胺鮮酯對(duì)鉻脅迫下白三葉種子萌發(fā)特性的影響

王 鐸，田雨龍，張鴻建，張慶慶，陳柯如，李 州

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)科技學(xué)院，四川 成都 611130）

白三葉(Trifolium repens)又名荷蘭翹搖、白花苜蓿、白車軸草，為豆科三葉草屬(Trifolium)多年生草本植物，廣泛分布于溫帶及亞熱帶地區(qū)，在我國(guó)淮河以南和西南地區(qū)均有廣泛栽培種植。白三葉是優(yōu)質(zhì)牧草，具有莖葉細(xì)軟、葉量豐富、粗蛋白含量高、粗纖維含量低等特點(diǎn)，既可喂養(yǎng)牲畜，又可飼喂草食性魚(yú)類，具有良好的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[1]。因其植株低矮、匍匐生長(zhǎng)特性強(qiáng)、葉形和花色優(yōu)美，也被作為優(yōu)良的水土保持及園林綠化植物應(yīng)用于球場(chǎng)、公園、小區(qū)、游憩綠地等地[2]。但白三葉多生長(zhǎng)于冷涼濕潤(rùn)的環(huán)境，其自身根系較淺，抗蒸騰能力較差，易受干旱、高溫、金屬離子毒害等非生物脅迫的影響，使其品質(zhì)、產(chǎn)量及觀賞價(jià)值降低[3]。鉻(chromium, Cr)為地球上第七大元素[4]，在自然界中以不同氧化價(jià)態(tài)的化合物形式穩(wěn)定存在[5]。其中三價(jià)和六價(jià)是鉻最穩(wěn)定和最常見(jiàn)的兩個(gè)價(jià)態(tài)，三價(jià)鉻為人體必需微量元素，參與血糖調(diào)節(jié)并起重要作用[6]，但六價(jià)鉻毒性為三價(jià)鉻的百倍，具有嚴(yán)重毒害作用[7]，且由于其化學(xué)活性較三價(jià)鉻更高，也更易被植物吸收。近年來(lái)，由于工業(yè)污染、農(nóng)藥過(guò)量施用等導(dǎo)致土壤重金屬含量嚴(yán)重超標(biāo)。在云南、四川、甘肅、內(nèi)蒙古等地，鉻均為導(dǎo)致當(dāng)?shù)赝寥牢廴镜闹饕亟饘佟Ｒ运拇槔W(xué)良和廖遠(yuǎn)安[8]在四川成都金牛區(qū)50 km2調(diào)查范圍的農(nóng)業(yè)土壤中發(fā)現(xiàn)鎘、砷、鉻等有害金屬污染的耕地面積約占50%以上。由此可見(jiàn)，重金屬鉻是致使白三葉等優(yōu)質(zhì)牧草和作物減產(chǎn)的重要非生物脅迫因素。

胺鮮酯(diethyl aminoethyl hexanoate, DA-6)是一種高效植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)，具有較高生物活性，對(duì)多種農(nóng)作物具有顯著的增產(chǎn)、提高抗逆性、增強(qiáng)抗病性、改善品質(zhì)等功效。DA-6 可單獨(dú)使用，也可與肥料、殺菌劑、殺蟲(chóng)劑和除草劑等復(fù)配使用，起到協(xié)同增效作用[9-13]。已有研究發(fā)現(xiàn)，使用DA-6 處理番茄(Lycopersicon esculentum)幼苗可通過(guò)調(diào)控細(xì)胞分裂素提高番茄的耐低溫能力[14]；利用DA-6 處理玉米(Zea mays)葉片可增加種子內(nèi)蛋白質(zhì)含量，進(jìn)而提高種子活力[15]。此外，DA-6 浸種可顯著提高藜麥(Chenopodium quinoa)、 水 稻(Oryza sativa)、 椰棗(Phoenix dactylifera)種子的萌發(fā)率，并使水稻在低溫脅迫下保持較高的蛋白質(zhì)水平，提高水稻抗寒性，而且能有效緩解鹽脅迫對(duì)椰棗種子發(fā)芽造成的毒害作用[16-18]。

