鐵蛋白-AHLL納米顆粒的穩定性及腸吸收研究

張韻晨 方旭波 李瑩 夏偉榮 柴智 馮進 陳小娥

摘要：使用馬脾鐵蛋白包封降血壓活性肽AHLL，通過紫外、熒光和圓二光譜研究AHLL荷載對HSF結構的影響。在此基礎上，研究鐵蛋白包封對AHLL穩定性以及體外胃腸道消化過程中血管緊張素轉化酶（ACE）抑制活性的影響作用，并開展復合納米顆粒（HSF-AHLL）的細胞轉運試驗。結果表明，AHLL載運顯著降低了HSF的α-螺旋結構和β-轉角結構，而β-折疊結構含量和無規卷曲含量增加，另外，包埋后HSF四重軸通道上的色氨酸微環境被改變。HSF-AHLL的熱穩定性、pH穩定性和紫外穩定性明顯高于游離AHLL。在模擬胃消化過程中，結合態與游離態AHLL的ACE抑制活性在胃液中下降明顯，而在腸液中變化不明顯。HSF-AHLL在Caco-2細胞上的轉運試驗具有一定方向性。吸收（AP→BL）大于外排（BL→AP），HSF-AHLL在Caco-2細胞單層膜上以細胞旁路轉運為主，內吞抑制劑和肽載體抑制劑對HSF-AHLL的轉運沒有明顯影響，而脫氧膽酸鈉能打開細胞間通路促進其轉運;HSF-AHLL的轉運與多藥耐藥蛋白抑制劑形成競爭性抑制，HSF-AHLL的轉運對溫度具有一定的依賴性，屬于能量依賴型轉運。

關鍵詞：馬脾脫鐵鐵蛋白，血管緊張素轉化酶抑制肽;納米粒;Caco-2細胞模型;轉運

中圖分類號：S188?? 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2021）20-0194-07

收稿日期：2020-12-12

基金項目：食品科學與技術國家重點實驗室開放課題（編號：SKLF-KF-201712）。

作者簡介：張韻晨（1996—），女，新疆克拉瑪依人，碩士研究生，研究方向為水產品加工與貯藏。E-mail：rhymezyc@163.com。

通信作者：方旭波，博士，教授，主要從事水產品加工與貯藏研究，E-mail：fxb70@163.com;李 瑩，博士，副研究員，主要從事食品營養與健康研究，E-mail：hijoly@163.com。

本試驗所用的ACE抑制肽AHLL在前期的研究中已證明發現它可以有效抑制ACE活性，在原發性高血壓大鼠上具有一定降血壓效果[1]。但由于AHLL較不穩定，容易被消化道里的胃蛋白酶、胰蛋白酶降解，從而影響ACE的抑制活性[2]，機體對活性肽AHLL的吸收隨之也受到影響。鐵蛋白結構中包含氫鍵、鹽橋和疏水作用力[3]，但是，單獨用作納米載體時易受外界環境、pH值和溫度變化等影響。以往對鐵蛋白的研究中，它作為納米載體對鐵蛋白表面進行修飾，利用其特有的結構廣泛應用在材料學、納米學[4-5]等方面，鐵蛋白經過脫鐵處理后可包裹特定的活性負載物并對活性負載物起到靶向輸送的作用，這一方法已經在生物醫藥領域得到應用[6]。鐵蛋白脫鐵后變化為特殊的空腔結構，小分子物質可以通過自由擴散的形式進入空腔，通過非共價鍵結合的作用力附和在鐵蛋白的空腔里。鐵蛋白包埋技術已經很成熟，但由于對包載物質的分子量有要求，因此包埋率較低。鐵蛋白殼具有高度保守的二級結構和三級結構，80 ℃高溫都不能使之變性的特性，亞基之間的氫鍵和疏水作用力可以維持三、四級結構的穩定，運用可調控手段，使其解散又重組為鐵蛋白分子納米[7]。蛋白載體在胃酸大環境和胃蛋白酶的作用下會被降解[8]，完整的運載體系在小腸吸收完成前就會被破壞，蛋白質載體的穩定性受到多種因素的制約。若運用多肽對蛋白載體進行修飾使其形成較穩定的復合納米體系，能夠穩定蛋白本身在不定pH和溫度范圍內的溶解性，抑制蛋白質出現大量聚集沉淀和失去穩定變性的現象[9]。另外，在胃酸的酸性大環境下，多肽通過包埋和靜電吸引作用包被于鐵蛋白的內部空腔結構中，阻止胃蛋白酶對其降解，進入小腸后，蛋白載體完成有效吸收，因此多肽和蛋白質可形成雙重結構，協同改善運載藥物的穩定性、吸收性和生物活性的長效發揮[10]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

