弱后酸發(fā)酵劑菌株篩選及復配應用研究

馮麗莉，張棟，劉堯堯，李建磊，李艷娟，馬蕊，賈洪利，王世杰

（1.石家莊君樂寶乳業(yè)有限公司，石家莊 050221；2.河北一然生物科技有限公司，石家莊 050800）

0 引言

酸奶是以生牛乳為主要原料，經過殺菌后在發(fā)酵劑的作用下保溫發(fā)酵得到的凝固或非凝固狀態(tài)的乳制品[1]。酸奶發(fā)酵劑是一種以乳酸菌為主要成份的微生物培養(yǎng)物。發(fā)酵劑的發(fā)酵特性主要包括產酸、產香、產黏等[2]，其中產酸是發(fā)酵劑最重要的發(fā)酵特性。但正常的發(fā)酵結束后，酸奶中的菌體持續(xù)產生乳酸引起產品pH 值降低，產生難以接受的過酸味，被稱為后酸化（Postacidification）[3]。目前解決后酸化的措施主要為冷鏈運輸[4-5]和添加乳酸鏈球菌素[6-7]等。但我國目前尚未形成完整的食品冷鏈體系且添加乳酸鏈球菌素易對酸奶產品品質產生影響并提高生產成本[8]。因此，控制酸奶后酸化的最佳途徑是篩選能在發(fā)酵條件下快速產酸，在低溫條件下產酸量較低的菌株[9-10]。所以，篩選具有優(yōu)良特性的乳酸菌并進行發(fā)酵劑開發(fā)是生產優(yōu)質酸奶的關鍵。

本研究旨在從自有菌庫中篩選發(fā)酵特性優(yōu)良的菌株，并將其通過合理配比得到一種整體發(fā)酵特性強、弱后酸化突出的的酸奶發(fā)酵劑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原料乳，石家莊君樂寶乳業(yè)有限公司；菌株，石家莊君樂寶乳業(yè)有限公司研發(fā)管理中心菌種資源庫；MRS培養(yǎng)基，北京陸橋。

1.2 設備

電子天平，賽多利斯科學儀器；恒溫培養(yǎng)箱，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；超凈工作臺，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；立式壓力蒸汽滅菌器，日本YAMATO；pH 計，梅特勒-托利多集團；pH 在線監(jiān)測儀，法國ALLIANCE 公司；7890A—5975C 氣相色譜質譜聯(lián)用儀，美國安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)酵劑單菌株的篩選

實驗前期，從石家莊君樂寶乳業(yè)有限公司菌種資源庫（以下簡稱本公司菌種資源庫）的800 余株菌種中挑選活力較好的嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌共66株，初篩得到13 株優(yōu)異菌株，分別活化后編號1～13，各按1% 的接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基中，在37 ℃條件下培養(yǎng)48 h，將培養(yǎng)好的13 株菌株以轉速3 500 r/min，4 ℃離心10 min，滅菌生理鹽水清洗一次，分別用滅菌脫脂奶（滅菌條件：115 ℃，15 min）混勻，以10%接種量于37 ℃進行單菌株發(fā)酵，共發(fā)酵16 h。以pH值、酸度、黏度、活菌數(shù)、質構、凝乳發(fā)酵時間等指標為標準，篩選具備不同優(yōu)良發(fā)酵特性的發(fā)酵菌株。

1.3.2 發(fā)酵劑菌株復配

將篩選得到的菌株按照不同的比例復配后發(fā)酵，共復配3 種配方，編號為I、II、III。取商業(yè)發(fā)酵劑作為對照組，編號為Ⅳ，將發(fā)酵劑I～Ⅳ分別進行中試發(fā)酵，發(fā)酵步驟為：分別稱取鮮牛乳920 g、白砂糖75 g、其他輔料5 g，在水浴中加熱攪拌使其充分融化，達65 ℃時，20 MPa 條件下均質，95 ℃滅菌10min，降溫至42 ℃左右，接種發(fā)酵劑I～III（約10 g/kg），42 ℃發(fā)酵至pH 值為4.5 終止發(fā)酵，破乳后放入4 ℃冷藏24 h 后熟，召集感官評價17 名人員對其進行綜合評價。整體口感喜好度用9 點強度標度法（9→1 表示喜歡→不喜歡，＜5 表示不被喜歡），其它感官特性用10 點強度標度法（10→0 表示極強→察覺不到）。采用此方法對上述發(fā)酵乳樣品進行整體喜好度、香氣、甜味、酸味、黏稠度、細膩度等指標評價[11]。

