蒺藜苜蓿GPAT 基因家族的全基因組鑒定、序列變異和表達分析

楊成蘭，段瑞君，武雄雄，祁存英，馬銀花，熊輝巖

（1. 青海大學生態環境工程學院，青海 西寧 810016；2. 青海大學農牧學院，青海 西寧 810016）

甘油脂類是細胞膜、種子貯藏油和表皮角質層蠟質的主要成分，在與植物生長發育相關的基本細胞代謝和抗逆性中發揮重要作用[1]。甘油-3-磷酸酰基轉移酶(glycerol-3-phosphate acyltransferase, GPAT)是甘油脂類代謝中催化酰基從酰基輔酶A (acyl coenzyme A, acyl-CoA)或酰基載體蛋白 (acyl-carrierprotein, acyl-ACP)轉移到甘油-3-磷酸(glycerin-3-phosphate, G3P)的sn-1 或sn-2 位 生 成 溶 血 磷 脂酸(lysophosphatidic acid, LPA)的重要酶類[2]。陸生植物GPAT 亦可利用ω-氧化脂酰基-CoA 或超長鏈脂酰基-CoA 作為酰基供體催化G3P 的sn-2 脂酰基化反應而形成sn-2 溶血磷脂酸(LPA) 或sn-2 單脂酰甘油(monoacylglycerol, MAG)，為角質層角質和軟木脂聚酯合成提供單體構件[3]。由于角質層和軟木脂與植物抗逆性直接相關，因此GPAT 在植物抗逆方面十分重要。

GPATs 在許多植物中均有表達，在質體、內質網和線粒體3 種不同的亞細胞中均能觀察到GPATs的活性。質體GPAT 是可溶的，以酰基ACP 為底物，而位于內質網和線粒體上的GPAT 是膜結合的，以acyl-CoA 和acyl-ACP 為天然的酰基供體，主要參與角質、軟木脂和貯藏脂質的合成[4-5]。在擬南芥(Arabidopsis thaliana)中，GPAT基因家族的成員因其在受精、種子發育、脅迫耐受和角質或亞角質生成中的作用而被廣泛研究[6-8]。除此之外，GPATs也在各種作物中進行了研究，包括向日葵(Helianthus annuus)[9]、水稻(Oryza sativa)[10]、番茄(Lycopersicon esculentum)[11]、玉米(Zea mays)[12]以及甘藍型油菜(Brassica napus)[2]。

鹽堿脅迫作為植物非生物脅迫的重要限制因子，導致土地鹽漬化，嚴重限制了植物的正常生長[13]，從而影響了農牧業的可持續發展。目前，土地鹽堿化已經成為一個世界性的環境問題，我國鹽堿地主要分布在東北、華北、西北及沿海地區，鹽堿地總面積約1 億hm2[13]。青海省海西柴達木地區由于氣候極端干燥，降雨少，蒸發量大，鹽離子濃度不斷升高，形成大面積鹽堿土，從而植被稀少，生態環境脆弱[14]。紫花苜蓿(Medicago sativa)因其蛋白含量豐富被稱為“牧草之王”，可作為優質牧草使用，廣泛分布在我國華北、西北和東北等地區，目前已在青海省開展推廣種植。但鹽堿化成為了制約紫花苜蓿推廣的關鍵因素之一。已有研究闡述了紫花苜蓿的抗鹽堿機制[15]，但絕大多數均是從生化角度分析，對其抗鹽堿機理的更深層的研究還不多。

蒺藜苜蓿(M. truncatula)作為豆科模式植物代表，具有基因組小、生長周期短、遺傳轉化體系成熟等特點，可以較好地開展基因功能研究，目前蒺藜苜蓿測序也已完成，可以為紫花苜蓿等近緣種研究提供指導。因此，本研究選用蒺藜苜蓿進行GPAT基因家族的全基因組比較分析，包括系統發育、基因結構和基因表達分析，從而為進一步開展GPAT基因在紫花苜蓿鹽脅迫中的功能研究提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 GPAT 基因家族成員的序列檢索與鑒定

從 Ensembl (http://plants.ensembl.org/index.html)數據庫中下載蒺藜苜蓿基因組測序數據。以擬南芥的GPAT 蛋白序列為基礎，采用BLASTp 和HMM (E= 0.000 01)兩種方法搜索了蒺藜苜蓿的GPAT候選基因。隨后采用Pfam (http://pfam.sanger.ac.uk/)、NCBI CDD (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/)和SMART(http://smart.emblheidelberg.de/)應用數據庫確認GPAT家族的每個候選成員是否具有Pfam 的PlsC酰基轉移酶結構域(PF01553)。利用在線ExPASy(http://web.expasy.org/)工具預測GPAT 蛋白的理論分子量(molecular weight, MW)和等電點(isoelectric point, pI)，并 使 用 在 線Plant-PLoc server (http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/)服務器預測亞細胞定位。

