甘肅省5 種昆蟲病原線蟲對草地貪夜蛾的致病力測定

楊淋凱，朱小芳，錢秀娟，劉衛紅，姜紅霞，劉長仲

（1. 甘肅農業大學植物保護學院，甘肅 蘭州 730070；2. 甘肅省植保植檢站，甘肅 蘭州 730020）

草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)屬鱗翅目夜蛾科灰翅夜蛾屬[1-3]，是一種原發生于美洲熱帶和亞熱帶地區的多食性及遷飛性農業害蟲，因其生存能力強，擴展速度快，目前已侵入非洲和亞洲多個國家和地區[4]。我國于2019 年1 月在云南首次發現草地貪夜蛾，此后迅速蔓延至多個省份。甘肅省于2019年7 月2 日首次發現草地貪夜蛾，截止2019 年年底已在甘肅東部28 個縣區發生，為害玉米(Zea mays)約266.67 hm2[5-6]。有研究證明入侵我國的草地貪夜蛾均為“玉米型”[7]，主要危害玉米，其次是高粱(Sorghum bicolor)、谷子(Setaria italica)、小麥(Triticum aestivum)、甘蔗(Saccharum officinarum)等15 種作物，甚至也能在皇竹草(Pennisetum sinese)、馬唐(Digitaria sanguinalis)、牛筋草(Eleusine indica)、蘇丹草(Sorghum sudanense)等禾本科草類植物上生存[8]。玉米是我國主要的糧食和飼料作物，而高粱的營養成分類似于玉米，且成本更低，經加工可做成優良的飼料，減緩草地畜牧業飼草供應緊缺的壓力[9]。玉米和高粱是草地貪夜蛾的主要寄主，其大規模危害會造成玉米和高粱的嚴重減產，這無疑對糧食安全生產和草地畜牧業發展構成了極大威脅。目前國內對該害蟲的防治以幾種殺蟲活性強的新型化學殺蟲劑為主，如甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽、氯蟲苯甲酰胺、乙基多殺菌素及相關的復合制劑，并在生產上取得了一定的防治效果[10-12]，但長期大量施用化學農藥不僅污染環境、害蟲容易產生抗藥性，同時還增加了飼料農藥超標和畜產品品質下降的風險。在生物防治方面，草地貪夜蛾也已經對轉Bt 毒蛋白基因的作物及Bt 殺蟲制劑產生抗性[13]，因此尋求新的生防制劑具有重要的意義。

昆蟲病原線蟲(entomopathogenic nematodes, EPN)包括斯氏屬(Steinernema)和異小桿屬(Heterorhabditis)兩類[14]，具有寄主范圍廣及主動搜尋能力、對環境無污染、對人畜安全、易培養、成本低、可與農藥混配施用等優點[15]。作為重要的生防資源，昆蟲病原線蟲已被用于防治蠐螬(Scarabacidae)、韭蛆(Bradysia odoriphaga)、小地老虎(Agrotis ypsilon)等多種農林、草地、花卉以及衛生害蟲[16-17]。使用昆蟲病原線蟲防控草地貪夜蛾已成為國內外的研究熱點。昆蟲病原線蟲對寄主昆蟲有很強的專化性，不同種類甚至品系對相同寄主的致病力不同[18]，因此正確選擇適宜種類及品系是防治成功的重要因素。

甘肅氣候干燥，少雨且晝夜溫差大，外地引進的昆蟲病原線蟲難以適應當地的環境，而土著昆蟲病原線蟲早已適應當地的條件。因此，應用土著昆蟲病原線蟲具有短時間內完成定殖、建立穩定種群、更好地發揮持續高效控害等特點。為探索甘肅省昆蟲病原線蟲資源對防控草地貪夜蛾的潛力，拓展其在害蟲生物防治中的應用，本研究利用從甘肅省采集分離獲得的5 種10 個昆蟲病原線蟲品系，通過室內生物測定，篩選出對草地貪夜蛾具有高效生防潛力的昆蟲病原線蟲品系，為有效利用甘肅省昆蟲病原線蟲資源防治草地貪夜蛾提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

供試昆蟲：草地貪夜蛾采自甘肅省白銀市靖遠縣，在甘肅農業大學昆蟲生態實驗室飼養。

供試線蟲：夜蛾斯氏線蟲(Steinernema feltiae)0639C、0657YM、0661YM、0663PG、0663TD、0619HT品系，斯氏線蟲(Steinernema karil) 0663YC 品系，卡森斯氏線蟲(Steinernema krussei) 0657L 品系，短尾異小桿線蟲(Heterorhabditis brevicaudis) 0641TY 品系，大異小桿線蟲(Heterorhabditis megidis) 0627M 品系。線蟲10 個品系均采自甘肅省內西峰市、天水市、武威市民勤縣、白銀市靖遠縣和景泰縣等具有代表性的市縣[18]，采用大蠟螟(Galleria mellonella)誘集法分離并收集線蟲[19]，經品系鑒定后保存于甘肅農業大學昆蟲生態實驗室。定期以韭蛆(Bradysia odoriphaga)為寄主于無菌土壤中復壯以保證品系活力。試驗所用線蟲懸浮液為新鮮培養，由大蠟螟活體擴繁而得，保存于4 ℃冰箱內待用。