1.3.3 發(fā)酵劑產酸測定

將活化好的單菌株按1%接種量接種于MRS 液體培養(yǎng)基中，37 ℃條件下培養(yǎng)48 h，將培養(yǎng)好的菌株4 ℃，轉速為3 500 r/min 離心10 min，滅菌生理鹽水清洗一次，按篩選出的配方接種至滅菌脫脂奶混勻，采用pH 在線監(jiān)測發(fā)酵劑在滅菌乳中的pH 值變化情況。

將發(fā)酵后的酸奶，在分別在4，15，30，37 ℃放置；分別取0，7，14，21，28 d 測定發(fā)酵乳的活菌數(shù)、pH 值、酸度。其中酸度的測定采用GB 5413.34-2010 中第二法進行[12]。計算公式如下：

式中：X2為試樣的酸度（°T）；c2為氫氧化鈉標準溶液的濃度（mol/L）；V2為滴定時消耗氫氧化鈉標準溶液體積（mL）；m2為試樣的質量（g）；0.1 為酸度理論定義氫氧化鈉的濃度（mol/L）。

1.3.4 發(fā)酵劑產香物質分析

采用SPME 固相微萃取方式對發(fā)酵樣品進行產香物質分析，分別取酸奶樣品7 mL，加入1 mL 飽和NaCl 溶液，60 ℃條件下用50/30 μm 的DVB/CAR/PDMS萃取頭頂空恒溫萃取30 min，然后再將萃取頭在250 ℃進樣口熱解析5 min，進樣，進行GC-MS解析。

（1）GC 條件。色譜柱：DB-WAX 聚乙二醇色譜柱；升溫程序起始溫度為35 ℃，保持6 min。然后以8 ℃/min的速率升至80 ℃，保持2 min。再以5 ℃/min的速度升至110 ℃，最后以10 ℃/min 的速率升至210 ℃，保留10 min；載氣（He）流速1.0 mL/min；進樣口溫度：250 ℃。

（2）MS 條件。EI 離子源：電子轟擊能量70 eV；離子源溫度：230 ℃。

2 結果與分析

2.1 單菌株發(fā)酵特性分析

產酸速率是乳酸菌最關鍵的發(fā)酵特性[13]。在酸奶的工業(yè)化生產中，《GB 19302—2010 食品安全國家標準 發(fā)酵乳》對終產品的要求為酸度/（°T）≥70.0[14]，因此，產酸速度快、產酸量大是篩選發(fā)酵劑菌種的重要指標。表1 結果顯示了自本公司菌種資源庫篩選出的66 株自有菌株中，優(yōu)選得到13 株，單菌株分別發(fā)酵16 h 后的不同pH 值。表中數(shù)據(jù)可以看出，菌株7的最終pH 最低，表明其在16 h 時間內產酸能力最強，而菌株13 的最終pH 值最高，在上述篩選菌株中產酸能力最弱。

酸奶的質構和風味也是判斷乳酸菌發(fā)酵特性的重要標準[15-16]。表1 結果顯示了13 株自有菌株單株發(fā)酵后的質構特性和風味香氣特性，結果表明4、11 號菌株發(fā)酵后樣品質構好，并有奶油香。12 號樣品拉絲性強。13號后酸弱，口味清淡。

表1 單菌株發(fā)酵特性結果

通過各單菌株的發(fā)酵特性比較，篩選出產酸正常、質構較好、香氣有特點的4 個單菌株，分別為第4，11，12，13號作為發(fā)酵劑的復配單菌株備用。

2.2 不同菌株組合發(fā)酵特性分析

將4 個單菌株進行不同比例組合發(fā)酵劑配方，組合發(fā)酵劑3 個，分別為：將上述配方復配發(fā)酵劑Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，感官評價結果顯示，經復配發(fā)酵劑發(fā)酵制備的樣品II 酸度最高、pH 值最低，表明在4 種復配發(fā)酵劑中，發(fā)酵劑II 的產酸能力最強，綜合各項指標，對4 組發(fā)酵樣品的整體評價為：Ⅲ＞Ⅰ＞Ⅱ。各復配發(fā)酵劑發(fā)酵特性結果，見表2。

表2 各復配發(fā)酵劑發(fā)酵特性結果

9 點強度標度法對發(fā)酵樣品的整體口感喜好度進行評價分析，數(shù)據(jù)分析用配對T 檢驗，圖1 為整體喜好及各指標平均值的雷達圖。由圖1 可以看出，在5%顯著性水平上，整體喜好度綜合排序為Ⅲ＞Ⅰ＞Ⅱ。3組樣品的整體口感喜好度無顯著性差異。這一結果表明，3 組發(fā)酵樣品中，Ⅲ號發(fā)酵樣品的整體喜好度偏高，香氣最強，酸味和甜味適中，即Ⅲ號發(fā)酵劑的發(fā)酵效果最佳，適合用于制備口感、品質優(yōu)良的發(fā)酵酸奶。

