紫花苜蓿內生細菌的拮抗作用及優良拮抗菌株的鑒定和生物功能

劉彥超，張貞明，金夢軍，施兆榮，崔凌霄，魏立娟，仲健新，楊成德

（1. 甘肅農業大學植物保護學院，甘肅 蘭州 730070；2. 甘肅省林業和草原局，甘肅 蘭州 730070）

紫花苜蓿(Medicago sativa)是發展畜牧業的重要基礎，有“牧草之王”的美譽，在世界各國廣泛種植[1]。隨著紫花苜蓿種植年限不斷增長，種植面積不斷擴大，苜蓿病害成為影響產業發展的重要問題，其中根腐病是苜蓿栽培中的主要病害之一，在美國、加拿大、澳大利亞、俄羅斯、日本、阿根廷和中國苜蓿主要種植區均嚴重發生[2]。紫花苜蓿根腐病多由鐮刀菌(Fusariumspp.)引起，已報道的35 種苜蓿根腐病病原中鐮刀菌達20 種[3]。鐮刀菌產生的病害主要采取農業和化學藥劑防治，其中，培育抗病品種是防治根腐病最有效的方法，但該病害的病原物比較復雜，因此苜蓿抗病品種的選育較為困難[4]；化學防治在病害防治中效果顯著，但長期、反復和大量使用農藥會加劇環境污染問題，并且使病原物產生抗藥性，與生態農業的發展目標相悖。微生物菌劑主要是利用自然界中微生物對病原菌的抗生作用、誘導產生系統抗性等來減少病原菌數量或提高寄主植物的抗病性。目前，利用植物內生細菌進行生物防治已成為研究熱點之一。

植物內生細菌廣泛定殖在植物體內，是會與植物建立和諧共生關系的一類微生物[5]。內生細菌可以提高植物對惡劣環境的適應能力，保證植物系統的生態平衡和健康發展，具有廣泛的生物學作用，是不可多得的天然生物資源[6]。倪婕等[7]發現從白骨壤分離得到的內生細菌多樣性較豐富，且部分具有廣譜抑菌活性；李小杰等[8]從煙草根莖中分離、篩選出9 株對煙草(Nicotiana tabacum)青枯病菌(Ralstonia solanacearum)具有拮抗效果的菌株，并且在溫室盆栽試驗中發現菌株Rsa3 發酵液的防病效果可達79.17%，同時能夠促進煙草苗根系生長；金夢軍等[9]從青藏苔草內生細菌中篩選出具有廣譜抑菌活性的菌株1Y4，對馬鈴薯炭疽病菌(Colletotrichum coccodes)和孜然根腐病菌(Fusarium solani)的抑菌率分別高達71.43%和73.33%，其固體發酵菌劑對黃瓜(Cucumis sativus)和辣椒(Capsicum annuum)均具有明顯的促生效果。為此，本研究通過分離紫花苜蓿內生細菌，篩選、鑒定紫花苜蓿根腐病菌(Fusarium chlamydosporum)的優良拮抗菌株，并測定優良拮抗菌株的固氮、溶磷(無機磷)和分泌生長素(IAA)的能力，以期為苜蓿根腐病的生物防治提供菌種資源和依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

紫花苜蓿于2020 年6 月在甘肅農業大學校園內(103°42′26″ E，36°5′48″ N)采集，并對根、莖和葉內生細菌進行分離和保存。

1.1.2 供試指示菌

辣椒根腐病菌尖孢鐮刀菌 (F. oxysporum)、紫花苜蓿根腐病菌厚垣鐮孢菌(F. chlamydosporum)、茄鐮孢菌(F. solani)、黃瓜枯萎病菌(F. oxysporum)、馬鈴薯枯萎病菌(F. oxysporum)、核桃枝枯病菌[燕麥鐮刀菌(F. avenaceum)和銳頂鐮刀菌(F. acuminatum)]均由甘肅農業大學植物保護學院植物病原細菌及細菌多樣性實驗室提供。

1.1.3 供試培養基

供試培養基分別為肉汁胨培養基(nutrient agar，NA)[9]、馬鈴薯葡萄糖培養基(potato dextrose agar，PDA)[9]、金 氏 培 養 基(King)[10]、Pikovaskaia 培 養基(pikovaskaia’s，PKO)[9]、阿 須 貝 無 氮 培 養 液(ashby nitrogen-free, Ashby)[10]。

