紫花苜蓿CCoAOMT 基因家族的鑒定、進化及表達分析

馬倩，閆啟，張正社，吳凡，張吉宇

（蘭州大學草地農業生態系統國家重點實驗室，蘭州大學農業農村部草牧業創新重點實驗室，蘭州大學草地農業教育部工程研究中心，蘭州大學草地農業科技學院，甘肅 蘭州730020）

畜牧業的可持續發展離不開優質飼料資源的供給。享有“牧草之王”贊譽的豆科（Leguminosae）牧草——紫花苜蓿（Medicago sativa），莖葉中富含營養物質，粗蛋白含量高是其成為畜牧業發展中重要蛋白飼料的原因［1］。它可制作成青貯飼料，又可以收割制作成優質干草，是目前世界上栽培最廣泛的一種豆科牧草［2］。木質素是一種苯基丙烷絡合物，紫花苜蓿主要包含S 和G 型木質素，是構成紫花苜蓿細胞壁的主要成分，使其有一定的機械強度［3］。然而，紫花苜蓿中的高木質素含量直接影響牲畜的消化和吸收，給畜牧業生產帶來負面影響。培育低木質素紫花苜蓿可以有效地提高其消化率，相應地提高動物的生產性能，促進畜牧業可持續發展。

目前，降低木質素含量主要是通過下調表達木質素生物合成途徑中的某種或多種關鍵酶基因，從而顯著降低轉基因植物中的木質素合成效率［4?6］。木質素生物合成途徑大致分為3 種——莽草酸途徑、苯丙烷途徑和木質素的特異合成途徑。咖啡酰輔酶A 氧甲基轉移酶（caffeoyl CoAO-methyltransferase，CCoAOMT）是苯丙烷途徑中調控G 木質素合成的關鍵酶之一［7?9］。CCoAOMT基因首先在歐芹（Petroselinum crispum）中克隆到［10］，隨后被證實參與木質素的生物合成［11］。對擬南芥（Arabidopsis thaliana）中的CCoAOMT進行突變，通過分析木質素的含量表明，突變體植株中的木質素含量比野生型明顯減少，且G 木質素的含量也相對下降［12］。反義CCoAOMT基因調控的轉基因煙草（Nicotiana tabacum）與野生型對照相比，木質素平均含量降低了16. 8%，并且植株表型正常［13］。在煙草中下調CCoAOMT基因的表達，使轉基因植物的木質素含量明顯下降，木質素S/G 的比例增加且植株矮化［14］。在CCoAOMT反義抑制的轉基因苜蓿中也發現類似研究結果［15］。劉惠榮等［16］通過農桿菌介導法將毛白楊（Populus tomentosa）CCoAOMTcDNA 反向導入煙草抑制CCoAOMT表達，使轉基因植物的木質素含量明顯下降。利用RNAi 對玉米（Zea mays）和丹參（Salvia miltiorrhiza）的CCoAOMT下調后導致木質素含量顯著降低［17?18］。另一方面，能源作物中過表達CCoAOMT基因，可以增加其木質素的生物合成，提高生物量［19］。與木質素合成的其他相關酶類情形類似，CCoAOMT基因也存在著多基因家族現象，在擬南芥［20］、煙草［21］和水稻（Oryza sativa）［22］等植物中均有報道。盡管在一些其他植物中已經鑒定分析了CCoAOMT基因家族，但紫花苜蓿CCoAOMT基因家族的鑒定分析研究尚未見報道。

本研究利用生物信息學手段，從基因組水平對紫花苜蓿CCoAOMT（簡稱MsCCoAOMT）基因家族的理化性質、結構特征、進化關系、染色體定位等進行系統分析。并采用qRT?PCR 技術檢測在不同生長發育階段該家族基因在不同組織中的表達情況。本研究對低木質素紫花苜蓿新品種選育具有重要意義。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