已有研究證實(shí)DA-6 作為一種有效的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑具有顯著提高種子萌發(fā)率、種子活力及抗逆性的功能，但關(guān)于其是否有助于提高植物萌發(fā)期對(duì)重金屬離子脅迫抗性方面的研究較少，尤其是關(guān)于種子萌發(fā)期耐Cr 性的研究更是鮮有人涉足。因此，本研究采用白三葉品種‘海發(fā)’為供試材料，深入研究使用DA-6 浸種是否能夠有效提高白三葉萌發(fā)期的耐Cr 性，從滲透調(diào)節(jié)、氧化傷害及抗氧化防御等生理水平揭示DA-6 提高種子萌發(fā)期耐Cr 性的機(jī)理，以期為白三葉在重金屬含量相對(duì)較高地區(qū)的栽培管理提供新方向。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為白三葉中被廣泛栽培的品種‘海發(fā)’(Trifolium repens‘Haifa’)，于2019 年在四川農(nóng)業(yè)大學(xué)第六教學(xué)實(shí)驗(yàn)樓草業(yè)工程實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展試驗(yàn)，種子購(gòu)置于四川百綠時(shí)代園林綠化有限公司；種子的初始凈度為98%，萌發(fā)率為94%。DA-6 及配置Cr6+溶液(K2Cr2O7)等所需化合物均為分析純?cè)噭?/p>

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

先測(cè)試白三葉種子在不同Cr6+濃度(0、5、7.5、10 mmol·L?1)脅迫下的萌發(fā)情況，測(cè)得白三葉種子在7.5 mmol·L?1濃度的Cr6+脅迫下萌發(fā)率接近60%，故選取該濃度進(jìn)行下一步試驗(yàn)。隨機(jī)稱取1 g 白三葉種子，用200 mL 蒸餾水浸泡1 h，再分別置于不同濃度(20、40、60、100、200 mmol·L?1)的200 mL DA-6溶液中浸種2 h；對(duì)照組使用200 mL 蒸餾水浸泡3 h，不進(jìn)行DA-6 預(yù)處理。浸種后從每個(gè)處理中隨機(jī)挑選50 粒健康、飽滿的種子置于墊有4 層濾紙的玻璃培養(yǎng)皿中，此后分別在蒸餾水(對(duì)照組) 和7.5 mmol·L?1Cr6+溶液(處理組)中發(fā)芽。試驗(yàn)共12 個(gè)處理：CK (蒸餾水浸種后在蒸餾水中發(fā)芽)、Cr6+(蒸餾水 浸 種 后 在Cr6+溶 液 中 發(fā) 芽)、20 mmol·L?1DA-6(20 mmol·L?1DA-6 浸 種 后 在 蒸 餾 水 中 發(fā) 芽)、20 mmol·L?1DA-6 + Cr6+(20 mmol·L?1DA-6 浸 種 后在Cr6+溶 液 中 發(fā) 芽)、40 mmol·L?1DA-6 (40 mmol·L?1DA-6 浸種后在蒸餾水中發(fā)芽)、40 mmol·L?1DA-6 +Cr6+(40 mmol·L?1DA-6 浸 種 后 在Cr6+溶 液 中 發(fā) 芽)、60 mmol·L?1DA-6 (60 mmol·L?1DA-6 浸種后在蒸餾水 中 發(fā) 芽)、60 mmol·L?1DA-6 + Cr6+(60 mmol·L?1DA-6 浸種后在Cr6+溶液中發(fā)芽)、100 mmol·L?1DA-6(100 mmol·L?1DA-6 浸 種 后 在 蒸 餾 水 中 發(fā) 芽)、100 mmol·L?1DA-6 + Cr6+(100 mmol·L?1DA-6 浸 種后在Cr6+溶液中發(fā)芽)、200 mmol·L?1DA-6 (200 mmol·L?1DA-6 浸 種 后 在 蒸 餾 水 中 發(fā) 芽) 和200 mmol·L?1DA-6 + Cr6+(200 mmol·L?1DA-6 浸 種 后 在Cr6+溶 液中發(fā)芽)，每個(gè)處理設(shè)置5 次重復(fù)。將培養(yǎng)皿置于生長(zhǎng)室中，以種子發(fā)育長(zhǎng)成具備正常種苗結(jié)構(gòu)為萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)(胚根長(zhǎng)度與種子長(zhǎng)度等長(zhǎng)時(shí)即為發(fā)芽)，于每日12:00 記錄種子發(fā)芽數(shù)并補(bǔ)充蒸餾水。于第3 天測(cè)定發(fā)芽勢(shì)，第7 天測(cè)定萌發(fā)率，并計(jì)算其發(fā)芽指數(shù)及平均萌發(fā)時(shí)間。由上述試驗(yàn)得出60 mmol·L?1DA-6浸種處理可顯著緩解Cr6+對(duì)白三葉種子萌發(fā)的脅迫，故后續(xù)試驗(yàn)設(shè)置蒸餾水浸種和60 mmol·L?1DA-6浸種兩個(gè)處理，分別在正常條件和7.5 mmol·L?1Cr6+溶液脅迫處理下進(jìn)行后續(xù)萌發(fā)試驗(yàn)，共4 個(gè)處理，每個(gè)處理設(shè)置4 個(gè)重復(fù)。于種子萌發(fā)第7 天進(jìn)行表型分析并測(cè)定其生理生化指標(biāo)，分析DA-6 浸種提高白三葉種子萌發(fā)期耐鉻性的相關(guān)機(jī)理。