1.2 方法

1.2.1 內生細菌的分離和純化

將紫花苜蓿表面用滅菌蒸餾水清洗干凈，用滅菌后的濾紙吸干表面水分，稱取1 g 在無菌條件下用75%酒精表面消毒30 s，用無菌水沖洗5 次后再用0.1% 升汞表面消毒2～3 min，再次用無菌水沖洗5 次，徹底消毒后放入研缽，加入適量石英砂和5 mL 生理鹽水研磨，靜置數分鐘，取上清液梯度稀釋為10?1、10?2和10?3不同倍數的稀釋液，每個梯度的稀釋液各取0.1 mL 涂布于NA 培養基上，以最后一次洗滌水為對照，設置3 次重復，28 ℃培養3～5 d，通過觀察進行分類保存備用[11]。

1.2.2 優良拮抗菌株的篩選

采用平板對峙法[10]測定抑菌效果。將供試指示菌紫花苜蓿根腐病菌接種于PDA 培養基上，25 ℃培養7 d 后于菌落邊緣打取5 mm 直徑的圓形菌餅，接種于PDA 培養基平板中央，在距菌餅四周30 mm處分別點接供試內生細菌，以只接種病原菌為對照，設置3 次重復，置于25 ℃條件下培養7 d 后，采用十字交叉法測量病原菌菌落直徑并計算抑菌率[10]，并對優良拮抗菌株進行抑菌譜測定，方法與拮抗菌株篩選方法相同。

1.2.3 優良拮抗菌株的生物功能測定

固氮能力測定：將震蕩培養所得到的菌懸液接種于阿須貝無氮培養液中，并將細菌點接在阿須貝無氮平板上，7 d 后觀察平板上是否有菌落以及液體培養基是否變渾濁，具體步驟參見文獻[12]。

溶磷能力測定：將待測菌株涂布于Pikovaskaia培養基上，28 ℃條件下培養14 d，觀察有無解磷圈以及解磷圈大小，確定菌株解磷能力，具體步驟參見文獻[13]。

產IAA 能力測定：采用Salkowski 比色法測定菌株是否具有產IAA 的能力，具體步驟參見文獻[13]。

1.2.4 優良拮抗菌株的鑒定

培養性狀及形態觀察：將內生細菌接種于NA培養基上，在28 ℃條件下培養，將連續培養12 h 的細菌進行革蘭氏染色，顯微觀察菌體特征，將連續培養72 h 后的細菌進行菌落形態特征的觀察。

16S rDNA 基因序列分析：利用TIANGEN 細菌基因組DNA 試劑盒提取拮抗菌株DNA，并用引物27F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′) 進 行PCR 擴增，PCR 擴增反應體系為50 μL：2×TSINGKE Master Mix 25 μL、DNA 2 μL、上下游引物各2 μL、雙蒸水19 μL；擴增程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min，48 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，32 個循環；72 ℃延伸8 min。之后，將PCR 產物送蘭州天啟基因生物科技有限公司測序，將測序結果導入EzBioCloud數據庫進行BLAST 比對，使用Mega7.0 軟件構建系統發育樹，確定其系統發育學地位。

1.3 數據分析

采用Excel 2010 進行數據整理，采用SPSS 17.0軟件對數據進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 內生細菌的分離和純化

根據菌落形態、顏色等特征，從紫花苜蓿莖部、根部共分離純化得到80 株內生細菌，編號為MS-1，MS-2，…，MS-80。

2.2 優良拮抗菌株的篩選

80 株內生細菌中有39 株對紫花苜蓿根腐病菌抑菌率在50%以上，占分離菌株總數的48.75%，抑菌率介于55.63%～63.96%；9 株抑菌率在61%以上，分 別 為MS-43 (63.96%)、 MS-40 (63.75%)、MS-46(63.54%)、 MS-2 (63.13%)、 MS-31 (62.29%)、MS-52(62.08%)、MS-80 (61.88%)、MS-55 (61.46%)和MS-33(61.25%)，后續對部分內生細菌的抑菌譜進行了測定(表1)。

表1 部分內生細菌對厚垣鐮孢菌的抑菌能力測定Table 1 Inhibitory activity of endophytic bacteria against Fusarium chlamydosporum