1.2 致病力測定

以草地貪夜蛾2 齡幼蟲作為供試昆蟲，篩選出致病力較高的昆蟲病原線蟲種類和品系，用致病力較高的昆蟲病原線蟲侵染草地貪夜蛾，并測定其對草地貪夜蛾的致病力。

1.2.1 甘肅省昆蟲病原線蟲種類(品系)篩選

在24 孔細胞培養板中處理，每個孔加入1 頭草地貪夜蛾2 齡幼蟲并用脫脂棉和濾紙進行保濕，12 個孔為一個處理，用移液槍吸取200 頭線蟲侵染的溶液滴加在每個孔內，1 個品系線蟲為1 個處理，共10 個線蟲處理，同時以等量無菌水作對照，每處理重復3 次，孔板內放置足量的草地貪夜蛾人工飼料[20]。然后將24 孔板放回人工氣候箱，每隔12 h 檢查草地貪夜蛾的死亡情況并記錄。控制條件為溫度24～26 ℃，相對濕度70%，光照 ∶ 黑暗16 h ∶ 8 h。

1.2.2 高效昆蟲病原線蟲品系對草地貪夜蛾2 齡幼蟲的致病力測定

對篩選出的高效品系進行致病力測定，在24 孔細胞培養板中處理，每個孔加入1 頭草地貪夜蛾2 齡幼蟲并用脫脂棉和濾紙保濕，12 個孔為一個處理。每種線蟲設6 個數量梯度，使線蟲與草地貪夜蛾2 齡幼蟲數量比分別為5 ∶ 1、10 ∶ 1、20 ∶ 1、40 ∶ 1、80 ∶ 1、160 ∶ 1，同時以等量無菌水處理作對照，每處理重復3 次，孔板內放置足量的草地貪夜蛾人工飼料。然后將24 孔板放回人工氣候箱，每隔12 h 檢查草地貪夜蛾的死亡情況并記錄。控制條件為溫度24～26 ℃，相對濕度70%，光照 ∶ 黑暗16 h ∶ 8 h。

1.2.3 高效昆蟲病原線蟲品系對草地貪夜蛾預蛹的致病力測定

在9 cm 的培養皿中墊2 層濾紙，加入適量蒸餾水保持濕潤，每皿放入1 頭草地貪夜蛾預蛹，設200、400、800、1 600、3 200 IJs·H?15 個線蟲數量梯度，用移液槍吸取各濃度的線蟲直接滴加到預蛹體壁上，每處理10 頭，3 次重復，以無菌水處理作對照。然后將培養皿放回人工氣候箱，檢查化蛹情況并記錄。

1.2.4 高效昆蟲病原線蟲品系對草地貪夜蛾蛹的致病力測定

在帶蓋的小塑料盒內裝入適量蛭石并加蒸餾水保持濕潤，每個盒子中埋入1 頭正常化蛹的供試昆蟲蛹，用移液槍滴加各梯度的線蟲，使線蟲與草地貪夜蛾蛹的數量比分別為800 ∶ 1、1 600 ∶ 1、3 200 ∶ 1、6 400 ∶ 1、12 800 ∶ 1，每處理10 頭，3 次重復，以無菌水處理作對照，操作完成后放回人工氣候箱觀察羽化情況并記錄。

1.3 數據分析

采用SPSS 26.0 軟件對所測數據進行統計分析，用平均值 ± 標準誤表示測定結果。使用 One-Sample Kolmogorov-Smirnov test 對數據進行正態分布檢驗。符合正態分布的使用 Lev-ene’s test 進行方差齊性檢驗，若齊性不存在，則對百分率數據進行反正弦轉換。對本試驗數據進行檢驗表明均符合方差齊性，直接進行單因素方差分析，并使用 LSD test 進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 甘肅省昆蟲病原線蟲優良種類(品系)的篩選