ACE抑制肽AHLL（純度>99%），上海強耀生物科技有限公司;馬脾鐵蛋白，美國Sigma Aldrich公司;MOPS緩沖液，美國Amresco公司;27 mmol/L透析袋（分子量為14 000），美國biosharp公司;乙腈（分析純），江蘇漢邦公司;三氟乙酸，上海源葉生物科技有限公司;Transwel1細胞培養板（聚碳酯膜直徑12 mm，孔徑0.4 μm ）、25 cm2卡氏細胞培養瓶，美國Corning公司;維拉帕米，MK-571，氧化苯胂，脫氧膽酸鈉，美國Sigma公司;DMEM培養基（4.5 g/L D-葡萄糖）、胎牛血清、磷酸鹽緩沖液、Hanks平衡鹽溶液，美國Gibco公司。

1.2 主要儀器與設備

TGL-50WS型大容量高速離心機，鞏義市宏華儀器設備工貿有限公司;FRQ系列小型超聲波清洗機，杭州法蘭特超聲波科技有限公司;1260Infinity高效液相色譜儀，美國Agilent 公司;GI20體外模擬消化系統，澳大利亞Nutriscan公司;JASCO-810 圓二色譜儀，日本JASCO公司;Alpha-1900Plus紫外分光光度計，上海普元儀器有限公司;F-7000熒光分光光度計，日本Hitachi 公司;500型精密電子天平，意大利BEL公司;DK-8D電子恒溫水浴槽，上海精宏實驗設備有限公司;SpectraMax M5/M5e多功能酶標儀，美谷分子儀器（上海）有限公司;PLUS-E2-20TJ 實驗級超純水機，南京易普易達科技發展有限公司;二氧化碳恒溫培養箱，日本SANYO公司;BHC-1300ⅡA/B2型微生物潔凈安全柜，江蘇凈化設備有限公司;Millicell ERS-2電阻儀，美國Millipore公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 根據前期研究得出納米粒的最優制備條件[11] 準確稱取20 mg 的AHLL標品制得濃度為20 mg/mL的AHLL母液，放置于4 ℃保存。取 2 mL 濃度為2 μmol/L的蛋白溶液（5 mmol/L MOPS，pH值為7.0），用1 mol/L HCl調節溶液pH值至2.0，在室溫環境下攪拌20～30 min，使蛋白逐步解離成單個亞基狀態，放置于磁力攪拌器上一邊攪拌一邊緩慢滴加20 μL AHLL母液（20 mg/mL），使其終濃度為200 μg/mL，此時蛋白和AHLL的物質量之比為1 ∶200。在室溫環境下攪拌20～30 min 后，用1 mol/L NaOH將溶液pH值調至7.4后立即放置于4 ℃層析冷柜中攪拌2 h以上。攪拌完成后用孔徑為12 000～14 000 u的透析袋置于pH值為7.4的5 mmol/L MOPS溶液里進行透析處理，以除去游離泥鰍源高活性降壓肽AHLL，透析期間每隔 4 h 換1次透析液，以此制得HSF-AHLL復合納米粒。經檢測空殼的HSF的粒徑為19.62 nm，粒徑分布均勻。載入ACE抑制肽后，HSF-AHLL納米粒粒徑增大至28.19 nm，HSF-AHLL和HSF表面都帶負電荷，HSF的電位為-39.9 mV，HSF-AHLL的電位約-34 mV，載體鐵蛋白濃度在1～2 μmol/L 之間，AHLL的終濃度在100～200 μg/mL范圍內，可制備出包封率20.94%的穩定納米粒體系。

1.3.2 圓二色譜分析 調節樣品蛋白終濃度為1.2 μg/mL，掃描波長范圍為200～280 nm，掃描溫度25 ℃，每點掃描時間2.5 μs，樣品池光程為10 mm，掃描速率是200 nm/min，掃描步長為0.5 nm[12]。平均掃描3次。