1.3 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.3.1 種子萌發(fā)指標(biāo)測(cè)定

萌發(fā)率 = (n/N) × 100%。式中：n為發(fā)芽種子總數(shù)，N為供試種子總數(shù)。

發(fā)芽勢(shì) = 發(fā)芽3 d 種子發(fā)芽總數(shù)/供試種子總數(shù) × 100%。∑

式中：MGT(mean germination time)為平均發(fā)芽時(shí)間，D為從種子置床起計(jì)算的天數(shù)，n為相應(yīng)隔天的萌發(fā)率。

每個(gè)處理組中隨機(jī)選取3 組發(fā)芽第7 天時(shí)完整、健全的幼苗，每組15 株，用直尺測(cè)量胚芽長(zhǎng)和胚根長(zhǎng)。

1.3.2 生理生化指標(biāo)測(cè)定

在種子萌發(fā)第7 天時(shí)選取生長(zhǎng)狀況一致的白三葉幼苗進(jìn)行生理生化指標(biāo)測(cè)定，除可溶性糖指標(biāo)外其余指標(biāo)均取0.1 g 鮮樣進(jìn)行測(cè)定；可溶性糖則取0.05 g 干樣進(jìn)行測(cè)定，每組數(shù)據(jù)進(jìn)行4 次重復(fù)。采用蒽酮乙酸乙酯比色法測(cè)定可溶性糖(soluble sugar,WSC)含量[19]；采用磺基水楊酸法測(cè)定游離脯氨酸(free proline, Pro)含量[20]；采用李州等[21]的方法測(cè)定滲透勢(shì)(osmotic potential, MPa)；采用磺胺法測(cè)定超氧陰離子(superoxide anion, O2·?)產(chǎn)生速率[22]；采用碘化鉀法測(cè)定過(guò)氧化氫(hydrogen peroxide, H2O2)含量[23]；采用硫代巴比妥酸法測(cè)定丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量[24]；采用常規(guī)電導(dǎo)率儀法測(cè)定電導(dǎo)率(electrolyte leakage, EL)[25]；采用核黃素-NBT 法測(cè)定超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性[26]；采用愈創(chuàng)木酚顯色法測(cè)定過(guò)氧化物酶(peroxide,POD)活性[27]；采用紫外吸收法測(cè)定過(guò)氧化氫酶(catalase, CAT)活性[27]；采用Nakano 和Asada[28]的方法測(cè)定抗壞血酸過(guò)氧化物酶(ascorbate peroxidase,APX)活性；采用Cakmak 等[29]的方法測(cè)定脫氫抗壞血酸還原酶(dehydroascorbate reductase, DR)、谷胱甘肽還原酶(glutathione reductase, GR)和單脫氫抗壞血酸還原酶(monodehydroascorbate reductase, MR)活性。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)采用Excel 2016 軟件進(jìn)行分析，使用Origin 9.0 軟件進(jìn)行繪圖，使用SPSS 23.0 軟件進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn)(P< 0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 鉻脅迫對(duì)白三葉萌發(fā)特性的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明，5 mmol·L?1Cr6+脅迫能顯著降低白三葉種子的萌發(fā)率、發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)(P<0.05)，且上述3 項(xiàng)指標(biāo)均隨Cr6+溶液濃度升高而逐漸降低(圖1)。種子平均發(fā)芽時(shí)間隨Cr6+溶液濃度升高而增加。7.5 mmol·L?1Cr6+脅迫下的白三葉種子萌發(fā)率接近60%。