圖1 復配發(fā)酵劑的感官評分

2.3 發(fā)酵劑產酸

篩選得到的Ⅲ號發(fā)酵劑命名為JLB-1510，取商業(yè)化發(fā)酵劑作為對照，利用兩種發(fā)酵劑分別進行發(fā)酵，6 h左右后發(fā)酵達到pH＜4.5時停止發(fā)酵，將JLB-1510發(fā)酵得到的樣品記為實驗組，商業(yè)化發(fā)酵劑發(fā)酵得到的樣品記為對照組。將發(fā)酵好的樣品分別放置于4 ℃、15 ℃、室溫和30 ℃環(huán)境，分別在發(fā)酵后20 h、2 d、3 d、5 d、7 d、11 d、15 d、19 d、21 d 檢測其pH 值，發(fā)酵后2、3、5、7、11、15、19、21 d檢測其酸度，共21 d。

通過21 天得到的階段數(shù)據(jù)顯示，在保質期內，實驗組和對照組樣品在pH、酸度、黏度指標上無顯著差異，但具體結果顯示：恒溫4 ℃條件下，21 d 內實驗組樣品的pH 值始終高于對照組，除第5 天、第11 天以外，實驗組樣品的酸度之均低于對照組；恒溫15 ℃條件下，21 d 內實驗組樣品的pH 值始終高于對照組，酸度值低于對照組；室溫條件下，21 d 內實驗組樣品的pH 值始終高于對照組，除第15 天以外，其余時間實驗組樣品的酸度均低于對照組；恒溫30 ℃條件下，第15天實驗組pH 值低于對照組，其余均高于對照組，第5天實驗組酸度高于對照組，其余均低于對照組。上述結果表明，在不同溫度條件下，JLB-1510 發(fā)酵劑后酸較弱，能較好地保持發(fā)酵乳制品風味。

2.4 發(fā)酵乳香氣物質分析

乳酸菌在發(fā)酵過程中會產生多種風味物質，主要包括乙醛、乙酸、乙偶姻、丙酮等[17-18]，這些物質作為揮發(fā)性有機芳香成分形成酸奶終產品的典型風味[19-20]。以JLB-1510 為1#，商業(yè)發(fā)酵劑為2#，分別中試發(fā)酵乳后，對兩個中試樣品的香氣物質進行分析，實驗結果見圖3、表3。

表3 主要風味物質的峰面積響應值及香氣描述

對比圖3 中兩個樣品的色譜圖，香氣物質組成基本一致，都含有：醛酮類（乙醛、丁二酮、戊二酮、2-庚酮、乙偶姻），和揮發(fā)性的酸類（乙酸、丁酸、己酸、辛酸、癸酸）。對比峰面積的響應值，2#樣品中醛酮類物質都要略高于1#樣品，說明2#樣品表現(xiàn)的奶油、黃油樣的香氣略強于1#樣品；然而，1#樣品中的己酸、癸酸和辛酸的響應值比2#樣品偏高，說明1#樣品表現(xiàn)出的油脂、奶酪樣香氣更為濃郁?？傮w而言，兩個樣品的香氣物質構成一致，整體香氣風味接近，但兩個樣品也略有微小差異，1#樣品油脂、奶酪香更濃郁，2#樣品奶油、黃油樣香氣更濃。

圖3 香氣物質分析

以上結果表明，由JLB-1510 發(fā)酵制備的1#樣品與商業(yè)發(fā)酵劑發(fā)酵制備的2#樣品香氣物質構成一致，整體香氣風味接近，但兩個樣品仍存在差異，其中1#樣品油脂、奶酪香更濃郁，2#樣品奶油、黃油樣香氣更濃。

圖2 不同溫度條件下發(fā)酵樣品產酸情況

3 結論

本研究挖掘本公司菌種庫種發(fā)酵性能優(yōu)良的單菌株，并按其發(fā)酵特性進行不同比例的復配，開發(fā)了一種弱后酸化的酸奶發(fā)酵劑JLB-1510。本研究開發(fā)的發(fā)酵劑JLB-1510，發(fā)酵制備的酸奶香氣清淡、感官評價結果良好，與傳統(tǒng)商業(yè)化發(fā)酵劑制備的酸奶相比，能在4 ℃、15 ℃、常溫、30 ℃不同的溫度環(huán)境中，21 d 時間內維持較低的酸度和較高的pH 值，是一款發(fā)酵性能優(yōu)良的弱后酸化酸奶發(fā)酵劑，可應用于發(fā)酵酸奶的工業(yè)化生產，并提高發(fā)酵乳的口感和品質。為解決我國冷鏈運輸系統(tǒng)不完善，發(fā)酵酸奶的銷售半徑受限制[21]和酸奶發(fā)酵劑長期依賴于國外進口[22]的現(xiàn)狀提供了實驗數(shù)據(jù)。