玉米秸稈對雞糞厭氧發酵過程及酶活性的影響規律研究

王立闖，郝嬌，李延吉，馮磊，李旭

（1.沈陽光大環保科技股份有限公司，遼寧沈陽 110078；2.沈陽航空航天大學能源與環境學院，遼寧沈陽110136）

0 引言

隨著我國經濟和人民生活水平的不斷提高，人們對飲食的要求也日益提高，對農業生產中高品位商品的需求量逐漸增加，使得我國畜禽養殖業的規模不斷擴大。由于我國農業經濟結構的調整和產業化推進，畜禽養殖業逐漸向生產集約化、規模化方向發展，然而畜禽養殖業的發展對環境產生了巨大的影響。據統計，2016年我國的畜禽糞便產量達到了28.02億t[1]，[2]，但僅有部分畜禽糞便得到了有效處理，未經處理的畜禽糞便的排放量不斷增加，遠遠超過了生態環境的承載力，造成了嚴重的環境污染[3]。厭氧發酵技術是一種能夠實現畜禽糞便減量化、資源化和無害化的重要處理方式，厭氧發酵反應主要分為3個階段，即水解酸化階段、產氫產乙酸階段和產甲烷階段。有機物在水解酸化階段被水解酸化細菌群轉化為小分子有機物，然后經過產氫和產乙酸細菌群將小分子有機物轉化為揮發性脂肪酸等物質，最后再由產甲烷菌利用揮發性脂肪酸產生CH4。將雞糞進行厭氧發酵，不僅可以降低其對環境造成的污染，還可以產生清潔能源CH4，產生的沼渣還可以當作肥料，從而真正做到將雞糞轉變為生物質資源。但由于雞糞的C/N比較低，在單獨厭氧發酵過程中容易產生酸化現象，降低了厭氧發酵的反應效率，所以如何高效地利用雞糞進行厭氧發酵已成為科研人員研究的主要問題。

發酵底物的C/N是影響厭氧發酵過程的關鍵因素，對厭氧發酵的產酸具有重要影響[4]。劉和[5]研究污泥初始C/N對厭氧發酵產酸類型的影響時發現，C/N不同會形成不同的產酸代謝途徑，當C/N約為12時，形成的是乙酸型發酵；當C/N約為56時，形成的是丙酸型發酵；當C/N約為156時，形成的是丁酸型發酵。李海紅[6]利用PCRDGGE（聚合酶鏈式反應-變性梯度凝膠電泳）技術研究了不同原料發酵體系的微生物多樣性變化情況。羅娟[7]研究了不同混合比例的糞便與秸稈在厭氧消化過程中的膨脹特性，研究結果表明，干物質含量越高，膨脹系數越大。矯云陽[8]通過研究發現，稻草與糞便混合后的發酵啟動效果優于單獨糞便。

本研究以雞糞厭氧發酵工程化為目的，探究玉米秸稈的添加對雞糞厭氧發酵產生的影響，旨在提高厭氧發酵效率和產甲烷效率，縮短反應周期，為日后的工程化提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗所用新鮮雞糞取自北票市某肉食雞養雞場，所用玉米秸稈取自沈北新區周邊農村。玉米秸稈經過粉碎、研磨和篩選，使其粒徑處于60目以下。接種污泥取自沈陽北部污水處理廠的濃縮池，取回后馴化48 h。實驗原料及接種污泥的性質如表1所示。

表1 實驗原料及接種污泥的性質Table 1 Properties of experimental materials and inoculated sludge

1.2 實驗方法

序批式厭氧發酵反應裝置主要由恒溫水浴箱、厭氧消化反應器、沼氣收集設備、排水收集設備和連接導管組成（圖1）。各裝置相連接組成密封式反應裝置，其中厭氧消化反應器、沼氣收集設備和排水收集設備均由有效容積為1 L的廣口瓶構成，整個小型厭氧發酵反應系統的氣密性經過嚴格控制，以保證其厭氧環境。實驗初始向厭氧消化反應器中添加60 g實驗物料和200 mL接種污泥，并用去離子水定容到1 000 mL，發酵溫度控制在37±0.2℃。實驗設置純雞糞組和玉米秸稈添加組（玉米秸稈的VS占物料總VS的10%），各組實驗分別進行3次平行實驗，結果取3次實驗平均值。

