室內外培養對大溪地等鞭金藻細胞生長和色素含量的影響

呂布 ，葉丙聰 ，周建聰 ，李曦 ，王愛民 ，顧志峰 *，鄭興

（1.海南大學海洋學院，海南 海口 570228；2.海南大學南海海洋資源利用國家重點實驗室，海南 海口 570228）

大溪地等鞭金藻（Isochrysis galbana）是一種微小的金黃色金藻，其個體較小（直徑5 μm），且無細胞壁，其營養物質豐富，富含多種不飽和脂肪酸和蛋白質，并具有易被消化吸收等特點[1]。大溪地等鞭金藻作為海產雙殼動物幼蟲的理想餌料，已廣泛應用于大珠母貝、扇貝、牡蠣和泥蚶等養殖，并被認為是人工育苗的優質餌料[2-5]。在細巧華哲水蚤人工規模培養中，大溪地等鞭金藻也是其較優餌料[6]。

大溪地等鞭金藻是微藻的一種，微藻中光合色素主要包括葉綠素和類胡蘿卜素，其具有吸收和傳遞光能的功能[7]，是細胞光合作用的主要參與者。光合色素的含量對微藻的碳、氮代謝十分重要，可直接影響微藻的生長發育及產量[8]。在微藻的培養中，培養條件影響著微藻的生長速度、高效擴繁及活性物質的積累[9]。養殖戶在室內培養微藻的過程中，由于空間有限，影響其生長和繁育，同時室內培養需要光照，在此過程中消耗大量的電力，因此，調整培養模式和條件對微藻的培育十分重要[10]。目前，室外條件下規模培養微藻具有極大的應用價值[11]。掌握微藻的生長規律及最優培養條件，對于提升微藻生長速度和擴大產量有較大意義[12]。現將大溪地等鞭金藻于室內和室外條件下開展培養試驗，對比分析其生長規律、光合色素含量、水分含量及灰分含量的差異，以探究最適培養條件，為大溪地等鞭金藻的開發利用提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

大溪地等鞭金藻取自海南大學海洋學院保種室。試驗前對藻種進行純化擴培，提取快速生長期的藻液。使用過濾并滅菌的自然海水及“寧波3#”微藻培養液，海水的鹽度為30，培養基成分為ρ（NaNO3）=100 mg/L，ρ（NaH2PO4）=10 mg/L，ρ（FeSO4）=2.5 mg/L，ρ（MnSO4）=2.5 mg/L，ρ（EDTA－Na）=10 mg/L，ρ（維生素 B1）=6×10-3mg/L，ρ（維生素B12）=5×10-7mg/L[4]。

1.2 試驗方法

包括室內和室外兩種培養條件。其中室內試驗培養條件：溫度為（25±1）℃，光照強度為（119±1）μmol/（m2·s），光暗周期為12 h∶12 h；室外試驗培養條件：溫度為（22±3）℃，光照強度為（442±94）μmol/（m2·s），光暗周期為12 h∶12 h。每種條件設置3 個平行培養組，于5 L 三角錐形瓶中進行培養，藻細胞接種密度為1.00×103cells/L，培養過程中不充氣，每天搖動幾次。以藻種與培養液充分混合后為時間起點，每隔24 h 取樣1 次，取樣前將培養瓶中的藻液搖勻，分別取3 個樣品檢測藻類密度、干重、濕重、灰分和色素含量。

1.3 測定項目及方法

（1）藻細胞數目。采用血球計數板法測定[13]。

（2）藻細胞干重。烘干并預先稱量Whatman GF/C 膜的質量，將20 mL 大溪地等鞭金藻的藻液于該膜過濾，經過沖洗除營養鹽后，放入105 ℃烘箱中烘72 h 后稱取質量，以前后兩次質量差不超過2 mg為準，通過烘干前后質量的差值來計算干重[14]。

（3）水分含量。培養結束后，將20 mL 藻液通過Whatman GF/C 膜抽濾，于105 ℃烘箱中干燥至恒重，稱取質量，直至前后兩次質量差不超過2 mg，干燥后的質量記為m1。同時，取20 mL 藻液4 000 r/min，離心10 min，收集藻細胞，樣品的質量記為m2[14]。

（4）灰分含量。將Whatman GF/C 膜放在鋁箔杯中，置于105 ℃的烘箱中，烘干至恒重，記為M2；將20 mL 藻液通過Whatman GF/C 膜抽濾后，放入鋁箔杯于500 ℃的馬弗爐中烘干至恒重，記為M3。鋁箔杯的質量記為M1[15]。

