玉米大斑病抗病QTL的鑒定與效應(yīng)分析

田志強(qiáng) 李志敏 賈琳 李雪迎 趙蕭笛 杜文杰 李政 白磊

摘要：玉米大斑病是一種重要的真菌性病害，開展玉米大斑病的抗性遺傳研究，對(duì)玉米抗病育種有重要的意義。以熱帶種質(zhì)的抗病自交系CIMBL29為供體親本，感病自交系GEMS41為輪回親本，構(gòu)建了含有179個(gè)家系的BC2F4群體。對(duì)該群體和親本進(jìn)行了2個(gè)環(huán)境的抗性表型鑒定，并結(jié)合高密度的分子標(biāo)記遺傳連鎖圖譜，對(duì)玉米大斑病抗性進(jìn)行了QTL分析。結(jié)果表明，玉米大斑病抗性在群體家系間表現(xiàn)出廣泛的變異;在2個(gè)環(huán)境條件下共鑒定了9個(gè)大斑病抗病QTL，分別位于第1、第2、第4、第5、第7、第9染色體上，可以解釋5.2%～16.2%的抗性遺傳變異。其中位于第1和第5染色體上的位點(diǎn)（qNLB1-1和qNLB5）在2個(gè)環(huán)境條件下均可以被檢測(cè)到，可以認(rèn)為是穩(wěn)定的抗病位點(diǎn)。

關(guān)鍵詞：玉米;大斑病;QTL;SNP

中圖分類號(hào)：S435.13?? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2021）20-0070-04

收稿日期：2021-07-22

基金項(xiàng)目：河南省教育廳高等學(xué)校重點(diǎn)項(xiàng)目（編號(hào)：20A210005、20A210019）。

作者簡(jiǎn)介：田志強(qiáng)（1976—），男，河南安陽(yáng)人，博士，助理研究員，主要從事玉米抗病機(jī)制研究。E-mail：tt973@126.com。

通信作者：李志敏，博士，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，主要從事玉米抗病育種研究。E-mail：lzmzdb@126.com。

玉米大斑病是由大斑剛毛球腔菌Setosphaeria turcica引起的一種葉部病害。在自然條件下苗期很少發(fā)病，玉米抽雄后發(fā)病逐漸加重，嚴(yán)重時(shí)不僅可以侵染玉米的葉片，還可以危害玉米的苞葉和葉鞘，影響玉米的產(chǎn)量和品質(zhì)[1]。在玉米生產(chǎn)上，抗病品種的推廣和使用是有效控制玉米大斑病最經(jīng)濟(jì)有效的途徑[2]。然而，近年來，隨著耕作制度改變和病原菌小種變異等因素的影響，玉米大斑病的發(fā)生在我國(guó)又有回升之勢(shì)，尤其在東北、華北北部等我國(guó)玉米主產(chǎn)區(qū)和西南高海拔地區(qū)冷涼山區(qū)較為嚴(yán)重，感病品種一般減產(chǎn)20%左右，嚴(yán)重時(shí)可減產(chǎn)50%以上[3]。

解析抗病遺傳規(guī)律是進(jìn)行抗病育種的基礎(chǔ)。自20世紀(jì)60年代以來，國(guó)內(nèi)外多個(gè)課題組開展了玉米大斑病抗病遺傳基礎(chǔ)研究，并鑒定出多個(gè)抗病基因位點(diǎn)。其中，已經(jīng)報(bào)道的質(zhì)量抗性基因包括Ht1、Ht2、Ht3、Htn1、Htm1、HtP、NNc和St等，這些抗病基因以顯性單基因的方式，對(duì)特定病原菌小種產(chǎn)生專化抗性[4-5]。對(duì)這些抗病基因的進(jìn)一步研究表明，Ht2、Ht3、Htn1均位于第8染色體上，3個(gè)抗病基因緊密連鎖或?qū)儆谕豢共∥稽c(diǎn)的不同抗病單倍型[6-7]。此外，還鑒定出質(zhì)量性狀抗病基因ht4和rt等，這些抗病基因以隱性抗病的遺傳方式控制玉米大斑病的抗病性[8-9]。