紫花苜蓿‘中苜一號’種子保存于蘭州大學草地農業科技學院，以蛭石作為培養基質，于2019 年10 月盆栽培養置于培養室內，保持基質濕潤。試驗過程中，每隔15 d 澆一次霍格蘭氏營養液（每次澆1 L），防止苜蓿生長營養不良。在相同栽培管理條件下，分別在幼苗期、營養期和開花期進行取樣，取樣部位為葉、莖和花，每個樣3 次重復，所采鮮樣液氮速凍后于?80 ℃超低溫冰箱保存。樣品收集完成后使用UNIQ-10 柱式Trizol 總RNA 抽提試劑盒（生工生物工程股份有限公司，上海）提取總RNA，使用TIANScript II RT Kit（天根生化科技有限公司，北京）反轉錄成cDNA，用于基因表達分析。

1. 2 MsCCoAOMT 基因的鑒定

從Phytozome12（https：//phytozome. jgi. doe. gov/pz/portal. html）獲得水稻和擬南芥CCoAOMT 蛋白和基因序列。 紫花苜蓿基因組序列、CDS 序列、蛋白質序列均下載自https：//figshare. com/projects/whole_genome_sequencing_and_assembly_of_Medicago_sativa/66380［23］。 以水稻和擬南芥CCoAOMT序列作為查詢序列，利用BLAST 鑒定紫花苜蓿基因組中的候選CCoAOMT基因。然后，利用Pfam（http：//pfam. xfam. org/）和SMART網站（http：//smart. embl-heidelberg. de/）將上一步所得序列進行結構預測，剔除不含CCoAOMT 蛋白典型結構域的序列，剩余的蛋白序列視為MsCCoAOMT 家族成員。

1. 3 蛋白質的理化性質及染色體定位分析

利用ExPaSy 蛋白質服務器（https：//web. expasy. org/protparam/）分析MsCCoAOMT 氨基酸殘基、親水性總平均值、等電點和分子量。WoLF PSORT（https：//wolfpsort. hgc. jp/）用于預測MsCCoAOMT 蛋白的亞細胞位置。提取所有MsCCoAOMT基因在紫花苜蓿基因組中的位置信息，利用在線工具MapGene2Choromosome v2（http：//mg2c. iask. in/mg2c_v2. 0/）將MsCCoAOMT基因定位到對應染色體上。

1. 4 基因結構、保守基序和啟動子元件分析

利用在線工具GSDS 2. 0（http：//gsds. cbi. pku. edu. cn/）分析MsCCoAOMT家族基因結構。蛋白保守結構域由MEME（http：//meme-suite. org/tools/meme；最佳寬度在6～50 之間）預測，最大基序數為10。啟動子元件分析利用在線工具PlantCARE（http：//bioinformatics. psb. ugent. be/webtools/plantcare/html/）完成。

1. 5 系統發育分類分析

利用MEGA 7（http：//www. megasoftware. net）軟件通過鄰接法（neighbor-joining，NJ）構建系統進化樹，包括4 個物種，分別為紫花苜蓿，水稻，蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）和擬南芥，遺傳距離為泊松距離（poisson correction），校驗參數Bootstrap 重復1000 次，其他參數使用系統默認值。

1. 6 MsCCoAOMT 基因家族的表達分析

從數據庫Alfalfa Breeder’s Toolbox（https：//www. alfalfatoolbox. org/）下載紫花苜蓿的轉錄組（RNA-seq）數據。利用BLAST 比對獲取鑒定的MsCCoAOMT基因同源轉錄組序列，進而獲取MsCCoAOMT基因在不同組織中的表達量，熱圖利用OmicShare 在線數據分析平臺（http：//www. omicshare. com/）繪制。