1.2 系統發育結構

使用MEGA 7 軟件中的ClustalW 程序進行執行默認參數的多序列比對，然后進行手動比較和細化。采用鄰域連接(Neighbor-Joining, NJ)方法構建不同的系統發育樹，參數采用成對刪除選項、泊松修正模型和均勻率。Bootstrap 檢驗設定1000 次重復，以評價系統發育樹的統計可靠性。此外，在系統發育樹的構建中還應用了極大似然法，以驗證與NJ 法的一致性。

1.3 染色體定位

根據基因組注釋文件中提供的位置信息，將所有蒺藜苜蓿GPAT基因定位到相應的染色體上。Mapchartv 2.2 軟件用于繪制苜蓿GPAT基因的染色體定位圖，利用AI 工具對其進行美化。

1.4 基因結構和保守基序分析

使用GSDS (http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)在線預測GPAT基因結構；使用MEME (http://memesuite.org/tools/meme)工具預測該基因的保守基序位置。最后用TBtools v1.0983 軟件進行可視化。

1.5 mtGPAT 家族基因的表達分析

在基因芯片表達數據庫(https://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/)中分別下載蒺藜苜蓿的不同組織表達數據(E-MEXP-1097)和200 mmol·L?1鹽脅迫下的基因表達數據(E-GEOD-13907)。在蒺藜苜蓿基因表達圖譜服務器(http://mtgea.noble.org/v2/) 中找出mtGPAT各基因的探針編號，根據各基因的探針編號找出對應的表達量，取log2 值在TBtools v1.0983 軟件上作圖。

2 結果與分析

2.1 蒺藜苜蓿GPAT 基因的鑒定、注釋和染色體定位

通過hmm search 查找GPAT 結構域隱馬爾可夫模型、擬南芥GPAT 蛋白同源比對以及Pfam 檢查保守結構域的方式，從蒺藜苜蓿基因組(https://genome.jgi.doe.gov/)中鑒定出24 個GPAT 家族蛋白，按其在染色體上的位置依次命名(mtGPAT1－mtGPAT24)(表1)。使用ExPASy 工具對這24 個蛋白的分子量、等電點等性質進行分析統計。結果表明：GPAT基因編碼的蛋白質氨基酸長度在282 (AET03510)～568(AES60108) aa。除了KEH33585 和AES95759 蛋白的等電點較低(7.17 和7.14)之外，其余22 個蛋白的等電點均集中在8.16～10.35，因此，mtGPAT基因大都屬于堿性氨基酸。mtGPAT 蛋白的亞細胞定位結果表明，它們大部分均定位在內質網、線粒體和葉綠體中，AES67682和KEH19006兩個基因在細胞膜上也有分布，表明這兩個基因很可能具有其他的生物學功能。

表1 蒺藜苜蓿mtGPAT 基因家族的鑒定及特性研究Table 1 Identification and characteristics of the mtGPAT gene family in Medicago truncatula

2.2 蒺藜苜蓿GPAT 基因家族的系統進化

為分析24 個蒺藜苜蓿mtGPAT基因的進化關系，以及這些基因與10 個功能已被深入闡明的擬南芥AtGPAT基因間的同源關系，利用MEGA 7 軟件選用鄰域連接(NJ)法構建系統發育樹(圖1)。結果表明：24 個蒺藜苜蓿mtGPAT基因可以分成3 個(Group 1、Group 2、Group 3)亞家族，分別含有10、4、10 個GPAT基因家族成員。這與其他植物上的分類相同，擬南芥中也將10 個GPAT基因分成3 個亞家族(AtGPAT1－AtGPAT8、AtGPAT9和AtS1) ， 其中AtS1是質體型GPAT，AtS1缺失會伴隨著植物生長延遲和種子發育中止，蒺藜苜蓿GPAT 蛋白成員有10 個屬于這一亞家族。AtGPAT9 可能是一種功能酶，在植物膜和貯藏脂質生物合成中起著重要作用，這一亞族有4個mtGPAT基因。AtGPAT1－AtGPAT8均可能具有sn-2 酰基轉移活性，可以為角質和軟木脂聚酯合成提供單體構件，由于角質層和軟木脂與植物抗逆性直接相關，因此有10 個mtGPAT會直接參與蒺藜苜蓿的抗逆過程。