與質(zhì)量性狀相比較，數(shù)量性狀抗病性屬水平抗性，可能對(duì)多個(gè)生理小種均有抗性。隨著大斑病的病原菌生理小種分化變異[10-12]，近年來，越來越多的數(shù)量性狀抗性位點(diǎn)被鑒定出來[13]。采用連鎖分析的方法，Nelson課題組在玉米第1染色體上鑒定到2個(gè)主效抗病位點(diǎn)（qNLB1.02和qNLB1.06）[14]，以及玉米第8染色體的主效QTL（qNLB8.06）[15]。國(guó)內(nèi)也有課題組鑒定出主效抗病位點(diǎn)的報(bào)道。這些抗病位點(diǎn)包括從抗病自交系Qi319中鑒定到的qNCLB7.02[16]，以及從K22中鑒定到的qNCLB5.04等[17]。此外，利用巢式關(guān)聯(lián)作圖群體，Poland等共鑒定出29個(gè)QTL[18]。

近年來，含有熱帶亞熱帶血緣的材料在玉米抗病性的改良上日益受到抗病育種工作者的重視。本研究選用1份來自國(guó)際小麥玉米改良中心（CIMMYT）的熱帶玉米自交系CIMBL29為基礎(chǔ)，解析其抗玉米大斑病的遺傳機(jī)理，鑒定玉米大斑病的抗病位點(diǎn)，以期為抗病分子育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本試驗(yàn)供試材料包括來自CIMMYT的熱帶抗病自交系CIMBL29和感病自交系GEMS41，以及以CIMBL29為供體親本，GEMS41為輪回親本，經(jīng)過2次回交3次自交發(fā)展的包含179個(gè)家系的BC2F4群體。

1.2 田間試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2017年在大斑病發(fā)病嚴(yán)重的吉林省榆樹市（126.55°E、44.83°N），以及2018年在梨樹縣（12433°E、43.32°N）分別種植179個(gè)BC2F4群體家系和親本。大田試驗(yàn)采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，2次重復(fù)。田間種植采用起壟單粒穴播方法，行長(zhǎng)3 m，株距20 cm，行距為80 cm，每行種植14株，田間管理按照常規(guī)的生產(chǎn)管理方法進(jìn)行。

1.3 抗病性鑒定

大田自然發(fā)病條件下，在玉米乳熟期后期調(diào)查葉片的發(fā)病程度。按照1～9級(jí)的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)群體家系和親本的大斑病抗性進(jìn)行鑒定。其中，1級(jí)：高抗，幾乎無病斑，僅有零星病斑，占葉面積小于 5%;3級(jí)：抗病，有少量病斑，面積小于10%;5級(jí)：中抗，葉片上病斑較多，相接連，占整株葉面積 11%～30%;7級(jí)：感病，葉片有大量病斑，占葉面積比在 31%～70%;9級(jí)：高感，整個(gè)植株葉片大于70%有病斑，枯死或整株枯死。

1.4 分子標(biāo)記連鎖圖譜的構(gòu)建和QTL作圖

在玉米幼苗期，用CTAB法[19]提取179個(gè)群體家系和親本的新鮮葉片總DNA。采用中玉金標(biāo)記（北京）生物技術(shù)股份有限公司開發(fā)的9.4 k SNP芯片對(duì)群體家系和親本基因型進(jìn)行檢測(cè)，篩選出在親本和群體家系間表現(xiàn)出多態(tài)性的SNP標(biāo)記;刪除雜合度高（>10%）、缺失率高（>10%）的標(biāo)記。然后利用完備區(qū)間作圖IciMapping軟件[20]進(jìn)行遺傳連鎖圖譜構(gòu)建。操作步驟如下：用基因型“0”表示親本CIMBL29的純合帶型;基因型“1”表示雜合帶型;基因型“2”表示親本GEMS41的純合帶型。采用IciMapping軟件的“group”命令對(duì)標(biāo)記進(jìn)行分組，然后用“order”命令對(duì)每組標(biāo)記進(jìn)行排序，用“ripple”命令確定標(biāo)記在染色體上的最優(yōu)排列順序。最后用IciMapping軟件中的加性效應(yīng)模型（ICIM-ADD）對(duì)群體效應(yīng)進(jìn)行評(píng)估并判定其顯著性。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

