急性心肌梗死后心力衰竭的特異性靶點基因研究

李樹杰，宋昱

（1.天津醫科大學研究生院，天津300070；2.天津泰達國際心血管病醫院ICU，天津300457）

急性心肌梗死是我國50～75歲人群中多發疾病， 而且死亡率居高不下[1]。急性心肌梗死主要是由持續性缺血缺氧、冠狀動脈急性缺血缺氧所導致的心肌梗死。目前臨床主要采取保守治療和經皮冠狀動脈介入治療（percutaneouscoronary intervention，PCI）[2]。心力衰竭是急性心肌梗死后常見的并發癥，并且與多種嚴重的不良預后密切相關[3-4]。然而，目前針對急性心肌梗死后心力衰竭的發病機制尚不明了。其特異性預測生物標志物和候選治療靶點尚未完全建立。針對于此，本研究利用GEO數據庫進行急性心肌梗死后心力衰竭靶點基因的篩選，并開展臨床初步驗證。

1 資料與方法

1.1 生物信息方法篩選差異基因

1.1.1 數據源 本研究分析數據來源于GEO數據庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/），編號GSE59867。芯片中包含65個樣本，記錄了17例急性心肌梗死患者在發病后6個月隨訪期間內心力衰竭發展的詳細情況。本研究生物信息部分針對芯片中17例急性心肌梗死患者入院、出院（4～6 d）、1個月和6個月后外周血單個核細胞的轉錄譜進行分析。芯片中急性心肌梗死發生后心力衰竭患者（n=9）與非心力衰竭患者（n=8）在臨床基本特征上無顯著差異（P>0.05）。芯片數據是利用GPL6244平臺進行分析。

1.1.2 差異基因分析 本研究以R語言中limma軟件包來分析不同組之間差異表達的mRNA和miRNA，以對數轉換的差異表達倍數（Log2FC）的絕對值>1和P<0.05為標準[5]。

1.1.3 miRNA靶點基因的預測 miRNA的靶點基因通過miRNA數據庫（miRDB，版本6.0）進行預測[6]。Cytoscape軟件（3.7.2版）用于miRNA-mRNA相關性可視化調控網絡建立。

1.2 針對重點基因的臨床驗證

1.2.1 研究對象 回顧性分析天津泰達國際心血管病醫院2018年1月—2020年12月經病理確診的急性心肌梗死患者。納入標準：所有病例均經病理證實；有完整的影像學檢查資料。排除標準：存在其他心血管疾??；存在重大疾??；未得到患者或者家屬同意。患者出院后跟蹤記錄觀察6個月，研究對象共61例，根據心力衰竭與否分為：心力衰竭組[共32例，男性20例，女性12例，年齡（51.2±8.3）歲]與非心力衰竭組[共29例，男性18例，女性11例，年齡（47.3±7.2）歲]。組間患者臨床基本特征上無顯著差異（P>0.05）。

1.2.2 ELISA檢測 差異基因濃度測定采用ELISA雙抗體夾心法，具體操作嚴格按照商用試劑盒說明書進行（Abcam公司）。待測樣品源于兩組患者的外周血。實驗進行3次獨立檢測，最終進行統計分析。

1.3 統計學處理 采用Excel 2013軟件建立數據庫，SAS 9.4和SPSS 19.0統計軟件進行數據分析。對連續性變量進行正態分布檢驗，符合正態分布的變量以±s表示，采用SAS 9.4中的t檢驗方法用于數據比較。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 芯片中心力衰竭組差異基因篩選與非心力衰竭組比較 心力衰竭組共顯示703個差異表達基因（mRNAs），包括567個上調基因和136個下調基因（圖1A和圖1B）。其中SPI1、MCUR1、ZBTB7A、IRF8和PPARG表現出最顯著上調。與此同時，心力衰竭組患者表現出12個差異miRNAs，其中上調的miRNAs 5個，下調的miRNAs 7個（圖1C和圖1D）。miR-133、miR-124-3和miR-9-1顯著下調，差異均具有統計學意義（P<0.05）。

圖1 急性心肌梗死患者心力衰竭組差異基因分析Fig 1 Differential geneanalysisof heart failuregroup in patientswith acutemyocardial infarction