（5）葉綠素及類胡蘿卜素的測定。利用丙酮萃取法提取微藻的葉綠素[16-17]，將藻液于Whatman GF/C 膜上抽濾，離心，用分光光度計（島津UV-1700）分別測定在波長為 630，647，664，750 和 470 nm 處溶液的吸光度值并記錄，減去波長750 nm 下測得的吸光度值，得到校正后的各波長對應的吸光光度值，并計算各色素的濃度。

1.4 數據分析

試驗數據均表示為平均值±標準差（Mean±SD），采用Microsoft Excel 2016 對數據處理，用DPS 14.5軟件進行單因素方差分析，若有顯著差異，再進行二因素方差分析，以P<0.05 為差異顯著。

2 結果和分析

2.1 兩種培養條件對密度的影響

試驗結果顯示，在室內培養條件下，培養1~7 d，藻細胞密度隨培養時間的延長而升高；在室外培養條件下，培養1~10 d，藻細胞密度隨培養時間的延長而升高；達到峰值后，兩種培養條件下的藻細胞密度均隨培養時間的延長而逐漸降低并趨于平穩。在室外培養條件下，藻細胞密度在第10 d 最高，為4.95×103cells/L，在室內培養條件下，藻類密度在第7 d 最高，為3.48×103cells/L（圖1）。第8 d 開始，兩種培養條件下藻類細胞密度開始出現顯著差異（P<0.05），二因素方差分析結果顯示，室外培養條件下藻細胞密度顯著（P<0.05）高于室內培養條件下。

圖1 兩種培養條件對大溪地等鞭金藻密度的影響

2.2 兩種培養條件對色素含量的影響

試驗結果顯示，在室內培養條件下，葉綠素a、葉綠素c 和類胡蘿卜素經過緩慢增長后快速達到最高濃度，然后逐漸降低：葉綠素a 在第7 d 達到最大質量濃度，為0.44 mg/L；葉綠素c 在第2 d 達到最大質量濃度，為 0.26 mg/L（圖2）；類胡蘿卜素在第7 d 達到最大質量濃度，為5.91 mg/L（圖3）。在室外培養條件下，葉綠素a、葉綠素c 和類胡蘿卜素的變化趨勢與室內條件類似：葉綠素a 在第11 d 達到最大質量濃度，為 0.78 mg/L；葉綠素c 在第11 d 達到最大質量濃度，為0.28 mg/L；類胡蘿卜素在第11 d達到最大質量濃度，為14.15 mg/L。

圖2 兩種培養條件對大溪地等鞭金藻葉綠素的影響

圖3 兩種培養條件對大溪地等鞭金藻類胡蘿卜素的影響

兩種培養條件下，葉綠素a 質量濃度從第4 d開始出現極顯著差異（P<0.01），葉綠素c 質量濃度從第11 d 起開始出現極顯著差異（P<0.01），類胡蘿卜素質量濃度從第3 d 開始出現極顯著差異（P<0.01）。二因素方差分析表明，不同培養條件對于葉綠素a 具有極顯著的影響（P<0.01），而培養時間無顯著影響（P>0.05）；不同培養條件和時間對葉綠素c 均具有顯著的影響（P<0.05）；不同培養條件對于類胡蘿卜素具有極顯著的影響（P<0.01），而培養時間無顯著影響（P>0.05）。在室外培養條件下，葉綠素a 和類胡蘿卜素質量濃度均顯著（P<0.05）高于室內培養條件。

2.3 兩種培養條件對水分和灰分含量的影響

試驗結果顯示，大溪地等鞭金藻水分含量和灰分含量的變化趨勢相似，其中在室內培養條件下，大溪地等鞭金藻水分含量最大值為95.11%，灰分含量最大值為70.57%；在室外培養條件下，水分含量最大值為95.53%，灰分含量最大值為82.57%；在兩種培養條件下灰分含量具有顯著性差異（P<0.05）（圖4 和圖5）。二因素方差分析結果顯示，培養時間對大溪地等鞭金藻的水分含量和灰分含量具有極顯著的影響（P<0.01），不同培養條件對大溪地等鞭金藻的水分含量無顯著影響（P>0.05），對于灰分含量有顯著的影響（P<0.05）。