圖1 序批式厭氧消化反應裝置Fig.1 Sequencing batch anaerobic digestion reaction device

1.3 檢測方法

采用排水法測量沼氣產量；利用PHB-4便攜式pH計測量pH值；采用重鉻酸鉀法測量COD濃度；采用納氏試劑分光光度法測量氨氮濃度；采用甲烷濃度分析儀檢測甲烷濃度；利用比色法測量揮發性脂肪酸（VFAs）濃度；采用rayto RT-6100酶標儀測定酶活。

2 結果與討論

2.1 累計產氣量/產甲烷量的Gompertz模型預測

修正的Gompertz模型[式（1）]能夠有效擬合出厭氧發酵過程中累計產氣量/產甲烷量（以單位質量的VS計）的變化。

式中：y為x時刻的累計產氣量/產甲烷量，mL/g；a為最終產氣量/產甲烷量，mL/g；Rm為最大產氣速率/產甲烷速率，mL/（g·d）；x為反應時間，d；λ為延滯期，d。

表2對比了純雞糞組和玉米秸稈添加組的實際產氣量/產甲烷量、預測產氣量/產甲烷量以及甲烷濃度的變化。

表2 預測產氣量/產甲烷量與實際值的對比Table 2 Comparison of predicted gas production/methane production with actual values

由表2可以看出：兩個實驗組的平均甲烷濃度均在55%以上，且玉米秸稈添加組的甲烷濃度要高于純雞糞組；兩個實驗組的實際產氣量/產甲烷量與預測產氣量/產甲烷量差別并不大，說明兩個實驗組的實際產氣量/產甲烷量均符合修正的Gompertz模型，可以利用此模型對日后的實際沼氣工程提供一定的理論指導。由表2還可以看出，玉米秸稈添加組的實際產氣量為340.70 mL/g，實際產甲烷量為208.25 mL/g，純雞糞組的實際產氣量為301.62 mL/g，實際產甲烷量為172.59 mL/g，少量秸稈的添加使玉米秸稈添加組的產氣量提高了12.96%，產甲烷量提高了20.66%，說明少量秸稈的添加能夠提高厭氧發酵的反應效率，提高產甲烷濃度。

2.2 pH值與VFAs濃度的變化情況

pH值與VFAs濃度均為厭氧發酵系統中的重要監測指標，可以通過其變化來判斷厭氧發酵過程的水解酸化速率、產甲烷菌降解效率以及反應系統運行的穩定程度并及時做出調控[9]，[10]。圖2反映了純雞糞組與玉米秸稈添加組pH值和VFAs濃度的變化趨勢。

圖2 不同實驗組的pH值與VFAs濃度的變化情況Fig.2 Changes of pH value and VFAs concentration in different experimental groups