圖1 蒺藜苜蓿GPAT 基因家族系統進化分析Figure 1 Phylogenetic analysis of the GPAT gene family in Medicago truncatula

2.3 蒺藜苜蓿GPAT 基因家族染色體定位

mtGPAT基因的分布由其染色體位置決定，24 個mtGPAT基因被定位到蒺藜苜蓿的7 條染色體上，且這24 個基因均不存在成簇現象(圖2)。除chr1、chr5 和chr7 號染色體上分布有4～5 個基因外，其余所有染色體上均分布有2 或3 個mtGPAT基因，表明它們總體上較為一致，分布較為松散。

圖2 蒺藜苜蓿mtGPAT 基因的染色體分布Figure 2 Chromosomal distribution of mtGPAT genes in Medicago truncatula

2.4 蒺藜苜蓿GPAT 基因家族成員保守基序和基因結構分析

為進一步了解mtGPAT 蛋白的分類與結構之間的關系，本研究預測了mtGPAT 蛋白的保守基序和基因結構。結果(圖3) 表明：24 個mtGPAT 成員大致分成了3 簇 (Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)，同一亞家族似乎具有相似的基序，保守基序Motif 4、Motif 8 和Motif 17編碼PlsC acyltransferase 結構域。Ⅰ簇共有的PlsC acyltransferase 結構域保守基序為Motif 4，基因結構相對簡單，僅有1～3 個外顯子；Ⅱ簇中有2 個基因的PlsC acyltransferase 結構域保守 基 序 是Motif 4，有3 個基因的保守基序是Motif 17；Ⅲ簇中mtGPAT24沒有與其他23 個基因相同的基序，可能與其序列太短有關。mtGPAT21基因PlsC acyltransferase 結構域的保守基序為Motif 17，其余6 個基因的保守基序均是Motif 4；Ⅱ、Ⅲ簇基因結構相對復雜，外顯子數量較多，表明其親緣關系較近。

圖3 蒺藜苜蓿mtGPAT 進化、基因結構和保守基序分析Figure 3 Phylogenetic, gene structure, and conserved motif analyses of mtGPAT genes in Medicago truncatula

在蒺藜苜蓿基因表達圖譜服務器(http://mtgea.noble.org/v2/)中找mtGPAT家族成員的探針時發現除 了KEH33585、AES96960 和AES97896 這3 個 基因的探針編號找不到之外，其余21 個基因均可找到各自的探針編號。根據探針編號將21 個基因在不同組織部位和鹽脅迫下的表達數據(相對表達量)取log2 值后作組織表達圖(圖4)。不同組織部位的表達結果顯示，找出探針的21 個基因大致分成了3 簇，第1 簇各基因在各個組織中的表達量相比于其他兩個簇均較高。第2 簇中mtGPAT8、mtGPAT18和mtGPAT10在花中表達量相對較高；第3 簇mtGPAT11在根、莖、葉、根瘤和葉芽中表達量較低，mtGPAT7、mtGPAT24和mtGPAT23在葉中表達量均較低。同時21 個基因在芽中均幾乎不表達。

圖4 21 個mtGPAT 基因在蒺藜苜蓿中的表達模式Figure 4 Expression patterns of the 21 mtGPAT genes in Medicago truncatula

2.5 蒺藜苜蓿GPAT 基因家族在不同組織和鹽脅迫下的表達分析

根 據 蒺 藜 苜 蓿 幼 苗 在200 mmol·L?1NaCl 脅 迫下的表達圖(圖4)，可以看出，21 個基因也分成了3 簇。第1 簇4 個成員表達量均較低，但對鹽脅迫響應比較明顯，mtGPAT3在脅迫1 h 后表達量明顯上調，隨著處理時間的延長表達量有所下降，但也明顯比對照組高；mtGPAT5分別在脅迫處理2 和10 h時表達量顯著升高(P< 0.05)；mtGPAT11在脅迫12 h后表達量顯著上調(P< 0.05)。其他兩個簇基因表達量均較高，但只有極個別基因的表達量在脅迫前后有較微弱的變化，大多數基因的表達量在脅迫前后均無明顯變化。