采用qRT?PCR 分析MsCCoAOMT家族11 個基因在紫花苜蓿幼苗期、營養期莖和葉以及花期莖、葉和花中的表達模式。使用軟件PerlPrimer 設計定量引物（序列見表1），擴增片段在100～200 bp 左右，使用2X SG Fast qPCR Master Mix 試劑盒（生工生物工程股份有限公司，上海），使用儀器為伯樂CFX96（BIO-RAD，美國）。選用紫花苜蓿Actin基因（AA660796）為內參［24］，反應程序為：95 ℃30 s；95 ℃5 s，60 ℃30 s，共40 個循環。采用2?ΔΔCT法計算各基因的相對表達量［25］。試驗設置3 次生物學重復。

表1 qRT-PCR 引物信息Table 1 Primers used for qRT-PCR analysis

2 結果與分析

2. 1 MsCCoAOMT 基因家族的鑒定

44 個預測的MsCCoAOMT基因從紫花苜蓿基因組中被鑒定出來，根據它們在染色體上的分布情況，命名為MsCCoAOMT1至MsCCoAOMT44。 除MsCCoAOMT44 含有2 個結構保守域UDP-glucoronosyl and UDPglucosyl transferase 和O-methyltransferase（PF01596. 17），其余MsCCoAOMT 只有O-methyltransferase 一個結構域。此外，還分析了MsCCoAOMT 的氨基酸長度、親水性的總平均值、等電點、分子量和基因序列長度（表2）。結果表明，序列最長的MsCCoAOMT 蛋白（MsCCoAOMT24）包含568 個氨基酸殘基，其余43 條序列的氨基酸殘基數目均在200 個左右；MsCCoAOMTs基因序列長度差異較大，其中MsCCoAOMT4基因序列最長（7396 bp），MsCCoAOMT1次之（5315 bp），基因序列長度在3000～4500 bp 之間的MsCCoAOMT共計12 個，2000～3000 bp 之間的MsCCoAOMT共計11 個，其余MsCCoAOMT基因序列長度在2000 bp 以下；MsCCoAOMT24 預測分子量63. 5 kDa，其余蛋白均在40 kDa 以內；蛋白質理論等電點介于4. 89（MsCCoAOMT24）和8. 58（MsCCoAOMT2/3/4）之間。除了3 個MsCCoAOMT 蛋白（MsCCoAOMT5、MsCCoAOMT8 和MsCCoAOMT32）外，其余MsCCoAOMT 蛋白疏水性指數（GRAVY）均小于0，表明這些均為親水性蛋白。亞細胞定位預測結果表明，33 個MsCCoAOMT 蛋白定位于細胞質，11 個定位于葉綠體。同時，與模式植物擬南芥CCoAOMT基因進行同源比對，得到其在擬南芥中的同源基因及基因名稱（表2）。

表2 紫花苜蓿CCoAOMT 基因家族信息Table 2 The information of CCoAOMT gene family in M. sativa

2. 2 染色體定位分析

MsCCoAOMT家族成員分布于紫花苜蓿的16 條染色體上，呈現不均勻性分布（圖1）。其中chr 4. 3、chr 8. 1和chr 8. 4 染色體上均有6 個MsCCoAOMT基因，chr 8. 2 和chr 8. 3 染色體上均有5 個MsCCoAOMT基因，chr 4. 1 染色體上有2 個MsCCoAOMT基因，chr 4. 2 和chr 4. 4 染色體上均有3 個MsCCoAOMT基因，chr 2. 1、chr 2. 2、chr 2. 3、chr 2. 4、chr 6. 1、chr 6. 2、chr 6. 3 和chr 6. 4 染色體上均有1 個MsCCoAOMT基因。 另外，MsCCoAOMT基因存在明顯的串聯重復現象，并在染色體上呈現6 個串聯重復基因簇。其中，MsCCoAOMT23、MsCCoAOMT24、MsCCoAOMT25、MsCCoAOMT26和MsCCoAOMT27在chr 8. 1 染色體上形成一個較大的串聯重復基因簇；MsCCoAOMT39、MsCCoAOMT40、MsCCoAOMT41、MsCCoAOMT42和MsCCoAOMT43在chr 8. 4 染色體上形成一個較大的串聯重復基因簇。

