚴(yán)重，而人工除草成本很高，利用除草劑對(duì)不同植物類型進(jìn)行選擇性防除，并開(kāi)發(fā)出專用型除草劑在很多大田作物上得到了實(shí)現(xiàn)。研究發(fā)現(xiàn)，乙酰輔酶A羧化酶（ACCase）基因是禾本科植物抗拿捕凈除草劑的關(guān)鍵基因，除草劑的抗性變化與異亮氨酸能否突變?yōu)榱涟彼嵯嚓P(guān)。因此，研究者可以通過(guò)構(gòu)建乙酰輔酶A羧化酶基因的CRISPR/Cas9表達(dá)載體，通過(guò)編輯禾本科牧草的ACCase基因，找到氨基酸突變關(guān)鍵位點(diǎn)序列，進(jìn)而促使禾本科牧草對(duì)除草劑產(chǎn)生抗性。該方法已經(jīng)在燕麥上得到了實(shí)現(xiàn)，研究者通過(guò)CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)完成了對(duì)燕麥轉(zhuǎn)基因植株中ACCase基因的成功敲除，盡管沒(méi)有完成靶向敲除，但也為后續(xù)通過(guò)禾本科牧草基因組編輯產(chǎn)生抗除草劑特性試驗(yàn)提供理論依據(jù)[83]。

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