從圖2可以看出，兩個實驗組的pH值均呈現出“下降-上升-平穩”的變化趨勢。這是因為，在反應初期，厭氧發酵系統處于水解酸化階段，雞糞中的大分子有機物在微生物分泌的胞外酶的作用下分解為單糖、氨基酸和揮發性脂肪酸等小分子有機物，并產生大量游離的H+，從而導致系統的pH值下降[11]；隨著實驗的進行，產甲烷菌逐漸適應了環境并大量繁殖，開始利用系統中游離的H+和VFAs合成CH4和CO2，使得系統的pH值逐漸上升并趨于穩定。從圖2還可以看出，兩個實驗組的VFAs濃度均呈現出先升高后下降的變化趨勢，與pH值的變化正好相反。這是因為，實驗初期主要發生水解酸化反應，此時產甲烷菌未能完全適應環境，產甲烷效率較低，對VFAs的利用率小于產氫產乙酸細菌群的產酸效率，從而導致發酵系統中的VFAs不斷積累，濃度不斷上升，與此同時，系統的pH值逐漸降低。隨著實驗的進行，純雞糞組和玉米秸稈添加組的VFAs濃度分別在第16天和第13天達到峰值，峰值分別為4.61，5.68 mg/mL。由此可以看出，少量玉米秸稈的添加能夠提高VFAs的產出速率，原因可能是C/N對厭氧發酵系統的影響符合一般的生物反應規律[11]，在適宜的C/N條件下，水解酸化細菌的活性會隨著C/N的升高而逐漸增強。隨著實驗的進行，系統的pH值逐漸升高，對應的VFAs濃度不斷降低并趨于穩定，這是因為隨著產甲烷菌的不斷增殖和富集，其對VFAs和H+的利用速率快速上升。在實驗后期，隨著系統pH值的升高，產甲烷菌對VFAs的利用效率與水解酸化細菌的產酸效率達到動態平衡，從而使系統的VFAs濃度逐漸趨于穩定。綜上可知，少量秸稈的添加能夠促進VFAs的產生并提高厭氧發酵的反應效率，縮短厭氧發酵的反應周期。

2.3 日產氣量與氨氮濃度的變化情況

在厭氧發酵過程中，氨氮主要以游離氨（NH3）和銨根離子（NH4+）的形式存在。在厭氧發酵過程中，適宜濃度的氨氮可以作為細胞所需的營養物質為菌群的生長提供能量，但是，如果氨氮濃度過高，氨氮就會通過被動運輸的形式進入微生物細胞膜中影響細胞內部質子和鉀離子的平衡，抑制厭氧微生物活性，阻礙酶的合成并抑制甲烷的產生，從而造成氨抑制現象[12]。

圖3反映了純雞糞組和玉米秸稈添加組的日產氣量和氨氮濃度的變化情況。從圖3可以看出：兩個實驗組的氨氮濃度均低于1 000 mg/L，不會對厭氧微生物造成較為明顯的拮抗作用[13]；在實驗初期，兩個實驗組的氨氮濃度均處于較低水平，隨著實驗的進行，系統水解產生氨氮的速率遠大于氨氮的消耗速率，使得系統中的氨氮濃度大幅上升，純雞糞組和玉米秸稈添加組的氨氮濃度分別在第16天和第13天達到峰值762.85，713.60 mg/L。從圖3還可以看出，氨氮濃度與日產氣量呈現出相反的變化趨勢。這是因為隨著產甲烷菌活性的逐漸增強和相對豐度的逐漸增加，產甲烷菌將消化液中的氨氮作為合成自身細胞的氮源，使得反應系統中的氨氮濃度逐漸下降，產甲烷量逐漸上升。純雞糞組和玉米秸稈添加組的日產氣量的變化趨勢大致相同，均為前兩天產氣較多，隨后由于污泥馴化時間較短以及整個反應系統的pH值較低，厭氧消化進入漫長的延滯期，產氣效果較差；隨著實驗的進行，微生物各菌群的活性逐漸恢復，產氣也有所恢復并在實驗后期達到穩定，此時氨氮的消耗速率大于產生速率。厭氧發酵系統中的氨氮濃度也是維持厭氧消化系統穩定運行的重要指標，將氨氮濃度控制在適宜的范圍內對提高厭氧消化效率和甲烷產率有著關鍵作用。

圖3 各實驗組的日產氣量與氨氮濃度的變化情況Fig.3 Changes of daily gas production and ammonia nitrogen concentration in each experimental group

2.4 COD濃度與酶活性的變化情況

COD濃度的變化直接反映了厭氧消化系統中溶解性有機物含量的變化，可根據COD濃度判斷厭氧消化反應器的運行狀態[14]，而水解酸化細菌分泌的胞外酶能夠進一步分解系統中的溶解性有機物，以供給自身細胞的生長代謝需求。因此，本文研究了純雞糞組和玉米秸稈添加組的COD濃度以及主要水解酶的活性變化情況，結果見圖4，5。由圖4可以看出，兩個實驗組的COD濃度均呈現出先上升后下降再略微上升的變化趨勢。這是因為實驗初始階段存在較長的延滯期，此時厭氧微生物對有機物的利用效率低于有機物的溶解效率，導致兩個實驗組的COD濃度均呈現出上升趨勢，在此之后，不同種類的水解細菌逐漸適應新環境而大量增殖，由此消耗大量的有機物，使兩個實驗組的COD濃度均呈現出下降趨勢。