對(duì)親本和群體家系表型數(shù)據(jù)，采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算親本和群體家系的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差;大斑病抗性在所有環(huán)境下總變異按變異來源可分為環(huán)境變異和基因型變異。廣義遺傳力計(jì)算公式：H2=σ2g/（σ2g+σ2ge/n+σ2e/nr），式中：σ2g為基因型方差;σ2ge為基因型與環(huán)境互作的方差;σ2e為誤差項(xiàng)方差;r為重復(fù)數(shù);n為環(huán)境個(gè)數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建

利用中玉金標(biāo)記（北京）生物技術(shù)股份有限公司開發(fā)的9.4 k SNP芯片對(duì)作圖群體179個(gè)家系和親本基因型進(jìn)行基因型檢測(cè)，共篩選1 044個(gè)在親本和群體家系間均表現(xiàn)出多態(tài)性的SNP標(biāo)記。利用IciMapping作圖軟件進(jìn)行了分子標(biāo)記遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建。由表1可見，1 044個(gè)標(biāo)記分成10個(gè)連鎖群，覆蓋玉米10條染色體;遺傳連鎖圖譜總的長(zhǎng)度為2 235.55 cM，SNP標(biāo)記間的平均間距為 2.14 cM。其中，第4染色體的SNP標(biāo)記間的平均遺傳距離最大，為2.49 cM;第5染色體的分子標(biāo)記間平均遺傳距離最小，為1.68 cM。從10條染色體上的標(biāo)記數(shù)量來看，第1染色體上包含有最多的分子標(biāo)記（168個(gè)）;第10染色體上包含的分子標(biāo)記最少（61個(gè)）。高密度遺傳圖譜的構(gòu)建，為進(jìn)一步開展抗病基因定位奠定了基礎(chǔ)。

2.2 親本和作圖群體家系的大斑病抗性表型分析

由表2可知，親本GEMS41和CIMBL29在玉米大斑病抗性上呈現(xiàn)廣泛變異。親本CIMBL29 表現(xiàn)為高抗大斑病，在2017年和2018年的抗性級(jí)別分別為2.35級(jí)和2.74級(jí)，2年環(huán)境下的平均抗性級(jí)別為2.64級(jí);而親本GEMS41則表現(xiàn)為高感玉米大斑病，在2017年和2018年的抗性級(jí)別分別為7.24級(jí)和753級(jí)，2年環(huán)境下的平均抗性級(jí)別為7.44級(jí)。作圖群體的179個(gè)BC2F4家系在大斑病抗性上也呈現(xiàn)廣泛的變異，對(duì)2年的抗性表型做方差分析，結(jié)果表明，基因型對(duì)群體大斑病抗性的影響均達(dá)到極顯著水平，基因型×環(huán)境互作對(duì)大斑病抗性的影響沒有達(dá)到顯著水平。2017年和2018年大斑病抗性的遺傳力分別為0.79和0.82，2個(gè)年份的大斑病抗性的遺傳力為0.77。BC2F4群體家系較高的遺傳力，說明大斑病的遺傳變異是由遺傳控制的，為進(jìn)一步開展抗病QTL定位奠定了基礎(chǔ)。