不同昆蟲病原線蟲種類間對草地貪夜蛾2 齡幼蟲的致死率差異較大(表1)，夜蛾斯氏線蟲對草地貪夜蛾2 齡幼蟲致病力最強，卡森斯氏線蟲次之。幼蟲被昆蟲病原線蟲各品系侵染24 h 后均有一定的死亡率，其中夜蛾斯氏線蟲0663PG 為63.90%，顯著高于其他昆蟲病原線蟲種類(P< 0.05)。夜蛾斯氏線蟲的0657YM、0663TD、卡森斯氏線蟲0657L 和斯氏線蟲(S. karil) 0663YC 的致病死亡率在31%～43%，但其間差異不顯著(P> 0.05)。侵染48 h 后，各品系對寄主的致死作用均有所增加，其中夜蛾斯氏線蟲 0663PG 為88.90%，與其他昆蟲病原線蟲種類存在顯著差異(P< 0.05)。侵染72 h 后，除夜蛾斯氏線蟲0619HT 和短尾異小桿線蟲0641TY 外，其余所有昆蟲病原線蟲品系的累積死亡率均在50%以上。大異小桿線蟲 0627M 和夜蛾斯氏線蟲0663TD的致死率為75%和72.23%，兩者間差異不顯著(P>0.05)。夜蛾斯氏線蟲 0663PG 和卡森斯氏線蟲 0657L的致死率分別達到100%和83.30%，兩者間差異不顯著(P> 0.05)。可見，夜蛾斯氏線蟲 0663PG 和卡森斯氏線蟲0657L 為對草地貪夜蛾幼蟲致病力較強的昆蟲病原線蟲品系。

表1 10 個昆蟲病原線蟲品系對草地貪夜蛾2 齡幼蟲的致病力Table 1 Virulence of 10 entomopathogenic nematodes strains on 2nd instar larvae of S. frugiperda

夜蛾斯氏線蟲的不同品系對草地貪夜蛾2 齡幼蟲的致死率存在明顯差異。在夜蛾斯氏線蟲的6 個供試品系中，侵染24 h 后，0663PG 的致死率為63.90%，與其余品系之間存在顯著差異(P< 0.05)。侵染72 h 后，0663PG 的累計死亡率達到100%，0663TD、0657YM、0639C、0661YM 和0619HT 分 別為75.00%、63.90%、55.57%、55.57%和30.53%。

2.2 2 種高效昆蟲病原線蟲對草地貪夜蛾的致病力

草地貪夜蛾2 齡幼蟲被侵染24 h 后，夜蛾斯氏線蟲0663PG 與幼蟲數量比為160 ∶ 1 和80 ∶ 1 時，其致死率均為38.90%，顯著高于其他線蟲濃度(P<0.05)。侵染48 h 時，數量比為160 ∶ 1 和80 ∶ 1 時死亡率分別為63.90%和52.77%，兩者差異不顯著(P>0.05)。侵染72 h 時，其死亡率分別達到100%和61.10%，兩者間存在顯著差異(P< 0.05)，也顯著高于其他線蟲濃度(P< 0.05) (表2)。

卡森斯氏線蟲0657L 侵染24 h 后，數量比為160 ∶ 1 和80 ∶ 1 時，其致死率均為27.77%。侵染48 h后，數量比為160 ∶ 1 和80 ∶ 1 死亡率較高，分別為61.10%和50.57%；處理72 h 后其死亡率分別為80.53%和58.33%，兩者間差異顯著(P< 0.05) (表2)。

表2 夜蛾斯氏線蟲0663PG 品系和卡森斯氏線蟲0657L 品系對草地貪夜蛾 2 齡幼蟲的致死作用Table 2 Steinernema feltiae 0663PG and Steinernema krussei 0657L against Spodoptera frugiperda 2nd instar larvae

2.3 夜蛾斯氏線蟲0663PG 品系對草地貪夜蛾預蛹的致病力測定

5 個數量梯度處理下的預蛹2 d 后均可成功化蛹，侵染13 d 后處理組和對照組開始出現草地貪夜蛾蛹羽化，處理15 d 后，夜蛾斯氏線蟲0663PG 與草地貪夜蛾預蛹數量比為1 600 ∶ 1 和3 200 ∶ 1 時，蛹的羽化率為96.67%，其余梯度處理下的羽化率均為100% (表3)。

表3 夜蛾斯氏線蟲0663PG 品系對草地貪夜蛾預蛹的致病力Table 3 Steinernema feltiae 0663PG against Spodoptera frugiperda prepupa

2.4 夜蛾斯氏線蟲0663PG 品系對草地貪夜蛾蛹的致病力測定

5 個數量梯度下夜蛾斯氏線蟲0663PG 在侵染13 d 后對草地貪夜蛾蛹的致死作用不明顯，數量比為6 400 ∶ 1 和12 800 ∶ 1 時，蛹的羽化率為93.33%。對未羽化的蛹解剖發現確有線蟲寄生，但各梯度下的線蟲對蛹的致死率低于10%。觀察結果表明，昆蟲病原線蟲不適合在蛹期進行防治，且線蟲對草地貪夜蛾蛹的羽化時間并沒有影響(表4)。

