艾灸對腹瀉型腸易激綜合征大鼠結腸5-HT及 5-HT3R的影響

曹佳男 劉霞 劉濤 劉瓊 劉密 常小榮 謝輝

〔摘要〕 目的 觀察艾灸對腹瀉型腸易激綜合征（diarrhea predominant irritable bowel syndrome， IBS-D）大鼠5羥色胺（5-hydroxytryptamine， 5-HT）及5羥色胺3受體（5-hydroxytryptamine 3 receptor， 5-HT3R）的影響，分析艾灸治療IBS-D的作用機制。

方法 選取SPF級雄性SD大鼠48只隨機分為正常組、模型組、溫和灸組、西藥組，每組12只。乙酸灌腸后行束縛刺激，每天束縛1 h，持續束縛2周復制IBS-D大鼠模型。造模成功后，溫和灸組穴位分為兩組：Ⅰ組選肝俞、脾俞、足三里，Ⅱ組選章門、期門、足三里。Ⅰ組、Ⅱ組穴位隔日交替施灸，每次15 min，持續2周。西藥組以匹維溴銨片（10 mL/kg）灌胃，1次/d，持續2周。分別在治療前后觀察各組大鼠一般行為學、內臟敏感性、糞便含水量、結腸病理;ELISA法檢測結腸組織5-HT的含量;Western blot檢測結腸組織5-HT3R的表達。結果 正常組大鼠精神、活動佳，反應靈敏;模型組大鼠精神、活動差、反應遲緩;與模型組相比，溫和灸組、西藥組大鼠一般行為學表現均有改善。各組大鼠結腸組織形態均正常，無明顯充血水腫潰瘍、炎癥細胞浸潤等病理組織學改變。與正常組比較，模型組大鼠內臟敏感性升高（P<0.01）;與模型組相比，溫和灸組、西藥組大鼠內臟敏感性下降（P<0.01）。與正常組比較，模型組大鼠糞便含水量增加（P<0.01）;與模型組相比，溫和灸組、西藥組大鼠大便含水量明顯降低（P<0.01）。與正常組相比，模型組結腸組織中5-HT、5-HT3R的表達量上升（P<0.05，P<0.01）;與模型組相比，溫和灸組、西藥組結腸組織中5-HT、5-HT3R的表達量下降（P<0.05，P<0.01）。結論 艾灸可以有效改善IBS-D大鼠腹瀉癥狀和內臟高敏感性，可能與艾灸調節結腸組織中5-HT及其受體的表達相關。

〔關鍵詞〕 艾灸;腸易激綜合征;5羥色胺;5羥色胺3受體;內臟敏感性

〔中圖分類號〕R245.8? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.10.004

Effect of Moxibustion on Colon 5-HT and 5-HT3R in Diarrhea Predominant

Irritable Bowel Syndrome Rats

CAO Jianan1， LIU Xia2， LIU Tao3， LIU Qiong1， LIU Mi1， CHANG Xiaorong1*， XIE Hui4*

（1. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China;

2. Chongqing Three Gorges Medical College， Wanzhou， Chongqing 404120， China;

3. Jiangsu Province Academy of Traditional Chinese Medicine， Nanjing， Jiangsu 210028， China;

4. West Hospital of Chenzhou First Peoples Hospital， Chenzhou， Hunan 423000， China）

〔Abstract〕 Objective To observe the effect of moxibustion on 5-hydroxytryptamine （5-HT） and 5-hydroxytryptamine 3 receptor （5-HT3R） in colon tissue of rats with diarrhea predominant irritable bowel syndrome （IBS-D）， and to analyze the mechanism of moxibustion in the treatment of IBS-D.? Methods? 48 SPF male SD rats were randomly divided into normal group， model group，

mild moxibustion group and western medicine group， with 12 rats in each group. After acetic acid enema， the IBS-D rat model was reproduced by restraint stimulation for one hour a day and two weeks. After successful modeling， acupuncture points were divided into two groups in mild moxibustion group： group Ⅰ selected “Ganshu” （BL18）， “Pishu” （BL20） and “Zusanli” （ST36）， and group Ⅱ selected “Zhangmen” （LR13）， “Qimen” （LA14） and “Zusanli” （ST36）. Group Ⅰ and group Ⅱ were treated with moxibustion alternately every other day for 15 minutes each time for two weeks. The western medicine group was given piveronium bromide tablets （10 mL/kg）， once a day for two weeks. The general behavior， visceral sensitivity， fecal water content and colon pathology were observed before and after treatment. The content of 5-HT in colon tissue was detected by ELISA. The expression of 5-HT3R in colon was detected by Western blot. Results The rats in the normal group had good spirit and activity and sensitive response; the rats in the model group had poor spirit and activity and slow response; compared with the model group， the general behavior of rats in mild moxibustion group and western medicine group were improved. The colonic morphology of rats in each group was normal， without obvious histopathological changes such as congestion， edema， ulcer and inflammatory cell infiltration. Compared with the normal group， the visceral sensitivity of the model group was higher （P<0.01）; compared with the model group， the visceral sensitivity of rats in mild moxibustion group and western medicine group decreased （P<0.01）. Compared with the normal group， the fecal water content in the model group increased （P<0.01）; compared with the model group， the water content of stool in mild moxibustion