圖1 不同濃度鉻脅迫對(duì)白三葉種子發(fā)芽指標(biāo)的影響Figure 1 Effects of different concentrations of Cr6+ on seed germination parameters of Trifolium repens

2.2 鉻脅迫下DA-6 浸種對(duì)白三葉萌發(fā)特性的影響

正常萌發(fā)條件下，40、60 和100 mmol·L?1DA-6浸種并未顯著影響白三葉種子的萌發(fā)率(P> 0.05)，但這3 個(gè)浸種濃度均顯著提高了種子在Cr6+脅迫下的萌發(fā)率和發(fā)芽勢(shì)(P< 0.05)，其中60 mmol·L?1DA-6 浸種效果最顯著，這個(gè)濃度也能顯著縮短Cr6+脅迫下種子的平均發(fā)芽時(shí)間(P< 0.05) (表1)。中高濃度的DA-6 (100 mmol·L?1)浸種對(duì)白三葉種子在正常條件和Cr6+脅迫下的萌發(fā)特性影響不大，但高濃度的DA-6 (200 mmol·L?1)浸種則顯著降低了白三葉在正常條件和Cr6+脅迫下的萌發(fā)率和發(fā)芽勢(shì)(P<0.05)，并延長(zhǎng)種子平均發(fā)芽時(shí)間。60 mmol·L?1的DA-6 有效緩解了Cr6+脅迫對(duì)種子萌發(fā)的抑制，正常條件下對(duì)種子萌發(fā)也具有一定的促進(jìn)作用(圖2)。Cr6+脅迫顯著降低白三葉種子萌發(fā)時(shí)的根長(zhǎng)和莖長(zhǎng)(P< 0.05)，但使用DA-6 浸種后顯著減小了莖長(zhǎng)的下降幅度(P< 0.05)。Cr6+脅迫處理7 d 時(shí)，Cr+ DA-6處理種子的根長(zhǎng)和莖長(zhǎng)相較于Cr6+處理分別提高了13.64%和37.04% (圖2)。

圖2 鉻脅迫下胺鮮酯(DA-6)浸種對(duì)白三葉種子萌發(fā)過(guò)程中表型變化、根長(zhǎng)和莖長(zhǎng)的影響Figure 2 Effects of soaking seeds in diethyl aminoethyl hexanoate (DA-6) on phenotype and root and stem length of Trifolium repens during seed germination under Cr6+ stress

表1 Cr6+脅迫下胺鮮酯(DA-6)浸種對(duì)白三葉種子發(fā)芽指標(biāo)的影響Table 1 Effects of soaking seeds in diethyl aminoethyl hexanoate (DA-6) on seed germination parameters of Trifolium repens during germination under Cr6+ stress

2.3 鉻脅迫下DA-6 浸種對(duì)白三葉種子滲透調(diào)節(jié)指標(biāo)的影響

Cr6+脅迫下白三葉種子發(fā)芽時(shí)的可溶性糖含量較CK 顯著降低(P< 0.05)，此時(shí)Cr 和Cr + DA-6 處理組的可溶性糖含量分別僅為CK 和CK + DA-6的48.26%和61.82%，Cr 組的可溶性糖含量顯著低于Cr + DA-6 組(P< 0.05) (圖3)。Cr6+脅迫下游離脯氨酸含量顯著提高(P< 0.05)，此時(shí)CK 和CK + DA-6處理組的游離脯氨酸含量分別為Cr 和Cr + DA-6的40.81% 和26.21%，Cr + DA-6 組的游離脯氨酸含量顯著高于Cr 組(P< 0.05)。此外，Cr6+脅迫下種子滲透勢(shì)較CK 顯著增加(P< 0.05)，而經(jīng)DA-6預(yù)處理后，在正常條件下種子滲透勢(shì)顯著降低(P< 0.05)，在Cr6+處理?xiàng)l件下種子滲透勢(shì)顯著升高(P< 0.05)。

圖3 鉻脅迫下胺鮮酯(DA-6)浸種對(duì)白三葉種子萌發(fā)過(guò)程中可溶性糖含量、游離脯氨酸含量和滲透勢(shì)的影響Figure 3 Effects of soaking seeds in diethyl aminoethyl hexanoate (DA-6) on soluble sugar content, free proline content, and osmotic potential of Trifolium repens during germination under Cr6+ stress