圖1 紫花苜蓿CCoAOMT 基因的染色體定位Fig. 1 Location of MsCCoAOMT genes on chromosome

2. 3 MsCCoAOMT 基因家族蛋白結構域及基因結構分析

為了進一步研究不同MsCCoAOMT 蛋白中基序的相似性和多樣性，利用MEME 軟件進行蛋白結構域預測。結果表明，MsCCoAOMT 蛋白結構比較保守，共鑒定到了10 個比較保守的motif（分別命名為Motif1～10），其中Motif1、Motif2、Motif4 和Motif5 最為保守，是各組共有基序（圖2a）。除共有基序外，各組基序還具有一定特異性，如Motif6 和Motif10 僅在D 亞組中存在，Motif7 和Motif9 只在C 和D 亞組中存在，此類motif 可能與CCoAOMT基因功能的多樣性有關。

為明確MsCCoAOMT基因結構，根據紫花苜蓿基因組信息獲取了每一個MsCCoAOMT基因的基因組序列和CDS 序列信息并繪制外顯子?內含子結構圖（圖2b），結果表明MsCCoAOMT家族各成員外顯子和內含子數目相對保守，大部分MsCCoAOMT基因（82%）都含有5 個外顯子和4 個內含子。 說明4 個內含子是MsCCoAOMT基因主要結構形式。

圖2 紫花苜蓿CCoAOMT 基因家族的保守基序及基因結構分析Fig. 2 Analysis of conserved motifs and gene structure of the MsCCoAOMT gene family

2. 4 MsCCoAOMT 基因啟動子順式作用元件分析

為了探討MsCCoAOMT基因在脅迫應答和發育過程中的作用機制，使用PlantCARE 在線工具分析MsCCoAOMT基因的2000 bp 上游啟動子序列。 發現其啟動子含有基本的順式作用元件，如CAAT-box、TATA-box（表3）。此外還有與光響應、激素響應、生長發育調節、脅迫響應等相關的作用元件（表3）。說明這些基因不僅參與木質素的生物合成，可能還在紫花苜蓿的生物及非生物脅迫中具有重要作用。

表3 啟動子序列順式作用元件分析Table 3 Analysis of promoter sequence cis-acting

續表Continued Table

2. 5 MsCCoAOMT 家族成員系統進化分析

為了確定MsCCoAOMT 和其他模式植物CCoAOMT 的進化關系，利用來自4 種植物物種的59 個CCoAOMT（紫花苜蓿44 個，擬南芥7 個，水稻和蒺藜苜蓿各4 個）構建系統進化樹（圖3）。 結果表明，44 個MsCCoAOMT 可以分為5 個亞家族，命名為亞家族A 至E（圖3），同一亞族內成員親緣關系較近，分別包含6，18，4，4，12 個MsCCoAOMT成員。其中MsCCoAOMT1、MsCCoAOMT2、MsCCoAOMT3和MsCCoAOMT4基因與蒺藜苜蓿Medtr2g070410. 1被歸為一類；MsCCoAOMT8、MsCCoAOMT9、MsCCoAOMT11和MsCCoAOMT17基因與蒺藜苜蓿Medtr4g094368. 1被歸為一類。相比于蒺藜苜蓿，紫花苜蓿含有數目較大的CCoAOMT基因家族，說明其木質素合成較蒺藜苜蓿復雜。這也說明MsCCoAOMT基因在植物中保守性較強，可以通過擬南芥的分類信息鑒定MsCCoAOMT基因家族的分類情況。

圖3 紫花苜蓿CCoAOMT 基因家族系統進化樹Fig. 3 The phylogenetic tree of the MsCCoAOMT gene family