group and western medicine group decreased significantly （P<0.01）. Compared with the normal group， the expression levels of 5-HT and 5-HT3R in the colon of the model group increased （P<0.05， P<0.01）; compared with the model group， the expression levels of 5-HT and 5-HT3R in colon tissue of mild moxibustion group and western medicine group decreased （P<0.05， P<0.01）. Conclusion Moxibustion can effectively improve diarrhea symptoms and visceral hypersensitivity in IBS-D rats， which may be related to moxibustion regulating the expression of 5-HT and its receptor in colon tissue.

〔Keywords〕 moxibustion; irritable bowel syndrome; 5-hydroxytryptamine; 5-hydroxytryptamine 3 receptor; visceral sensitivity

腸易激綜合征（irritable bowel syndrome， IBS）是臨床上一種常見的功能紊亂的腸道疾病，在我國以腹瀉型腸易激綜合征（diarrhea predominant irritable bowel syndrome， IBS-D）發病率最高[1-2]。IBS的發病機制可能與腸道動力及感覺異常、急性腸道感染引發的炎癥、免疫功能異常、腸道菌群改變、精神與心理等因素有關[3]。5羥色胺（5-hydroxytryptamine， 5-HT）作為一種重要的神經遞質，廣泛的存在于人體的各種組織與器官中，人體中約有95%的5-HT分布在于胃腸道中，與不同受體相結合產生相互作用，影響胃腸道的動力、分泌及內臟感覺等[4-7]。在5-HT各亞型受體中，與IBS-D關系密切的是5-HT3受體（5-hydroxytryptamine 3 receptor， 5-HT3R）[8-9]。近年來，中醫藥在治療IBS方面取得了良好的效果，具有不良反應少、遠期效果好的優勢[10]，但有關艾灸對IBS-D的作用及其機制研究鮮有報道，本實驗通過艾灸治療IBS-D大鼠，檢測5-HT及5-HT3R的表達觀察其變化，探討艾灸治療IBS-D的作用機制，為指導臨床提供理論依據。

1 材料與方法

1.1? 動物來源及分組

48只SPF級雄性SD大鼠，4周齡，體質量（180±10） g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，許可證號：SCXK（湘）2016-0002。飼養于湖南中醫藥大學實驗動物中心，實驗室溫度維持在21～23 ℃，濕度40%～60%。適應性喂養1周后，將大鼠隨機分為正常組、模型組、溫和灸組、西藥組，每組12只。

1.2? 主要試劑與儀器

電子天平（型號：HLD-10002，杭州友恒稱重設備有限公司）;小動物電子秤（型號：YP10002，上海佑科儀表有限公司）;組織病理包埋儀（型號：EG1160，德國Leica公司）;組織病理切片機（型號：RM 2135，德國Leica公司）;導尿管（型號：F8，揚州市吉康醫療器械有限公司）。5-HT酶聯免疫吸附（ELISA）試劑盒（批號：E-EL-0033c，武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司）;5-HT3R抗體（批號：10443-1-AP，美國Proteintech公司）;艾條（規格：5.3 mm×65 mm，50支/盒，湖南高圣生物有限公司）、匹維溴銨片[國藥準字：H20160396（原H20120127），規格：50 mg/片，法國Abbott Healthcare SAS公司]等。

1.3? 模型制備及評價

參考相關文獻[11]，采用乙酸灌腸+束縛應激刺激復制IBS-D大鼠模型：實驗前24 h給造模大鼠（模型組+溫和灸組+西藥組）禁食不禁水，灌腸前用無菌棉球蘸取石蠟油潤滑肛門及導管，插入肛門距離約8 cm，向肛門內注入4%乙酸1 mL，緩慢拔出導尿管，用手壓迫肛門并將大鼠尾巴抬高30 s以防乙酸流出，隨即用0.01 mol/L PBS 1 mL沖洗結腸，7 d后行束縛應激刺激，將灌腸大鼠置于自制束縛裝置中1 h，持續2周。正常組大鼠常規喂養，不予任何措施。