1.3.3 熒光光譜分析 調節納米粒載體蛋白的終濃度為1.2 μg/mL。激發波長為280 nm，發射波長為285～500 nm，激發縫1 nm，發射狹縫5 nm[13]。對AHLL、HSF-AHLL進行全波長掃描[14]。

1.3.4 紫外光譜測定 控制納米粒載體的蛋白終濃度為1.2 μg/mL。使用UV-6300紫外可見分光光度計對HSF、HSF-AHLL進行全波長掃描。

1.3.5 復合納米粒溫度穩定性的測定 將制備好的HSF、HSF-AHLL納米粒溶液分別置于不同溫度（60、70、80、90、100 ℃）的水浴鍋中孵育1 h后取樣，對照為游離的AHLL溶液。取樣后用高效液相法測定AHLL的剩余含量。

1.3.6 復合納米粒pH值穩定性的測定 調節HSF、HSF-AHLL納米粒溶液pH值（2.0、4.0、5.0、6.0、7.0、7.4、8.0），磁力攪拌60 min和90 min后，用高效液相法測定AHLL的剩余量。

1.3.7 復合納米粒紫外穩定性的測定[7] 將納米粒溶液經紫外燈（20 W）照射24 h，期間每4 h取樣，選用游離的AHLL溶液作對照。用高效液相法測定AHLL的剩余量。

1.3.8 復合納米粒體外模擬胃腸消化反應 模擬胃消化[15]，用鹽酸（0.1 mol/L）將AHLL、HSF-AHLL溶液pH值調至2.0，水浴加熱至37 ℃后，加入胃蛋白酶（加量比AHLL ∶胃蛋白酶=1 ∶20）在GI20體外模擬消化系統上恒溫酶解2 h。模擬胃消化總時長120 min，于胃消化開始后30 min取樣，取樣間隔時間30 min，取樣后立即放入沸水浴中滅酶10 min，測定經過模擬胃消化后的ACE抑制活性變化。模擬腸消化[16]：樣品經過模擬胃消化2 h后，用NaHCO3（1.0 mol/L）調節體系的pH值至7.0。繼續加熱至37 ℃，加入胰蛋白酶（加量比AHLL ∶胰蛋白酶=1 ∶20），在GI20體外模擬消化系統上恒溫酶解 2 h。在腸消化期間每隔1 h取樣1次于沸水浴中滅酶10 min，測定樣品的ACE抑制活性在腸消化結束后的變化情況。

1.3.9? ACE抑制活性測定方法[2，11] 取10 μL ACE溶液和10 μL樣品不混合地加入96孔板中，然后加入150 μL預熱過的底物（1.0 mmol/L FAPGG溶解于50 mmol/L Tris-HCl，pH值為7.5，包含 0.3 mol/L NaCl），使其開始反應。酶標儀升溫至 37 ℃ 后立即放入96孔板，于340 nm檢測吸光度，檢測時間間隔為1 min，檢測時長為20 min。空白對照為10 μL緩沖液（50 mmol/L Tris-HCl，pH值為7.5，包含 0.3 mol/L NaCl）。以吸光度（D340 min）為橫坐標，檢測時間為縱坐標繪制標準曲線，取10～20 min的斜率計算。

ACE抑制率=1-（D抑制劑/D空白）×100%。

1.3.10 探究HSF-AHLL在Caco-2細胞上的轉運途徑 當Transwell板上的Caco-2細胞的跨膜電阻>600 Ω·cm2、熒光黃表觀滲透系數Papp<1.0×10-6 cm/s時，可進行細胞轉運試驗[7，17]。選用納米粒HSF-AHLL（100-200 μg/mL）作為供液，HBSS（pH值=7.4）溶液作為接收液，考察 10 μmol/L Gly-Pro[18]（肽轉運載體競爭性抑制劑）、25 μmol/L氧化苯胂（內吞抑制劑）和 100 μmol/L 脫氧膽酸鈉[19]（旁路轉運促進劑），對HSF-AHLL轉運途徑的影響。對于AP→BL轉運：將0.5 mL樣品加入AP側作為供給池，同時BL側加入1.5 mL空白HBSS作為接收池;對于BL→AP的轉運：將1.5 mL樣品加入BL側作為供給池，AP側加0.5 mL空白HBSS作為接收池，抑制劑加樣量200 μL，每次取樣150 μL，同時相應地補加 37 ℃ 150 μL空白HBSS溶液，轉運時長為 120 min，所有試驗都3次平行。樣品中AHLL含量用高效液相法測定。