經抑菌譜測定，初步篩選出的5 株苜蓿內生細菌對6 株植物病原真菌有不同的拮抗作用，由圖2可明顯看出，6 種病原菌與5 株內生細菌對峙培養時，抑菌帶寬度有明顯差異。MS-43 對尖孢鐮刀菌(辣椒)的拮抗作用最大，抑菌率達62.50%；MS-43 對茄鐮孢菌的抑菌作用最大，抑菌率達60.63%；MS-43對銳頂鐮孢菌的抑菌率最高，為70.63%；MS-43 對燕麥鐮孢菌的抑菌率最高，為70.42%；MS-43 對黃瓜枯萎病菌的抑制作用最大，抑菌率達65%；MS-43 對馬鈴薯枯萎病菌的抑制效果較大，抑菌率為67.50%。總體上，MS-43 對6 株植物病原真菌的抑菌率均高于其他4 株內生細菌，其對燕麥鐮孢菌的抑菌率最高，對其他5 株病原菌的抑菌率均在60%以上，其次為MS-33，抑菌率均高于60% (表2)。該結果說明內生細菌MS-43 抑菌性強，抑菌譜廣，具有開發潛力。

表2 紫花苜蓿優良拮抗內生細菌的抑菌率Table 2 Antibacterial spectra of excellent antagonistic endophytic bacteria in alfalfa%

圖2 紫花苜蓿優良拮抗內生細菌對病原菌的抑菌作用Figure 2 Inhibition of fungal pathogens by antagonistic endophytic bacteria in alfalfa

圖1 紫花苜蓿內生拮抗細菌對紫花苜蓿根腐病菌的抑菌作用Figure 1 Inhibition of Fusarium chlamydosporum by antagonistic endophytic bacteria

2.3 優良拮抗菌株的生物功能測定

內生細菌MS2、MS31、MS33、MS40、MS43、MS46、MS52、MS55 和MS80 均具有固氮能力，不具解無機磷能力，MS-43 具有分泌IAA 能力(表3)。

表3 紫花苜蓿內生細菌的生物功能測定Table 3 Determination of the biological functions of endophytic bacteria in alfalfa

2.4 優良拮抗菌株對菌絲生長的影響

對峙培養后，挑取與菌株MS-43 交界處的紫花苜蓿根腐病菌菌絲于顯微鏡下觀察，菌株MS-43 對紫花苜蓿根腐病菌菌絲的生長具有顯著影響。與對照正常生長的根腐病菌菌絲相比，受菌株MS-43抑制的根腐病菌菌絲易斷裂，且有彎曲變形現象(圖3)。

圖3 對峙培養時菌株MS-43 對紫花苜蓿根腐病菌菌絲生長的影響Figure 3 Inhibitory effect of strain MS-43 on the mycelial morphology of Fusarium chlamydosporum

2.5 優良拮抗菌株的鑒定

2.5.1 培養性狀

菌株MS-2 為淡黃色，其他8 菌株均為乳白色。菌株MS-46 菌落直徑最小，為2 mm；菌株MS-31 和MS-55 的菌落直徑相對較大，為3 mm；其他菌株直徑在2.5～2.8 mm。菌株MS-2、MS-40、MS-80 邊緣整齊近圓形，其他5 株邊緣不整齊呈不規則狀，其中MS-46 呈棉絮狀；菌株MS-2、MS-43 表面光滑圓潤有光澤呈粘稠狀，菌株MS-55 表面平整雪花狀，其他菌株表面菌粗糙有褶狀突起(表4、圖4)。

圖4 內生細菌培養性狀Figure 4 Culture characteristics of endophytic bacteria

2.5.2 形態特征

9 株拮抗內生細菌均為桿狀革蘭氏陽性菌；MS-2 菌體長達3.09 μm，其次為MS-80，為3.07 μm，MS-43 菌體最短，為1.83 μm；MS-31 和MS-55 菌體較寬，為0.67 μm，MS-2 和MS-33 菌體較窄，為0.50 μm(表4、圖5)。

圖5 內生細菌的革蘭氏染色Figure 5 Gram staining of endophytic bacteria

2.5.3 16SrDNA 基因序列分析

將測序結果與EzBioCloud 數據庫中的序列比對，構建系統發育樹后發現菌株MS-43 與類芽胞桿菌屬的Paenibacillus maysiensis(JN873138.2) 一致性達100%，初步將菌株MS-43 鑒定為類芽孢桿菌(圖6)。