模型評價：以大鼠精神萎靡、活動度差、反應遲緩，內臟敏感性降低和糞便含水量升高，與正常組之間對比差異具有統計學意義為造模成功[12-13]。

1.4? 干預方法

1.4.1? 正常組? SD大鼠，以正常喂養2周，無特殊處理。

1.4.2? 模型組? 造模成功后，正常喂養，并予生理鹽水（10 mL/kg）灌胃，每日1次，持續時間為2周。

1.4.3? 溫和灸組? （1）取穴分組及穴位定位：Ⅰ組選肝俞、脾俞、足三里，Ⅱ組選章門、期門、足三里。穴位定位參照《實驗針灸學》大鼠常用針灸穴位結合擬人比照法進行穴位定位[14]。（2）溫和灸方法：IBS-D模型大鼠，正常喂養，將艾條點燃懸于穴位上方2～3 cm艾灸，Ⅰ組、Ⅱ組穴位隔日交替施灸，每次每穴15 min，持續時間為2周。

1.4.4? 西藥組? IBS-D模型大鼠，正常喂養，并予匹維溴銨（10 mL/kg）灌胃，每日1次，持續時間為2周。

1.5? 指標檢測及標本采集

1.5.1? 一般行為學觀察? 觀察大鼠的精神狀態、飲食情況、皮膚毛發的順滑度以及活動狀態。

1.5.2? 內臟敏感性測試? 采用腹壁回撤反射（abdominal withdrawal reflex， AWR）評分為3時（腹部以及背腰部的肌肉群強烈收縮，腹部開始離開地表面）的注水量測定[15]。測試AWR評分之前，限制其食物攝入（不限制飲水），于大鼠清醒狀態下導尿管從肛門口往里插入大約8 cm，為方便進入，先用石蠟油將其潤滑，再將其與大鼠尾部相固定，以防止活動時脫出。接著將大鼠放入制備的透明度高的固定盒中以便觀察其活動情況，此固定盒的設置只允許大鼠前后走動，但限制其身體轉動，待其處于一個絕對的平靜期時開始注入水，注水的同時需密切觀察大鼠反應情況，并記錄AWR評分為3分的注水量，維持30 s，反復操作3次，每次操作間隔4 min，再取測量的均值。

1.5.3? 糞便含水量測定? 收集各組大鼠24 h糞便，用天平測定出的重量即為大便的濕重，接著將大便置于烘干箱干燥，即為糞便的干重。糞便的濕重減去糞便的干重所得的值，與大便濕重的比值則是糞便的含水量[16]。

1.5.4? 結腸組織形態病理觀察? 腹腔注射10%（3 mL/kg）水合氯醛麻醉，處死，取用生理鹽水洗滌腸內容物后，在8 cm結腸處取3片約1 cm×1 cm的樣品，并置于10%福爾馬林中24 h。然后常規脫水，石蠟包埋，HE染色，光學顯微鏡下觀察大鼠結腸黏膜病理組織學改變。

1.5.5? 酶聯免疫法檢測結腸5-HT的表達? 應用酶聯免疫法（euzyme linked immuno sorbrnt assay， ELISA）測定大鼠結腸中5-HT的含量，具體方法參照ELISA試劑盒說明書進行。測定前先分別提取大鼠結腸組織蛋白，用BCA法進行蛋白定量[17]。

1.5.6? WB檢測結腸5-HT3R的表達? 抽提30 μg組織蛋白樣品，BCA法將蛋白定量，將獲得的蛋白質樣品通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，并通過轉移電泳將凝膠上分離到的蛋白質轉印至固相支持物PVDF膜上，用抗靶蛋白的非標記抗體（一抗）與轉印后膜上的靶蛋白進行特異性結合，再與經辣根過氧化物酶標記（偶聯）的二抗結合，最后用ECL超敏發光液試劑檢測。

1.6? 統計學分析

采用SPSS 22.0軟件進行統計學處理。數據均采用“x±s”表示，多組間比較采用單因素方差分析，方差齊用LSD分析，方差不齊用Dunnet T3分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1? 各組大鼠一般行為學變化

實驗過程中，正常組大鼠精神狀態好，活潑好動，反應靈敏，皮毛有光澤;模型組大鼠精神萎靡，活動度差，反應遲緩，皮毛缺乏光澤;與模型組相比，溫和灸組、西藥組大鼠精神、活動度、皮毛光澤度等方面均有所改善。