2.2 芯片中心力衰竭組miRNA-mRNA調控網絡 本研究利用Cytoscape軟件將3種選定的miRNA（miR-133、miR-124-3和miR-9-1）和5個差異最為顯著的mRNA（SPI1、MCUR1、ZBTB7A、IRF8和PPARG）構建基因調控網絡。從圖2可以看出，miR-133參與SPI1和MCUR1功能的調控，而miR-124-3和miR-9-1分別控制ZBTB7A、PPARG以及IRF8。

圖2 急性心肌梗死患者心力衰竭組mRNA-miRNA基因網絡圖Fig 2 Construction of mRNA-miRNA interaction network of heart failuregroup in patientswith acutemyocardial infarction

2.3 差異基因臨床檢測 與非心力衰竭組比較，SPI1、MCUR1、ZBTB7A、IRF8和PPARG蛋白表達濃度在心力衰竭組中顯著升高。與差異基因篩選結果一 致，差異均具有統計學意義（P<0.05），見表1。

表1 差異基因的水平檢測（±s）Tab 1 Detection of differentially expressed genes（±s）

表1 差異基因的水平檢測（±s）Tab 1 Detection of differentially expressed genes（±s）

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3 討論

急性心肌梗死是臨床常見危重癥，起病急驟，病情變化迅速，死亡率高。心力衰竭是急性心肌梗死最常見的并發癥。近年來，中國發布了心肌梗死和心力衰竭的診療指南[7]。指南中明確指出：中國心肌梗死后心力衰竭仍然存在很高的發病率。雖然近些年隨著治療手段的發展，心肌梗死后心力衰竭患者的預后得到一定改善，但是其死亡率、心血管事件發生率仍然居高不下。這與該類患者治療手段和發現的時間密切相關[8]。目前臨床上針對急性心肌梗死后心力衰竭的有效標記物研究較少。本研究利用生物信息學和臨床驗證的方式，提出了若干潛在心力衰竭標志物，并構建了基因調控網絡。本研究確定SPI1、MCUR1、ZBTB7A、IRF8和PPARG可以作為急性心肌梗死后心力衰竭的主要特征性基因。最近一項研究表明，SPI1在心肌重塑的發病機制中存在明顯的過量表達[9]。MCUR1是線粒體鈣單向轉運蛋白調節因子1，主要在心肌細胞內離子調控方面發揮重要作用[10]。ZBTB7A是一種含POZ結構域的蛋白質，直接結合到許多基因組調控位點，控制染色質結構和基因組啟動子的招募。ZBTB7A主要通過核因子-κB通路，調節心肌細胞的功能[11]。IRF8是來自干擾素調節因子（IRF）家族的一員。除了調節先天性免疫反應外，IRF8還被證實涉及某些癌癥的腫瘤抑制基因調節。IRF8心肌特異性過表達的小鼠可以對主動脈縮窄引起的心肌肥大具有保護作用[12]。PPARG是核受體的過氧化物酶體的亞家族成員之。目前，PPARG已經證實與許多疾病的形成密切相關，例如肥胖、糖尿病、動脈粥樣硬化和癌癥。PPARG還可以通過抑制炎癥、氧化應激和凋亡發揮心臟保護作用[13]。

本研究另一個重點是miRNA和急性心肌梗死后心力衰竭的密切聯系。miR-133、miR-124-3和miR-9-1是心力衰竭組的主要差異miRNAs。miR-133在之前的研究中已經被證明可以控制心肌纖維類型轉換并誘導肌源性分化程序[14]。miR-124-3和miR-9-1也在一項生物信息報道中列為心力衰竭的主要參與mRNAs[15]。值得注意的是，本研究發現的5個主要差異基因在心力衰竭組中的表達均明顯增加。這或許可以用3個主要miRNAs的下調來解釋（圖2）。這些都值得進一步調查?？傮w而言，本研究全面比較了急性心肌梗死后心力衰竭組與非心力衰竭組主要的差異基因圖譜，并建立了差異基因網絡圖，為今后了解急性心肌梗死患者后心力衰竭的發病機制提出了新的思路。本研究為單中心研究，樣本量有限，尚存在一定的局限性。為了差異標志物更有效的進行臨床推廣，未來還需要進行多中心、大樣本量研究。