3 討論與結論

甘油脂類在植物生物學中起著至關重要的作用，因為它們是細胞膜的主要成分、種子發育過程中的貯藏脂質以及植物器官表皮表面的保護性疏水屏障[12]。此外，甘油脂質還與植物的生長、發育以及對生物和非生物脅迫的抗性有關[16]。為進一步了解GPAT 在甘油脂質生物合成和不同生理過程中的作用，了解GPAT 的進化歷史和多樣性是非常必要的。系統發育分析表明，24 個mtGPAT基因可分為3 個亞家族(Group 1、Group 2、Group 3)，這與擬南芥10 個GPAT基因(AtGPAT1-8、AtGPAT9和AtS1)的分類相似。目前對擬南芥中大多數GPAT基因的功能進行了詳細的鑒定和表征，擬南芥質體型Ats1 是一種可溶性和質體定位的GPAT 酶，通過利用酰基ACP 底物催化擬南芥葉綠體中磷脂酰甘油生物合成的第一反應，并且表現出sn-1 酰基轉移區域特異性[12]。擬南芥質體可溶性GPAT 的酰基底物偏好(即飽和和不飽和酰基ACPs)可能通過介 導 磷 脂 酰 甘 油(phosphatidyl-glycerol PG)sn-1 位 置的脂肪酸組成部分地控制植物的耐寒性，因此影響植物氣生組織膜流動性[17]，但其在苜蓿中的作用還有待研究，后續可以基于本研究中鑒定分類的10 個Ⅲ型質體型mtGPAT基因開展試驗。擬南芥GPAT9在植物膜和貯藏脂肪生物合成中起著重要作用，GPAT9還具有sn-1 酰基轉移酶活性，對酰基化合物具有高度特異性，從而證實了其在種子三酰甘油(TAG)生物合成中的作用，并提供了全面的證據支持其在葉片極性和非極性脂質以及花粉中脂滴產生中的作用[5]，本研究中4 個II 型mtGPAT基因歸類為GPAT9，與其可能存在相似的功能。擬南芥8 種GPAT(GPAT1-8) 不需要用于膜或貯藏脂肪的生物合成，但可能影響擬南芥[1]、甘藍型油菜[2]和水稻[10]角質或軟木脂的組成和數量。而軟木脂和角質是由某些植物細胞沉積的細胞外脂質屏障。它們對于控制氣體、水和離子通量至關重要，是保護植物免受病原體入侵的物理屏障[12]。GPAT1-8中GPAT4和GPAT8被證明是葉片角質形成所必需的[18]，GPAT6是花角質合成所必需的[19]，GPAT5已被證明參與了根和種子中軟木脂的合成[6]。本研究I 型mtGPAT22與GPAT4和GPAT8聚在一起表明其與葉片角質形成有關，mtGPAT10、mtGPAT18跟GPAT6聚在一起，說明它們會參與花角質的形成過程。根據系統進化表明與GPAT5相近的mtGPAT3、mtGPAT16有可能在苜蓿根和種子軟木脂合成中發揮重要作用。

鹽脅迫是一種主要限制世界各地作物產量的非生物脅迫，植物GPAT基因參與鹽脅迫過程[20]，同時GPAT基因在植物中的過度表達可增強其耐鹽性或耐寒性。先前在棉花(Gossypiumspp.)中的研究表明：在中度鹽脅迫下，大多數GhGPAT基因在根中表達上調，而在葉片中只發現少量的GPAT基因表達上調，這一結果證實了根系是直接響應鹽脅迫的第一組織[21]。在擬南芥AtGPAT6、AtGPAT7和AtGPAT93 個GPAT基 因 的 研 究 中，AtGPAT6和AtGPAT7可以主動調節植物對鹽脅迫的反應[22]。本研究中，在200 mmol·L?1NaCl 脅迫蒺藜苜蓿幼苗的情況下，大多數mtGPAT基因的表達量均較高，并且不會隨著脅迫時間的變化有明顯的上調或下調，只有mtGPAT3、mtGPAT5、mtGPAT113 個基因在脅迫時間變長后表達量有較微弱的上調。與擬南芥AtGPAT6和AtGPAT7聚到一起的4 個蒺藜苜蓿基因mtGPAT10、mtGPAT18、mtGPAT3和mtGPAT16會隨著鹽脅迫時間的不同表達量有所不同，對鹽脅迫響應明顯。

綜上所述，本研究提供了蒺藜苜蓿GPAT基因比較全面的基因組分析，包括系統發育、基因結構、蛋白質特性、基因表達和耐鹽性分析。這些結果有助于人們更好地了解GPAT基因的進化史，并對蒺藜苜蓿GPAT基因的功能有更深入的了解。系統發育分析表明，蒺藜苜蓿GPAT基因可分為3 個不同的亞家族(Group 1、Group 2、Group 3)，進一步證實了它們在基因結構、蛋白質性質、基序出現和基因表達模式等方面的保守性和變異性。蒺藜苜蓿作為豆科模式植物代表，同時也是紫花苜蓿等物種的近緣物種，本研究結果可為后續研究紫花苜蓿GPAT基因的功能提供基礎資料，以便更深入闡述紫花苜蓿的抗鹽堿機制。