1.3.11 不同外排抑制劑對HSF-AHLL在Caco-2細胞上的轉運影響 選用100 μmol/LP-糖蛋白抑制劑維拉帕米[20]，50 μmol/L多藥耐藥蛋白轉運時取AP側轉運液，測定轉運液中的藥物濃度。計算表觀滲透參數（Papp）和PDR值。

根據以下公式計算表觀滲透系數：

Papp=ΔQ/（Δt×A×C0） （cm/s）。

式中：ΔQ是累積轉運量，為Δt內的轉運量，單位mg;A是Transwell膜表面積，單位cm2;C0為加入Caco-2細胞模型的樣品初始質量濃度，單位μg/mL。

表觀滲透系數比PDR=Papp（BtoA）/Papp（AtoB）。

1.3.12 不同溫度對復合納米粒轉運的影響：對于Caco-2細胞的轉運試驗同“1.3.10”節，分別于 4、37 ℃培養，計算AP→BL和BL→AP的表觀滲透參數（Papp），分析溫度對轉運的影響。

2 結果與分析

2.1 HSF-AHLL納米粒的結構表征

2.1.1 圓二色譜分析

通過圓二色譜儀測定光譜區域范圍在200～280 nm內的復合納米載體的二級結構，以鐵蛋白在此光譜區域的數值作對比，觀察其變化情況。如圖1-A可觀察到HSF和HSF-AHLL在209.5 nm和218.5 nm有負的肩峰譜帶;復合納米粒HSF-AHLL在240～280 nm范圍內的圓二光譜曲線與鐵蛋白的光譜曲線幾乎重疊在一起，說明AHLL通過靜電吸引力作用被包埋進HSF的空腔內形成了復合納米粒，包埋過程對鐵蛋白的二級結構沒有影響，HSF-AHLL納米粒的圓二色譜特征肩峰譜帶[21]在222 nm 和208 nm 處有出峰更能證明HSF-AHLL納米粒具有α-螺旋結構，但與鐵蛋白的二級結構存在差異。

從表1可知，HSF-AHLL復合納米粒的α-螺旋結構和β-轉角結構含量比HFS有所降低，但 β-折疊結構含量和無規卷曲含量較HFS又有所增長。蛋白質分子α-螺旋結構的降低和 β-折疊結構的升高意味著蛋白質結構由規整向松散轉化[22]。出現這種情況可能是因為經過包埋處理后蛋白質空間結構發生了一定的變化[11]，蛋白的結構較包埋前更加延展。α-螺旋結構包含數量較多的氫鍵，整體緊密且沒有空腔，而β-折疊結構較為無序，蛋白質結構的有序性與其某些功能性質是相關聯的，β-折疊含量的增加有利于發揮蛋白質的某些功能性質[23]，例如有利于增強蛋白質的柔韌性和擴展性。經過包埋處理后的HSF二級結構出現以上的變化，標志著HSF的整體分子構象從有序轉化為無序，與之相對應的功能也隨著分子構象的改變而變化。

2.1.2 熒光光譜分析

在以往研究中得知，色氨酸的典型發射曲線在激發波長為280 nm時出現[24]。利用熒光光譜分析復合納米粒，如圖1-B所示，在310 nm波長處附近產生內源熒光，由此可以推測鐵蛋白中有色氨酸和絡氨酸的存在。圖1-B中復合納米粒HSF-AHLL的內源熒光光譜強度在310 nm處發生了明顯的變化，可能是發生了淬滅現象，可以推測，由于包埋處理導致鐵蛋白四重軸通道上的色氨酸微環境有所改變。多肽AHLL與鐵蛋白的靜電結合，對鐵蛋白的分子結構也存在些許影響。