2.4 鉻脅迫下DA-6 浸種對(duì)白三葉種子抗氧化代謝的影響

DA-6 浸種在正常條件下顯著降低了白三葉種子發(fā)芽過(guò)程中MDA 含量(P< 0.05)，但不影響O2·?產(chǎn)生速率、H2O2含量和EL (圖4)。Cr6+脅迫下各項(xiàng)生理指標(biāo)均得到顯著提高(P< 0.05)，加劇了細(xì)胞氧化傷害程度，但經(jīng)DA-6 浸種后O2·?產(chǎn)生速率、H2O2含量、MDA 含量和EL 較Cr6+脅迫均顯著降低(P< 0.05)，Cr + DA-6 處理的O2·?產(chǎn)生速率、H2O2含量、MDA 含量和EL 比Cr 處理分別降低了52.09%、14.85%、31.81%和15.48%。

圖4 鉻脅迫下胺鮮酯(DA-6)浸種對(duì)白三葉種子萌發(fā)過(guò)程中活性氧、丙二醛含量和電解質(zhì)滲透率的影響Figure 4 Effects of soaking seeds in diethyl aminoethyl hexanoate (DA-6) on reactive oxygen species, malondialdehyde (MDA)content, and electrolyte leakage of Trifolium repens during germination under Cr6+ stress

2.5 鉻脅迫下DA-6 浸種對(duì)白三葉種子萌發(fā)過(guò)程中抗氧化保護(hù)酶活性的影響

正常條件下，DA-6 浸種對(duì)白三葉種子萌發(fā)過(guò)程中POD 和CAT 活性無(wú)顯著影響(P> 0.05)，但顯著提高了SOD 活性(P< 0.05) (圖5)。相較于CK組，Cr6+脅迫顯著降低了SOD 和POD 活性(P< 0.05)，但顯著提高了CAT 活性(P< 0.05)。Cr + DA-6 處理的SOD、POD 和CAT 活性顯著高于Cr 組(P< 0.05)。

圖5 鉻脅迫下胺鮮酯(DA-6)浸種對(duì)白三葉種子萌發(fā)過(guò)程中抗氧化酶活性的影響Figure 5 Effects of soaking seeds in diethyl aminoethyl hexanoate (DA-6) on antioxidant enzyme activities of Trifolium repens during germination under Cr6+ stress

2.6 鉻脅迫下DA-6 浸種對(duì)白三葉種子萌發(fā)過(guò)程中抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)關(guān)鍵酶活性的影響

DA-6 浸種在正常條件下對(duì)白三葉種子萌發(fā)過(guò)程中APX、DR、GR 和MR 活性均無(wú)顯著影響(P>0.05) (圖6)。相 對(duì) 于CK 而 言，Cr 處 理 的APX 和GR 活性顯著降低(P< 0.05)，DR 活性顯著提高(P<0.05)，而MR 活性無(wú)顯著影響(P> 0.05)。Cr6+脅迫下經(jīng)DA-6 浸種后APX、DR、GR 和MR 活性均較Cr6+脅迫顯著提高(P< 0.05)，Cr + DA-6 處理的APX、DR、GR 和MR 活性比Cr 處理分別提高了780.18%、5.91%、37.79%和57.38%。

圖6 鉻脅迫下胺鮮酯(DA-6)浸種對(duì)白三葉種子萌發(fā)過(guò)程中抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)關(guān)鍵酶活性的影響Figure 6 Effects of soaking seeds in diethyl aminoethyl hexanoate (DA-6) on key enzyme activities of the AsA-GSH cycle of Trifolium repens during germination under Cr6+ stress