圖6 內生細菌Ms-43 與類芽孢桿菌菌株之間關系的系統發育樹Figure 6 A phylogenetic tree showing relationships between the endophytic bacterium MS-43 and strains of Paenibacillus species

3 討論與結論

本研究首次從紫花苜蓿莖部、根部分離篩選對紫花苜蓿根腐病菌(F. chlamydosporum)有抑制作用的拮抗內生細菌，結果表明，分離純化出的9 株內生細菌對紫花苜蓿根腐病菌等多種鐮刀菌有明顯抑制作用，具有廣譜抑菌活性，其中菌株MS-43 對紫花苜蓿根腐病菌的抑制效果最佳，廣譜抑菌活性最高，同時具有固氮能力和分泌IAA 的能力，經鑒定屬于類芽孢桿菌屬。

苜蓿根腐病是重要的土傳病害，且病原種類復雜，防治較為困難，已有的防治方法主要為化學防治，但化學防治會造成環境污染等問題，而生物防治紫花苜蓿根腐病可以克服這一缺點。生物防治紫花苜蓿根腐病的相關研究和報道相對較多，胡進玲等[14]報道了兩株對紫花苜蓿根腐病(F. solani和F.oxysporum)具有較強抑制效果的芽孢桿菌菌株；曾亮等[15]首次報道了從苜蓿根際土壤中分離得到的對紫花苜蓿根腐病病原菌抑菌率較高的菌株ZY56 和GY37，經鑒定分別為哈茨木霉(Trichoderma harzianum)和康寧木霉(Trichoderma koningii)，并進行了盆栽防效試驗，結果表明，ZY56 對盆栽苜蓿根腐病的防效達到66.4%，且促進生根效果明顯，GY37防治效果為55.1%。本研究在前人研究的基礎上首次從紫花苜蓿內生細菌中篩選生物防治紫花苜蓿根腐病菌(厚垣鐮孢菌)的優良拮抗菌株MS-43。植物內生細菌種類繁多，在植物不同部位均可分離得到，因其可以誘導植物產生抗病性，并對植物生長有促進作用，因此是植物病害生物防治中重要的微生物資源庫，具有重要研究意義。目前已經從多種植物中分離得到內生拮抗細菌，本研究從紫花苜蓿體內共分離獲得80 株內生細菌，與陳孝利[16]分離純化獲得的409 株苜蓿內生細菌相比，本研究獲得的菌株數量較少，其原因可能與選取的苜蓿品種較單一以及采用不同苗期的苜蓿有關。目前以內生細菌作為生防菌劑已經成為生防菌劑研制開發的熱點，如Wen 等[17]從苜蓿根部分離篩選出的枯草芽孢桿菌MB29 可以抑制多種苜蓿根腐病菌的生長，同時對苜蓿的生長有明顯的促進作用；劉莎莎等[18]報道，從紫花苜蓿根際土壤中篩選出的芽孢桿菌CYY-6 和CYY-42 對尖孢鐮刀菌有拮抗作用，抑菌率分別為49.30%和56.30%。本研究從紫花苜蓿莖、葉內分離得到的菌株MS-43 對紫花苜蓿根腐病菌的抑菌率達63.96%，效果優于CYY-6 和CYY-42。

菌株MS-43 經鑒定屬于類芽孢桿菌屬，因植物內生細菌中的芽孢桿菌可以產生具有較強抗逆性的芽孢，因此被各領域廣泛應用，類芽孢桿菌是一種產芽孢的G+植物非致病性細菌，具有分泌植物激素和提供氮素等功能，可促進植物生長[19]，可產生豐富的代謝化合物，尤其是拮抗微生物類的脂肽化合物，其生防機制與脂肽化合物有關[20]，受菌株MS-43抑制的根腐病菌菌絲易斷裂，且有彎曲變形現象，培養過程中菌株MS-43 可能產生一些抑制苜蓿根腐病菌菌絲生長的代謝產物，或產生營養競爭現象，其具體作用機理需要進一步的研究。

本研究從紫花苜蓿植物體內分離得到的類芽孢桿菌屬菌株MS-43 對多種鐮刀菌具有較好的抑菌作用，同時有固氮能力和分泌生長素的能力，具有一定的商業開發潛力，也為紫花苜蓿根腐病的生物防治提供了新的微生物資源。