2.3 玉米大斑病抗性QTL定位及基因效應(yīng)分析

由表3可知，在2017年，共檢測(cè)到7個(gè)抗病位點(diǎn)，分別位于玉米第1、第4、第5、第7和第9染色體上。其中第1染色體bin1.01-1.02區(qū)間檢測(cè)到的抗性QTL（qNLB1-1）貢獻(xiàn)率最大，可以解釋14.3%的表型遺傳變異，抗性效應(yīng)為1.07。除了第9染色體上的qNLB9-2外，抗性位點(diǎn)均來自抗病親本CIMBL29。在2018年，共檢測(cè)到4個(gè)抗病位點(diǎn)，分別位于玉米第1、第2、第5和第7 染色體上。其中第1染色體的抗性QTL（qNLB1-1）有最大表型貢獻(xiàn)率，可以解釋16.2%的表型遺傳變異，抗性效應(yīng)為1.17。在所有檢測(cè)到的QTL中，除了第2染色體上的qNLB2外，抗性位點(diǎn)均來自抗病親本CIMBL29。

對(duì)2個(gè)環(huán)境綜合分析發(fā)現(xiàn)，2個(gè)環(huán)境條件均在第1和第5染色體上檢測(cè)到了抗性QTL（qNLB1-1和qNLB5）（圖1），這2個(gè)QTL可以認(rèn)為是穩(wěn)定的大斑病抗性QTL。

3 討論與結(jié)論

本研究采用BC2F4作圖群體對(duì)玉米大斑病的抗病QTL進(jìn)行了分析。相對(duì)于傳統(tǒng)的重組近交系群體，BC2F4作圖群體的開花期表型變異小，減少了開花期差異對(duì)抗性鑒定的干擾，保證了抗性表型數(shù)據(jù)采集的一致性和可靠性，為抗病QTL的定位奠定了良好的基礎(chǔ)。此外，本研究利用高密度SNP標(biāo)記構(gòu)建的連鎖圖譜對(duì)玉米大斑病抗性進(jìn)行研究，圖譜標(biāo)記密度高，作圖分辨率高，提高了QTL作圖的精度，并為后續(xù)的抗病基因精細(xì)定位奠定了很好的基礎(chǔ)。

本研究在玉米第1、第2、第4、第5、第7、第9 染色體上共檢測(cè)到9個(gè)大斑病抗性QTL，單個(gè)QTL的表型貢獻(xiàn)率為5.2%～16.2%。其中，在第1和第5染色體上檢測(cè)到穩(wěn)定的抗性位點(diǎn)（qNLB1-1和qNLB5）。與前人結(jié)果相比，本研究結(jié)果有很多與其一致的地方， 如在第1染色體檢測(cè)到穩(wěn)定的抗性位點(diǎn)（qNLB1-1），Jamann等在此區(qū)域內(nèi)發(fā)現(xiàn)1個(gè)編碼植物抗病相關(guān)蛋白remorin基因（ZmREM6.3）[21]。本研究在第5染色體鑒定到穩(wěn)定的抗性位點(diǎn)（qNLB5），Chen等在此區(qū)間定位到1個(gè)主效抗病位點(diǎn)[17];本研究在bin7.02及其相鄰bin7.03-7.04區(qū)間檢測(cè)到抗性QTL，Wang等在第7染色體 bin7.02 區(qū)間檢測(cè)到穩(wěn)定的主效QTL并對(duì)其進(jìn)行了驗(yàn)證[16]。這些與前人研究結(jié)果一致的位點(diǎn)，說明了其大斑病抗性的穩(wěn)定性，可以作為下一步精細(xì)定位和分子育種的重要位點(diǎn)。值得注意的是，本研究還在第1染色體bin1.09區(qū)間、第2染色體bin2.03區(qū)間、第4染色體bin4.09區(qū)間和第9染色體的不同區(qū)間分別檢測(cè)到了抗性QTL，這些QTL位置與前人的研究結(jié)果不同，可以認(rèn)為是新的玉米大斑病抗性位點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)：

[1]孫 濱. 玉米大斑病的發(fā)生及其綜合防控[J]. 遼寧農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014（1）：89-90.

[2]楊繼良，王 斌. 玉米大斑病抗性遺傳的研究進(jìn)展[J]. 遺傳，2002，24（4）：501-506.