2.2? 各組大鼠內臟敏感性、糞便含水量變化

與正常組相比，模型組大鼠的內臟敏感性增高（AWR評分為3分時的注水量降低）（P<0.01）;與模型組比較，溫和灸組、西藥組大鼠內臟敏感性降低（AWR評分為3分時的注水量升高）（P<0.01）。與正常組比較，模型組糞便含水量顯著增加（P<0.01）;與模型組比較，溫和灸組、西藥組大鼠糞便含水量顯著下降（P<0.01）。見表1。

2.3? 各組大鼠結腸病理切片檢測

各組大鼠結腸組織結構正常，黏膜上皮完整，無明顯充血水腫、潰瘍和炎癥細胞浸潤等病理組織學改變，這與IBS-D為一種功能性胃腸疾病有關，提示IBS-D為一種功能性胃腸道疾病。見圖1。

2.4? 各組大鼠結腸中5-HT及5-HT3R表達的變化

與正常組相比，模型組大鼠結腸的5-HT、5-HT3R含量升高（P<0.05，P<0.01）;與模型組相比，溫和灸組、西藥組大鼠結腸5-HT、5-HT3R含量下降（P<0.05，P<0.01）;與溫和灸組相比，西藥組大鼠結腸5-HT含量下降（P<0.01）。見表2。

3 討論

IBS-D屬于中醫學“腹痛”“泄瀉”等范疇[18]，其發病的根本原因主要為肝脾失調，肝木克脾土導致運化失調，病理產物以及代謝異常導致氣血運行不暢、經脈瘀堵，最終引起腹部不適以及大便性狀改變等臨床癥狀的發生[19]。本實驗通過束縛應激刺激以及乙酸灌腸復制肝郁脾虛模型，根據大鼠的情緒變化、糞便含水量以及內臟敏感性證實造模成功。研究表明[20-24]，中醫藥對IBS-D的治療效果顯著，本實驗基于疏肝健脾、利濕止瀉的治療原則，以及“合治內府”“俞募配穴”的配穴原則，選擇艾灸作為治療手段，選擇肝俞、脾俞、足三里、章門、期門諸穴進行治療，結果提示艾灸可以有效治療IBS-D。

腸道動力異常及內臟高敏感是IBS的主要病理學基礎[17]，5-HT作為自體活性物質，是一種參與胃腸道活動的腦腸肽，廣泛存在于中樞神經系統和胃腸道，具有許多生物學功能，如參與心理和神經功能的調節[25]。當機體受到刺激時，腸嗜鉻細胞分泌大量的5-HT，5-HT與腸黏膜上的5-HT受體相結合，即可引起腸道運動發生異常改變，導致腹痛、腹瀉等發生。唐紅梅等[26]采用母子分離聯合醋酸刺激和束縛應激成功制備IBS-D大鼠模型，檢測大鼠結腸組織中5-HT蛋白的表達，證實IBS-D大鼠結腸中5-HT含量的增高可導致腸道內臟高敏感，也會引起腹瀉。王迎寒等[27]研究顯示，降低大鼠5-HT含量可以達到改善IBS-D大鼠腹痛、腹瀉等癥狀。

在5-HT的諸多受體中，胃腸道感覺和運動關系最為密切的受體是5-HT3R，5-HT3R可同時調節興奮性和抑制性神經傳導物質的傳遞[28-29]。當5-HT與5-HT3R結合時，可以增加細胞內Ca2+濃度并刺激中樞和外周神經元的興奮性，促進神經遞質的釋放，引起乙酰膽堿增多，從而導致脘腹部疼痛不適以及內臟高敏感性等[30-31]。本實驗結果提示，較正常組相比，模型組大鼠結腸組織的5-HT與5-HT3R表達量升高（P<0.01，P<0.05），考慮是由于造模成功，大鼠結腸黏膜5-HT含量改變，并與5-HT3R相結合，二者共同作用導致大鼠情緒變化、腸道敏感以及腸道運動失常。此外，模型組大鼠一般情況、結腸病理的變化以及內臟敏感性、糞便含水量的變化均提示造模成功。與模型組相比，溫和灸組、西藥組均可以有效降低IBS-D大鼠內臟敏感性、糞便含水量、5-HT含量以及5-HT3R含量，差異均有統計學意義（P<0.05，P<0.01）。

綜上，基于艾灸可以有效治療IBS-D，以及5-HT及其受體在中樞系統和胃腸道系統中扮演的重要角色，考慮艾灸治療IBS-D的作用機制在于調節腦-腸軸通路上重要元件的表達，下一步研究可以增加艾灸對IBS-D大鼠腦內如下丘腦、海馬等組織中5-HT及受體表達的檢測。

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