3 討論與結(jié)論

重金屬Cr 脅迫不僅影響植物種子萌發(fā)，而且能通過(guò)阻礙根系、莖稈和葉片生長(zhǎng)，進(jìn)而降低植物干物質(zhì)產(chǎn)量。此外，Cr 的毒害作用還體現(xiàn)在破壞植物細(xì)胞膜及內(nèi)部組分，改變植物體內(nèi)相關(guān)酶活性，抑制作物正常生長(zhǎng)發(fā)育[30]。前人研究表明，Cr 脅迫能顯著抑制甜瓜(Cucumis melo)[31]和黃麻(Corchorusspp. 和Hibiscusspp.)[32]種子的萌發(fā)率，但低濃度Cr脅迫對(duì)青菜(Brassica chinensis)種子萌發(fā)起到促進(jìn)作用，且隨Cr 濃度升高逐漸表現(xiàn)為抑制效應(yīng)[33]。本研究結(jié)果顯示，白三葉種子在7.5 mmol·L?1Cr6+脅迫下其萌發(fā)率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)顯著降低，且平均發(fā)芽時(shí)間顯著增加。受Cr6+脅迫的白三葉幼苗較正常處理下的幼苗其根長(zhǎng)和莖長(zhǎng)顯著降低，根莖出現(xiàn)黃化。適當(dāng)濃度(40、60、100 mmol·L?1)的DA-6 浸種使白三葉種子在Cr6+脅迫下的萌發(fā)率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)得到顯著提高，60 mmol·L?1DA-6 浸種也能顯著降低Cr6+脅迫對(duì)莖長(zhǎng)的抑制，表明適宜濃度的DA-6浸種能夠有效緩解Cr6+脅迫對(duì)種子萌發(fā)的抑制作用。但高濃度(200 mmol·L?1)的DA-6 浸種加劇了Cr6+的脅迫效果，進(jìn)一步降低種子在Cr6+脅迫下的萌發(fā)率，表明DA-6 提高白三葉種子萌發(fā)期抗性具有低濃度促進(jìn)高濃度抑制的特點(diǎn)。

滲透調(diào)節(jié)是植物適應(yīng)重金屬脅迫的重要機(jī)制之一，為適應(yīng)重金屬脅迫，植物體內(nèi)會(huì)合成和積累可溶性糖、游離脯氨酸、滲調(diào)蛋白等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，以保持細(xì)胞和組織滲透平衡[34]。本研究中，Cr6+脅迫下的白三葉種子萌發(fā)時(shí)可溶性糖含量較正常生長(zhǎng)條件下顯著降低，其原因可能是由于淀粉酶、麥芽糖酶活性受到抑制，阻礙了淀粉和麥芽糖的分解[35]。在經(jīng)DA-6 浸種后可溶性糖含量得到顯著提高，表明DA-6 可有效緩解Cr6+對(duì)淀粉代謝的抑制效應(yīng)。已有研究表明，外施DA-6 能顯著提高水稻葉片中可溶性糖的積累，有助于提高植物抗冷性[36]；DA-6 浸種處理決明子(Cassia obtusifolia)種子能顯著提高種子萌發(fā)期可溶性糖含量，進(jìn)而提高種子萌發(fā)期的耐鹽性[37]。細(xì)胞積累脯氨酸來(lái)調(diào)節(jié)滲透勢(shì)是植物提高自身抗逆性的重要機(jī)制[38]。研究發(fā)現(xiàn)，Cr6+脅迫顯著提高玉米[39]和小麥(Triticum aestivum)[40]的脯氨酸含量，DA-6 處理可顯著增加水稻[36]和草莓(Fragaria×ananassa)[41]在脅迫條件下的脯氨酸含量。本研究結(jié)果顯示，在Cr6+脅迫下白三葉種子萌發(fā)時(shí)游離脯氨酸含量顯著升高，且DA-6 浸種進(jìn)一步提高了白三葉在Cr6+脅迫下的游離脯氨酸含量，表明DA-6 調(diào)節(jié)Cr6+脅迫下白三葉滲透調(diào)節(jié)能力與促進(jìn)脯氨酸的積累有關(guān)。此外，DA-6浸種顯著降低了Cr6+脅迫下白三葉種子萌發(fā)過(guò)程中的滲透勢(shì)。由此表明，DA-6 能通過(guò)提高可溶性糖和游離脯氨酸的積累有效緩解Cr6+脅迫導(dǎo)致的細(xì)胞滲透調(diào)節(jié)失衡，進(jìn)而提高白三葉種子在Cr6+脅迫下的萌發(fā)能力。