2. 6 MsCCoAOMT 基因家族的表達分析

利用紫花苜蓿的RNA-seq 數據，分析得到MsCCoAOMT基因家族成員在6 種組織中的表達譜（圖4）。表達譜中用藍?白?紅3 色代表基因表達的強度，紅色越亮代表信號越強，藍色越亮代表信號越弱，白色代表中間水平。 結果顯示，每個MsCCoAOMT基因至少在一個組織中顯示高表達水平。 其中MsCCoAOMT23、MsCCoAOMT24、MsCCoAOMT25、MsCCoAOMT26、MsCCoAOMT29、MsCCoAOMT30、MsCCoAOMT31、MsCCoAOMT34、MsCCoAOMT35、MsCCoAOMT36、MsCCoAOMT39、MsCCoAOMT40和MsCCoAOMT41主要在根中表達；MsCCoAOMT1、MsCCoAOMT2、MsCCoAOMT3、MsCCoAOMT4、MsCCoAOMT8、MsCCoAOMT9、MsCCoAOMT11和MsCCoAOMT17在根瘤中特異性表達；MsCCoAOMT6、MsCCoAOMT12、MsCCoAOMT13、MsCCoAOMT14、MsCCoAOMT15 與MsCCoAOMT18 主要在莖中表達；MsCCoAOMT5、MsCCoAOMT7、MsCCoAOMT10、MsCCoAOMT16、MsCCoAOMT19、MsCCoAOMT20、MsCCoAOMT21、MsCCoAOMT22、MsCCoAOMT27、MsCCoAOMT32、MsCCoAOMT37、MsCCoAOMT42 和MsCCoAOMT43 在葉中表達量高；MsCCoAOMT28、MsCCoAOMT33、MsCCoAOMT38 和MsCCoAOMT44 在花中特異性表達。

圖4 紫花苜蓿CCoAOMT 基因表達模式Fig. 4 The expression profile of the MsCCoAOMT genes

利用qRT?PCR 分析發現，MsCCoAOMT1、MsCCoAOMT10、MsCCoAOMT12、MsCCoAOMT17、MsCCoAOMT21、MsCCoAOMT23、MsCCoAOMT25、MsCCoAOMT32、MsCCoAOMT41、MsCCoAOMT43和MsCCoAOMT44在紫花苜蓿不同生長發育時期的不同組織中均有表達。其中，MsCCoAOMT1在幼苗期和營養期各組織中相對表達量較高；MsCCoAOMT10、MsCCoAOMT32、MsCCoAOMT41和MsCCoAOMT43在花期葉片中表達量最高；MsCCoAOMT12在花期莖中相對高表達；MsCCoAOMT17在花期花和葉片中相對高表達；MsCCoAOMT21在幼苗期葉片中表達量最高；MsCCoAOMT23和MsCCoAOMT25在營養期莖中表達量最高；MsCCoAOMT44僅在紫花苜蓿開花期花中高表達（圖5）。

圖5 不同生長發育階段紫花苜蓿‘中苜1 號’不同組織中MsCCoAOMT 基因相對表達量Fig. 5 Relative expression of MsCCoAOMT gene in different tissues of M. sativa‘Zhongmu No. 1’at different growth and development stages