表4 夜蛾斯氏線蟲0663PG 品系對草地貪夜蛾蛹的致病力Table 4 Steinernema feltiae 0663PG against Spodoptera frugiperda pupa

3 討論與結論

本研究發現，夜蛾斯氏線蟲0663PG 品系對草地貪夜蛾的致病力較高，處理48 h 時，侵染數量比為160 ∶ 1 時，其死亡率達到63.90%。梁銘榮等[21]研究發現，小卷蛾斯氏線蟲AⅡ和長尾斯氏線蟲X-7品系處理36 h 時，侵染數量比為50 ∶ 1 時，對草地貪夜蛾2 齡幼蟲的致死作用達到92%和80%。通過結果比對分析，夜蛾斯氏線蟲0663PG 致病力低于小卷蛾斯氏線蟲AⅡ和長尾斯氏線蟲X-7 品系，說明不同種類及品系對同一種寄主昆蟲的致病力存在差異。這可能與不同種間線蟲的侵染方式有關，夜蛾斯氏線蟲0663PG 屬于中間型線蟲[22]，而小卷蛾斯氏線蟲AⅡ和長尾斯氏線蟲X-7 品系屬于伏擊型侵染策略的線蟲，草地貪夜蛾2 齡幼蟲比較活躍，行動速度快，更適合伏擊型線蟲侵染。錢秀娟等[23]在室內測定下，夜蛾斯氏線蟲0619HT 對大蠟螟的致死作用最強，處理72 h 時，侵染數量比為60 ∶ 1 時，累計死亡率為96.7%。而本研究發現，0619HT在處理72 h 時，侵染數量比為200 ∶ 1 時，累計死亡率為30.53%，與供試的其他9 個線蟲品系相比致病力最低，說明同種昆蟲病原線蟲品系對不同的寄主昆蟲致病力存在差異。昆蟲病原線蟲的致病力會因寄主昆蟲的改變而不同，因此，昆蟲病原線蟲的室內篩選和致病力評價在生產應用之前很有必要。

國外對于昆蟲病原線蟲防控草地貪夜蛾的研究早于國內，許多研究表明昆蟲病原線蟲具有防治草地貪夜蛾的應用潛力。Lezama-Gutierrez 等[24]和Molina-Ochoa 等[25]調查發現，斯氏線蟲是土壤中分布最廣的草地貪夜蛾天然病原物。Andaló等[26]在室內條件下測定了17 個巴西本地線蟲品系對草地貪夜蛾的致病力, 最終得到S. arenarium和Heterorhabditissp. RSC02 兩個高效品系。本研究以甘肅本地10 個昆蟲病原線蟲品系進行室內篩選和致病力評測，發現夜蛾斯氏線蟲0663PG 的毒力最高，當0663PG 與草地貪夜蛾數量比為80 ∶ 1 時，72 h 后草地貪夜蛾幼蟲死亡率在60%以上，當侵染劑量增加到160 ∶ 1時，草地貪夜蛾的死亡率達到100%，本研究認為，夜蛾斯氏線蟲0663PG 品系在草地貪夜蛾的生物防治方面有著巨大潛力，可以在后續研究中與化學藥劑組合使用，彌補線蟲單獨使用時見效慢的缺陷[27]。基于此，尋求高效低毒的殺蟲劑與夜蛾斯氏線蟲0663PG 混配防治草地貪夜蛾還有待研究。

本研究在室內測定了甘肅省5 種10 個線蟲品系對草地貪夜蛾2 齡幼蟲的致病力，篩選出致病力較好的夜蛾斯氏線蟲0663PG 和卡森斯氏線蟲0657L 兩個品系。在低劑量下對以上2 種線蟲進行致病力測定，夜蛾斯氏線蟲0663PG 與草地貪夜蛾數量比為160 ∶ 1 時，處理48 h 后致死率為63.90%，與卡森斯氏線蟲0657L 的致死率相近，但處理72 h后草地貪夜蛾2 齡幼蟲死亡率達到100%，同樣數量比下卡森斯氏線蟲0657L 對2 齡幼蟲的致死率為80%，夜蛾斯氏線蟲0663PG 的致病力高于卡森斯氏線蟲0657L。在大劑量下用夜蛾斯氏線蟲0663PG侵染草地貪夜蛾預蛹和蛹，預蛹在線蟲處理下2 d后成功化蛹，預蛹和蛹分別在侵染15 d 和13 d 后完成羽化，但夜蛾斯氏線蟲0663PG 對預蛹和蛹的致死率低于10%。本研究結果表明，草地貪夜蛾預蛹和蛹對昆蟲病原線蟲不敏感，線蟲侵染后對蛹的羽化時間沒有顯著影響(P> 0.05)，故昆蟲病原線蟲并不適合在草地貪夜蛾預蛹和蛹期進行防治。