2.1.3 紫外光譜分析

圖1-C反映的是HSF、HSF-AHLL的紫外可見光吸收光譜。它們在近紫外區（190～350 nm）的紫外光譜幾乎重疊，表現出相似的光譜特征。與文獻[25]記載的最大吸收峰波長的出峰時間（212 nm和280 nm）基本一致。這種吸收峰的出現是由于鐵蛋白中存在帶有芳環的氨基酸殘基而造成的，吸收峰的強度與蛋白的濃度變化成正比。根據光譜變化可以確定，復合納米粒HSF-AHLL具有和鐵蛋白類似的大分子共軛結構，并且AHLL通過包埋處理進入鐵蛋白的空腔中，鐵蛋白的表面性質沒有受到改變。

2.2 HSF-AHLL納米粒的穩定性分析

2.2.1 AHLL納米粒的溫度穩定性 由圖2可知，

在不同溫度下處理60 min，80 ℃處游離的AHLL降解了78.30%，而HSF-AHLL中的AHLL只降解了51.34%，其穩定性提高了26.96百分點。80 ℃之后游離的AHLL降解率變化有所緩和，但包埋處理后的復合納米粒HSF-AHLL的降解率較AHLL而言普遍偏低。這一現象反映出復合納米粒HSF-AHLL的熱穩定性明顯提高。由于鐵蛋白具有非常穩定的結構，在中性條件下加熱至80 ℃也不易變性[26]，ACE抑制肽AHLL通過疏水作用力或范德華力與鐵蛋白內部空腔結構中的氨基酸殘基穩定結合，形成了HSF-AHLL復合物[11]，鐵蛋白的外殼相當于一層堅固的壁壘，起到隔絕溫度和保護的作用，其空腔內部包裹著AHLL，在復雜的食品體系中可以減少AHLL與鐵蛋白外部的小分子發生反應的概率，使AHLL更加穩定。

2.2.2 AHLL納米粒的pH穩定性的影響

將制備好的HSF-AHLL納米粒分別調pH值至2.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，置于磁力攪拌器上分別反應 30 min 和60 min，再將pH值還原至7.4，在反應期間取樣測定AHLL含量變化。由圖3可知，包封率在酸性和堿性環境下的變化明顯，但在中性環境下相對穩定，可以推測中性環境最適于HSF-AHLL納米粒的保存。出現此種現象的原因是鐵蛋白自身特殊的結構特點，鐵蛋白在極酸或極堿性環境下極易變性，發生變性的蛋白會逐個解離成單個亞基的狀態，當pH值由極酸或極堿還原成中性時，鐵蛋白會隨之變化，恢復成穩定的球形結構。

2.2.3 AHLL納米粒的紫外穩定性

如圖4所示，AHLL和HSF-AHLL經過紫外照射后，24 h內游離的AHLL降解了87.28%，而HSF-AHLL包埋物中的AHLL降解了51.45%，其穩定性分別提高了35.83百分點。所以，經包埋處理后的復合納米粒HSF-AHLL受紫外輻照后的降解率明顯降低。

2.2.4 AHLL納米粒的體外消化

圖5所顯示的是，AHLL和HSF-AHLL經過模擬體外胃消化1～3 h后進入腸消化4～6 h，產物的ACE抑制活性變化。在胃部消化過程中，游離AHLL的ACE抑制活性明顯高于HSF包封的AHLL。一個可能的原因是，HSF將AHLL與外界環境阻隔，從而降低了其抑制活性。兩者的ACE抑制活性在2 h后明顯下降，預示AHLL在酸性環境下發生了降解，且游離態AHLL的下降幅度高于包封AHLL，可能與HSF的穩態化保護效果有關。當轉移到腸液中后，兩者的ACE抑制活性變化幅度不明顯。