3 討論

加強飼草飼料行業管理，改善牧草飼料品質和產量，是我國畜牧業振興與發展的方向。我國甘肅、內蒙古、陜西等地是苜蓿主要種植區，其中甘肅省的苜蓿種植面積居于全國第1，已達到66. 27 萬hm2。內蒙古以59. 2 萬hm2位居于全國第2 位。目前，雖然國內苜蓿的產量和品質已經有所提高，但是與美國等畜牧業發達國家還是一直存在很大的差距，導致我國優質的苜蓿始終處于完全依賴國外進口的尷尬狀態。木質素為紫花苜蓿生長發育所必須，但是其含量過高會降低紫花苜蓿品質，研究表明，苜蓿干物質的消化率與木質素的含量極顯著負相關［26］。因為植物木質素和纖維素的含量直接影響蛋白質的利用率。木質素合成過程十分復雜，涉及許多酶。主要有苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonialyase，PAL）、香豆酰輔酶A 連接酶（4-coumarate：CoA ligase，4CL）、咖啡酰輔酶A 氧甲基轉移酶、肉桂酸-4- 羧化酶（cinnamate-4-hydroxylase，C4H）、香豆酸-3- 羧化酶（p-coumarate-3-hydroxylase，C3H）、阿魏酸-5-羧化酶（ferulate-5-hydroxylase，F5H）、香豆酰CoA-3-羧化酶（coumaroyl-CoA-3-hydroxylase，CCH）、肉桂酰輔酶A 還原酶（cinnamoyl-CoA reductase，CCR）、咖啡酸-3-O-甲基轉移酶（caffeic acid-3-O-methyltransferase，COMT）、肉桂酰乙醇脫氫酶（cinnamoyl alcohol dehydrogenase，CAD）等［27?29］。

咖啡酰輔酶A 氧甲基轉移酶（CCoAOMT）催化咖啡酰輔酶A（caffeoyl-CoA）生成阿魏酰輔酶A（feruloyl-CoA），在木質素生物合成中發揮重要作用。本研究采用生物信息學的方法對紫花苜蓿全基因組數據庫進行檢索，共鑒定出了44 個MsCCoAOMT家族基因。蛋白質的結構決定其功能，基因結構的差異可能引起蛋白質結合構象的改變，因此對基因功能有巨大的影響。通常含有多個內含子的基因一般比較保守，而不含有內含子的基因保守性較差。基因結構分析表明MsCCoAOMT基因最少由3 個外顯子和2 個內含子組成，大部分由5 個外顯子和4 個內含子組成，表明MsCCoAOMT家族結構較為保守。同樣的，在水稻中，CCoAOMT基因類似地作為基因家族存在，表現出高度的序列保守性［22］。 MsCCoAOMT 蛋白結構分析表明，Motif1 和Motif2 出現在MsCCoAOMT 蛋白中的頻率最高，不同亞組MsCCoAOMT 蛋白保守基序有差異，同一亞組內有更多相似的基序。這些基因內部的差異可能會影響它們的功能。紫花苜蓿是優質的豆科牧草，在世界上具有廣闊的發展前景，目前利用轉基因技術在提高其品質方面取得了相關進展［30］。延遲牧草開花，降低木質素水平，以增加飼料產量，提高牧草質量，是未來牧草育種的主要方向［31］。研究表明，抑制CCoAOMT 活性能有效降低毛白楊木質素含量，但對植物生長發育及其機械運輸系統無明顯影響［32］。可見，利用遺傳工程手段對植物中CCoAOMT基因進行調節，在不影響植物正常生長的條件下，結合研究目標對木質素含量和質量進行調控具有重要意義。qRT?PCR檢測結果表明：MsCCoAOMT基因的表達存在明顯的組織特異性，在不同的生長發育時期其相對表達量也存在明顯差異，在紫花苜蓿不同生長發育時期持續高表達和開花期相對表達量顯著提高的MsCCoAOMT基因可能與紫花苜蓿收獲期木質素含量升高、葉片和莖稈老化有關，可以用來調控木質素含量和牧草質量。

4 結論

本研究對紫花苜蓿CCoAOMT基因家族進行分析，共鑒定了44 個MsCCoAOMT家族基因，預測33 個MsCCoAOMT 蛋白定位于細胞質，11 個定位于葉綠體。系統進化樹分析表明其分布在5 個進化枝，與蒺藜苜蓿、擬南芥、水稻的CCoAOMT基因有很高的相似性。qRT?PCR 分析表明，MsCCoAOMT家族11 個基因在紫花苜蓿幼苗期、營養期莖和葉以及花期莖、葉和花中均有表達，但存在明顯的組織特異性。本研究對紫花苜蓿木質素含量的分子調控研究具有參考價值。