[3]弓 雪，陳 坤，劉亞利，等，玉米大斑病抗性機(jī)制及抗病育種研究進(jìn)展[J]. 分子植物育種，2020（10）：1-17.

[4]Welz H G，Geiger H H. Genes for resistance to northern corn leaf blight in diverse maize populations[J]. Plant Breeding，2000，119（1）：1-14.

[5]Ogliari J B，Guimares M A，Geraldi I O，et al. New resistance genes in the Zea mays：Exserohilum turcicum pathosystem[J]. Genetics and Molecular Biology，2005，28（3）：435-439.

[6]Yang P，Scheuermann D，Kessel B，et al. Alleles of a wall-associated kinase gene account for three of the major northern corn leaf blight resistance loci in maize[J]. The Plant Journal，2021，106（2）：526-535.

[7]Hurni S，Scheuermann D，Krattinger S G，et al. The maize disease resistance gene Htn1 against northern corn leaf blight encodes a wall-associated receptor-like kinase[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2015，112（28）：8780-8785.

[8]Ogliari J B，Guimares M A，Camargo L E A.Chromosomal locations of the maize （Zea mays L.） HtP and rt genes that confer resistance to Exserohilum turcicum[J]. Genetics and Molecular Biology，2007，30（3）：630-634.

[9]Carson M L.A new gene in maize conferring the “chlorotic halo” reaction to infection by Exserohilum turcicum[J]. Plant Disease，1995，79（7）：717.

[10]張秀霞，高增貴，周曉錕，等. 東北地區(qū)玉米大斑病菌生理分化研究[J]. 華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2012，27（3）：227-230.

[11]張明會(huì)，徐秀德，劉可杰，等. 我國(guó)玉米大斑病菌生理分化及小種分布研究[J]. 玉米科學(xué)，2011，19（4）：138-141.

[12]王玉萍，王曉鳴，馬 青. 我國(guó)玉米大斑病菌生理小種組成變異研究[J]. 玉米科學(xué)，2007，15（2）：123-126.

[13]Pratt R C，Gordon S G.Breeding for resistance to maize foliar pathogens[J]. Plant Breeding Reviews，2006，27：119.

[14]Chung C L，Longfellow J M，Walsh E K，et al. Resistance loci affecting distinct stages of fungal pathogenesis：use of introgression lines for QTL mapping and characterization in the maize-Setosphaeria turcica pathosystem[J]. BMC Plant Biology，2010，10：103.

[15]Chung C L，Jamann T，Longfellow J，et al. Characterization and fine-mapping of a resistance locus for northern leaf blight in maize bin 806[J]. Theoretical and Applied Genetics，2010，121（2）：205-227.

[16]Wang J J，Xu Z N，Yang J，et al. qNCLB7.02，a novel QTL for resistance to northern corn leaf blight in maize[J]. Molecular Breeding，2018，38（5）：1-12.

[17]Chen G S，Wang X M，Long S S，et al. Mapping of QTL conferring resistance to northern corn leaf blight using high-density SNPs in maize[J]. Molecular Breeding，2015，36（1）：1-9.

[18]Poland J A，Bradbury P J，Buckler E S，et al. Genome-wide nested association mapping of quantitative resistance to northern leaf blight in maize[J]. PNAS，2011，108（17）：6893-6898.

[19]閆苗苗，魏光成，潘效紅，等. 一種適用于動(dòng)物與植物總DNA提取的方法——改良CTAB法[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36（20）：8488，8558.

[20]Meng L，Li H H，Zhang L Y，et al. QTL IciMapping：Integrated software for genetic linkage map construction and quantitative trait locus mapping in biparental populations[J]. The Crop Journal，2015，3（3）：269-283.

[21]Jamann T M，Luo X Y，Morales L，et al. A remorin gene is implicated in quantitative disease resistance in maize[J]. Theoretical and Applied Genetics，2016，129（3）：591-602.