圖4 純雞糞組和玉米秸稈添加組的COD濃度變化情況Fig.4 Changes of COD concentration in pure chicken manure group and straw addition group

由圖5可以看出：純雞糞組的纖維素酶和半纖維素酶的酶活性峰值分別為189.44 IU/mL和311.61 mIU/L，玉米秸稈添加組的纖維素酶和半纖維素酶的酶活性峰值分別為238.70 IU/mL和320.31 mIU/L；純雞糞組的蛋白酶和淀粉酶的酶活性峰值分別為106.81，277.00 IU/L，玉米秸稈添加組的蛋白酶和淀粉酶的酶活性峰值分別為111.03，318.73 IU/L。

圖5 純雞糞組和玉米秸稈添加組主要水解酶的活性變化情況Fig.5 Changes of main hydrolase activities in pure chicken manure group and straw addition group

由圖5還可以看出，在實驗前中期，玉米秸稈添加組中各水解細菌分泌的胞外酶的活性較高，各水解酶的酶活達到峰值的時間也較純雞糞組提前8～10 d，這是因為，與純雞糞組相比，玉米秸稈添加組的C/N較高，營養更豐富。這也說明少量玉米秸稈的添加有利于提高各水解酶的酶活，從而促進有機物的分解。在實驗后期，玉米秸稈添加組的蛋白酶和淀粉酶的酶活率先開始降低，說明玉米秸稈添加組的蛋白質和淀粉等有機物消耗殆盡，酶活性開始降低，由此也可以看出，玉米秸稈的添加縮短了厭氧發酵的反應周期，加快了厭氧發酵反應的啟動速度。整體來說，雞糞的C/N為9.765，不適于微生物的生長，而玉米秸稈的C/N為57.038，在雞糞的發酵過程中添加少量的玉米秸稈有助于調節C/N，調節微生物的營養結構，從而提高產氣效率，但玉米秸稈過多又會延長發酵周期，降低厭氧發酵的速率。所以少量玉米秸稈的添加會促進不同種類酶活性的提高，適當提高C/N，能夠有效促進雞糞的厭氧發酵，提高厭氧發酵效率。

3 結論

①玉米秸稈添加組的實際產氣量為340.70 mL/g，實際產甲烷量為208.25 mL/g；純雞糞組的實際產氣量為301.62 mL/g，實際產甲烷量為172.59 mL/g；與純雞糞組相比，玉米秸稈添加組的產氣量提高了12.96%，產甲烷量提高了20.66%；兩個實驗組的實際產氣量/產甲烷量均符合修正的Gompertz模型。

②純雞糞組和玉米秸稈添加組的VFAs濃度分別在第16天和第13天達到峰值，峰值分別為4.61，5.68 mg/mL，少量玉米秸稈的添加能夠提高VFAs的產出速率；氨氮濃度與日產氣量呈現出相反的變化趨勢，兩個實驗組的氨氮濃度均低于1 000 mg/L，不會對厭氧微生物造成較為明顯的拮抗作用。

③純雞糞組的纖維素酶、半纖維素酶、蛋白酶和淀粉酶的酶活最大值分別為189.44 IU/mL，311.61 mIU/L，106.81 IU/L和277.00 IU/L；玉米秸稈添加組的纖維素酶、半纖維素酶、蛋白酶和淀粉酶的酶活最大值分別為238.70 IU/mL，320.31 mIU/L，111.03 IU/L和318.73 IU/L，少量玉米秸稈的添加有利于提高各水解酶的酶活，從而促進有機物的分解。