2.3 HSF-AHLL納米粒在Caco-2細胞模型中的吸收機制

2.3.1 不同抑制劑處理HSF-AHLL在Caco-2細胞上的轉運分析

細胞旁路轉運、跨膜轉運和肽載體介導的主動轉運是物質跨腸上皮細胞轉運的常見途徑。本試驗采用肽轉運載體競爭性抑制劑Gly-Pro[18]、內吞抑制劑氧化苯胂和旁路轉運促進劑脫氧膽酸鈉[19]探討HSF-AHLL的轉運途徑。從圖6中可以看出，HSF-AHLL在經過Gly-Pro對肽轉運載體競爭性的抑制和氧化苯胂對胞吞轉運的抑制120 min后，濃度變化與空白組對照相比差異并不明顯，而經過促進劑脫氧膽酸鈉處理的AHLL和HSF-AHLL的含量較高，說明復合納米粒 HSF-AHLL 在Caco-2細胞單層膜上的主要轉運方式是旁路轉運，脫氧膽酸鈉屬于膽酸鹽類的細胞旁路轉運促進劑，對溶解磷脂相對有效，有利于旁路轉運[27]。當HSF-AHLL在Caco-2細胞單層上進行跨膜轉運時，能有效地打開細胞通路從而促進其在Caco-2細胞單層的轉運。

在AP側或BL側分別加入P-糖蛋白抑制劑維拉帕米[21]、多藥耐藥蛋白抑制劑MK-571[28]。Caco-2細胞AP側存在2種主要的外排蛋白[11]，即 P-糖蛋白和多藥耐藥蛋白，其主要功能是通過抑制消耗能量，把細胞中的營養物質排到細胞外，從而影響細胞自身對營養物質吸收。轉運120 min后，加入維拉帕米的Papp（AtoB）值為（27.12±0.54）×10-6 cm/s，PDR為0.23。說明AHLL是P-糖蛋白的外排底物。加入MK-571的Papp（AtoB）值升高，Papp（BtoA）值沒有明顯的差異（圖7），PDR值降低10%，證明HSF-AHLL的轉運與多藥耐藥蛋白抑制劑形成競爭性抑制。

2.3.2 不同溫度對復合納米粒轉運的影響

當轉運溫度從4 ℃變化為37 ℃時，復合納米粒HSF-AHLL在Caco-2細胞單層的雙向吸收變化情況如圖8所示。轉運溫度為37 ℃時AP→BL和BL→AP 2個方向的AHLL濃度相較4 ℃時有所增加，Papp（AtoB）從（6.75±0.34）×10-6 cm/s上升到（25.29±0.63）×10-6 cm/s，Papp（BtoA）從（2.18±0.11）×10-6 cm/s 上升到（6.27±0.27）×10-6 cm/s，溫度上升對HSF-AHLL在Caco-2細胞單層的轉運起到了促進作用。溫度扮演著能量依賴轉運抑制劑的角色，溫度降低減少了細胞代謝，反之溫度升高細胞代謝也會增強，可以推測說明HSF-AHLL的轉運對溫度具有一定的依賴性，屬于能量依賴型轉運。

3 討論與結論

從圓二色譜結果可知，經過包埋處理后AHLL通過靜電吸引力作用被包埋進HSF的空腔內形成了復合納米粒，包埋過程對鐵蛋白的二級結構沒有影響，蛋白質空間結構發生了些許的變化;紫外光譜結果說明復合納米粒HSF-AHLL具有和鐵蛋白類似的大分子共軛結構，并且AHLL通過包埋處理進入鐵蛋白的空腔中，鐵蛋白的表面性質沒有受到改變;熒光光譜結果說明包埋處理改變了鐵蛋白在四重軸通道上的色氨酸微環境。

不同溫度處理60 min，HSF-AHLL中的AHLL只降解了51.34%，其穩定性提高了26.96%，HSF-AHLLL 較游離的AHLL熱穩定性明顯提高，HSF-AHLL納米粒在中性環境的穩定性最好。

模擬體外胃腸消化說明，在胃酸的大環境下鐵蛋白的亞基會打開，復合納米粒HSF-AHLL進入消化系統后，ACE抑制率低于游離的AHLL經過體外消化后的抑制率;復合納米粒HSF-AHLL在腸道的中性條件下能夠穩定地保持繼而被有效地吸收，ACE抑制活性明顯提高。

HSF-AHLL在Caco-2細胞單層膜上以細胞旁路轉運為主，內吞抑制劑和肽載體抑制劑對其轉運沒有明顯影響，而脫氧膽酸鈉能打開細胞間通路促進其轉運。

HSF-AHLL的轉運與多藥耐藥蛋白抑制劑形成競爭性抑制，HSF-AHLL的轉運對溫度具有一定的依賴性，屬于能量依賴型轉運。

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