圖4 兩種培養條件對大溪地等鞭金藻水分含量的影響

圖5 兩種培養條件對大溪地等鞭金藻灰分含量的影響

2.4 兩種培養條件對培養基pH 值的影響

試驗結果顯示，在室內培養條件下培養基的pH 值為7.1~8.7，在室外培養條件下培養基的pH值為9~9.6，其中在室外條件下培養基pH 值升高的幅度較大（圖6）。從第3 d 開始，在兩種培養條件下培養基pH 值開始出現顯著差異（P<0.05）。二因素方差分析結果顯示，培養時間對培養基pH 值無顯著影響（P>0.05），培養條件對培養基pH 值有極顯著的影響（P<0.01）。

圖6 兩種培養條件對大溪地等鞭金藻培養基pH 值的影響

3 討論

研究顯示，與室內嚴格的培養條件相比，室外培養條件的變化大，具有不確定性，室外培養條件對微藻細胞的適應能力提出了更高的要求。由于室內外的環境不同，導致培養條件和污染程度各不相同，藻細胞在生長方面也表現出了不同的規律。在室外培養條件下，藻細胞的生長環境較室內惡劣，盡管在室外培養條件下培養基的pH 值變化較小，但是與室內條件下存在極顯著差異（P<0.01），且室外溫度的變化也較明顯。室外培養條件下藻細胞密度顯著（P<0.05）高于室內培養條件。柳敏海等[4]研究顯示，大溪地金藻適宜生長溫度為10~35 ℃，其適合作為在高溫季節的育苗餌料。在室外培養條件下，培養中的部分藻細胞密度有所下降，可能與當天降雨溫度和光照變化相關。本研究中，隨著培養時間的延長，培養液中積累的有機成分增多，藻液更有利于雜藻和細菌的生長，其種類和數量增加，遠超過了接種初期，這可能也是第10 d 以后藻細胞密度開始下降的重要原因。戴俊彪等[18]研究指出，過強的光照也可能是室外培養條件下球等鞭金藻生長緩慢的原因，當光照強度為（442±94）μmol/（m2·s）時，大溪地等鞭金藻生長得更好，其密度遠高于球等鞭金藻，相較而言，大溪地等鞭金藻適合作為高溫季節的戶外餌料。目前，大溪地等鞭金藻在室外條件下進行培養的研究較少，本研究中其對室外培養條件表現出較強的適應性，生長和繁殖速度較室內培養條件下快，因此認為大溪地等鞭金藻有一定承污能力，經進一步培養優化后，大溪地等鞭金藻的大規模室外培養具有一定的可行性。

大溪地等鞭金藻屬于光合自養型單胞藻，光照是其生長的關鍵因素。一般而言，細胞光合速率決定了藻類生長速度，而光合速率又取決于光合色素的含量，因此光合色素含量變化能反映大溪地等鞭金藻生長發育情況[19]。研究中，在室外培養條件下，大溪地等鞭金藻葉綠素a、葉綠素c 和類胡蘿卜素的最大質量濃度分別為0.78，0.26 和14.15 mg/L，其葉綠素a、葉綠素c 質量濃度遠低于湛江等鞭金藻，類胡蘿卜素質量濃度則更高[20]。出現該結果一方面可能是因為大溪地等鞭金藻葉綠素a 含量較低時，其將吸收的光能主要用于藻細胞數量的增加、生物質和類胡蘿卜素的積累以及必須組分的合成，光合色素可滿足光能的吸收，因此不需要進行色素的累積[21]；另一方面可能是因為室內光照強度比室外低，此外試驗采用搖瓶不充氣的方式，也可能因為曝氣不充分，使大溪地等鞭金藻的空間位置在較長時間內沒有充分置換，進而降低了光能的利用，今后在擴大培養中可通過補充CO2進行改良。在室內培養條件下大溪地等鞭金藻灰分含量顯著（P<0.05）低于室外條件下，該結果表明，室外培養條件更利于大溪地等鞭金藻有機物的積累。

4 結論

研究認為，大溪地等鞭金藻具有耐高溫和耐強光的特性，適宜在室外條件下培養，因此，該藻作為優質餌料生物在室外規模化培養方面具有一定的可行性。此外室外培養可減少成本投入，提高效益，具有廣闊的應用前景。pH 值、溫度和光照作為影響大溪地等鞭金藻的3 個重要環境因子，其中光照在很大程度上影響著藻細胞的生長。后期可進一步開展光照強度對藻細胞生化成分的影響研究，進一步推動大溪地等鞭金藻的室外規模化養殖，更好地為水生動物養殖提供優質餌料。