金屬離子毒害同時(shí)會(huì)引起植物細(xì)胞大量產(chǎn)生活性氧，活性氧過(guò)量積累致使細(xì)胞膜發(fā)生氧化損傷，細(xì)胞透性增加，進(jìn)而影響植物正常生長(zhǎng)發(fā)育[30,42]。Cr6+脅迫下，植物葉片膜脂過(guò)氧化產(chǎn)物MDA 含量顯著升高，細(xì)胞膜氧化傷害增大，植物生長(zhǎng)受損嚴(yán)重[43-44]。本研究中，Cr6+脅迫下白三葉種子萌發(fā)時(shí)相較于CK 組其O2·?產(chǎn)生速率、H2O2含量、MDA 含量和EL 顯著升高，經(jīng)DA-6 浸種后脅迫下O2·?產(chǎn)生速率、H2O2含量、MDA 含量和EL 較Cr6+脅迫均顯著下降，表明DA-6 浸種有效緩解了Cr 脅迫導(dǎo)致的細(xì)胞氧化傷害。正常條件下，植物體內(nèi)活性氧物質(zhì)的產(chǎn)生與分解處于動(dòng)態(tài)平衡，當(dāng)其受到Cr 等重金屬離子脅迫時(shí)，會(huì)破壞細(xì)胞氧化還原平衡。植物為抵御氧化傷害會(huì)激活SOD、CAT、POD 等抗氧化酶以及參與抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)的關(guān)鍵酶(APX、DR、GR 和MR)。SOD 能將超氧陰離子歧化生成H2O2和無(wú)毒的氧，是抵御活性氧的第一道防線[45]。H2O2被POD 和CAT 進(jìn)一步催化生成氧和水，過(guò)量的超氧陰離子得到清除，從而有效減輕了活性氧在細(xì)胞內(nèi)的積累[46]。已有研究表明，處于Cr6+脅迫下植物的抗氧化酶活性會(huì)出現(xiàn)先增高后降低的趨勢(shì)[47-48]，其原因?yàn)楫?dāng)Cr6+濃度較低時(shí)，Cr6+作為信號(hào)分子啟動(dòng)植物抗氧化防御機(jī)制，當(dāng)Cr6+濃度較高時(shí)，抗氧化酶活性則會(huì)逐漸下降。已有研究表明，使用DA-6 處理草莓可提高草莓在不同光強(qiáng)下的抗氧化酶活性，降低O2·?產(chǎn)生速率，防止活性氧對(duì)細(xì)胞膜系統(tǒng)和葉綠素結(jié)構(gòu)的破壞[49]；DA-6 處理多年生黑麥草(Lolium perenne)可提高多年生黑麥草在Cd2+脅迫下的抗氧化酶活性，降低活性氧自由基濃度，從而緩解重金屬Cd 脅迫造成的膜脂過(guò)氧化加劇現(xiàn)象[50]。本研究中，Cr6+脅迫下O2·?產(chǎn)生速率和H2O2含量顯著提高，表明Cr6+脅迫使種子萌發(fā)時(shí)受到氧化傷害，但白三葉自身可通過(guò)提高CAT 和DR 活性來(lái)減緩脅迫傷害。經(jīng)DA-6 浸種后白三葉在Cr6+脅迫下萌發(fā)過(guò)程中抗氧化酶(SOD、POD 和CAT) 及抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)關(guān)鍵酶(APX、DR、GR 和MR) 活性均較Cr6+脅迫顯著增強(qiáng)，同時(shí)O2·?產(chǎn)生速率和H2O2含量顯著降低，表明DA-6 可增強(qiáng)白三葉清除活性氧自由基的能力，進(jìn)而有效緩解了活性氧對(duì)細(xì)胞膜的傷害，提高種子在萌發(fā)期的耐Cr 性。

綜上所述，Cr6+脅迫顯著抑制白三葉種子萌發(fā)及其根莖生長(zhǎng)，適宜濃度(40、60、100 mmol·L?1)的DA-6 浸種處理可顯著提高白三葉種子在Cr6+脅迫下的萌發(fā)特性，其中60 mmol·L?1處理效果最佳。但高濃度的DA-6 (200 mmol·L?1)浸種處理則進(jìn)一步加劇白三葉種子的受脅迫程度。表明DA-6 提高白三葉種子萌發(fā)期抗性的效應(yīng)具有低濃度促進(jìn)、高濃度抑制的特點(diǎn)，類似于其他植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑。在7.5 mmol·L?1Cr6+脅迫下，60 mmol·L?1DA-6 浸種處理提高了白三葉種子萌發(fā)期可溶性糖和游離脯氨酸含量，并降低細(xì)胞滲透勢(shì)，進(jìn)而有效維持滲透平衡。此外，DA-6 通過(guò)提高抗氧化酶及抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)關(guān)鍵酶活性，增強(qiáng)白三葉清除活性氧自由基的能力，有效緩解了細(xì)胞氧化損傷，從而使種子萌發(fā)期的耐Cr 性得到提高。