羅漢果質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高研究*

張 萌，黃華花，陳景海，呂詩(shī)詩(shī)

（1.廈門(mén)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系/廈門(mén)市中藥生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/福建省中藥精加工與健康產(chǎn)品開(kāi)發(fā)重點(diǎn)研究室，福建 廈門(mén) 361023；2.廈門(mén)大學(xué)附屬婦女兒童醫(yī)院/廈門(mén)市婦幼保健院，福建 廈門(mén) 361003）

羅漢果為葫蘆科植物羅漢果[Siraitia grosvenorii（Swingle）C.Jeffrey ex A.M.Lu et Z.Y.Zhang]的干燥果實(shí)。羅漢果是一種傳統(tǒng)中藥，應(yīng)用歷史悠久，是首批被國(guó)家衛(wèi)生部公布的藥食兩用中藥材。羅漢果中含有皂苷、黃酮和多糖等成分，研究表明羅漢果皂苷具有調(diào)節(jié)血糖[1]、止咳祛痰[2]、潤(rùn)腸通便[3]、抗炎[3]、抗過(guò)敏[4]、提高免疫[5-6]等作用，羅漢果黃酮具有抑菌[7-8]、調(diào)節(jié)血糖[9]、抗疲勞[10]等作用，羅漢果多糖具有抗氧化作用[11]。因此，羅漢果皂苷和黃酮為羅漢果的主要活性成分。

目前關(guān)于羅漢果質(zhì)量控制研究情況如下：《中華人民共和國(guó)藥典》（2015年版）一部收載的該藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[12]、張彥東等[13]建立的該藥材配方顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和屠寒等[14]研究的羅漢果復(fù)方制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中均僅檢測(cè)了羅漢果苷V；鐘名誠(chéng)等[14-15]建立的該藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中增加了多糖、總糖的含量測(cè)定。由此可見(jiàn)，羅漢果的質(zhì)量控制存在著檢測(cè)指標(biāo)單一、專(zhuān)屬性不強(qiáng)的問(wèn)題。故本研究擬在現(xiàn)有研究[15-16]基礎(chǔ)上，以黃酮、皂苷類(lèi)成分為指標(biāo)，建立多成分的定量和定性方法，使羅漢果的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)得到完善和提高，有利于對(duì)其質(zhì)量進(jìn)行有效地控制。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters Acquity型UPLC儀（美國(guó)Waters公司）；BS224S型、CPA225D型電子天平（德國(guó)賽多利斯公司）；KQ5200E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；WD-9403C型紫外儀（北京市六一儀器廠）。

1.2 試藥與試劑 11批羅漢果樣品信息見(jiàn)表1。羅漢果黃素（批號(hào)：181227）、山奈酚-3,7-O-α-L-二鼠李糖苷（批號(hào)：190319）、羅漢果皂苷V（批號(hào)：190126）純度均＞98%，均購(gòu)自上海融禾醫(yī)藥科技有限公司；乙腈為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

表1 樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層鑒別 取羅漢果粉末1 g，加水50 mL，超聲（40 kHz，900 W）提取30 min，濾過(guò)，取濾液20 mL，加正丁醇萃取2次，每次20 mL，得正丁醇液，合并，回收，殘?jiān)? mL甲醇復(fù)溶，作為供試品溶液。另取羅漢果皂苷V、羅漢果黃素和山奈酚-3,7-O-α-L-二鼠李糖苷對(duì)照品，分別加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。按照薄層色譜法（TLC）2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》[16-17]操作，吸取上述4種溶液各2 μL，點(diǎn)于同一硅膠G板上，以正丁醇-乙醇-水（8∶2∶3）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，晾干，噴以5%AlCl3乙醇液，105 ℃加熱1 min，紫外光365 nm下檢視。結(jié)果供試品色譜中，在與羅漢果黃素和山奈酚-3,7-O-α-L-二鼠李糖苷對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，見(jiàn)圖1A；再?lài)娨?%香草醛溶液（以10%硫酸乙醇為溶劑），加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，再檢視，結(jié)果供試品色譜中，在與羅漢果皂苷V對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，見(jiàn)圖1B。

圖1 TLC 色譜圖

2.2 含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Waters Acquity UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.2%磷酸（B），梯度洗脫及流速見(jiàn)表2；柱溫：35 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：203 nm；進(jìn)樣量：5 μL。

表2 流動(dòng)相梯度洗脫及流速表

2.2.2 混合對(duì)照品溶液的制備 分別取羅漢果黃素、山奈酚-3,7-O-α-L-二鼠李糖苷和羅漢果皂苷V對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加50%甲醇溶解并制成質(zhì)量濃度分別為0.047 2、0.032 9、1.342 0 mg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 取羅漢果粉末約1.0 g，精密稱(chēng)定，置于具塞三角瓶中，精密加入50%甲醇10 mL，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲（40 kHz，900 W）提取30 min，放冷，補(bǔ)足質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，即得。

2.2.4 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 取上述混合對(duì)照品溶液、供試品溶液按上述色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖（見(jiàn)圖2）。結(jié)果3個(gè)成分的理論塔板數(shù)均不低于5 000，分離度均大于1.5。

圖2 UPLC 色譜圖

2.2.5 線性關(guān)系考察 分別精密吸取“2.2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液1.3、2.5、5.0、7.5、10.0 μL，按上述色譜條件進(jìn)樣分析，以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X，mg/mL）進(jìn)行回歸分析，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 3 個(gè)成分標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍

2.2.6 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一份供試品溶液，按上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次。結(jié)果羅漢果黃素、山奈酚-3,7-O-α-L-二鼠李糖苷和羅漢果皂苷V峰面積的RSD分別為0.69%、0.91%、0.69%，表明儀器精密度良好。

2.2.7 穩(wěn)定性考察 取同一份供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h按上述色譜條件進(jìn)樣分析。結(jié)果羅漢果黃素、山奈酚-3,7-O-α-L-二鼠李糖苷和羅漢果皂苷V含量的RSD分別為1.81%、1.32%、1.50%（n=6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.8 重復(fù)性考察 取同一批號(hào)供試品，共6份，分別按“2.2.3”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣分析。結(jié)果羅漢果黃素、山奈酚-3,7-O-α-L-二鼠李糖苷和羅漢果皂苷V含量的RSD分別為1.83%、2.07%、1.77%，表明本法重復(fù)性良好。

2.2.9 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的供試品（批號(hào)：190401）6份各0.5 g，精密稱(chēng)定，分別加入一定量的混合對(duì)照品溶液，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣分析。結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 3 個(gè)成分的加樣回收率試驗(yàn)（n=6）

續(xù)表4：

2.2.10 含量測(cè)定 取11批羅漢果樣品，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，每批樣品平行制備3份。按上述色譜方法進(jìn)樣分析。（見(jiàn)表5）

表5 11 批樣品中3 個(gè)成分的含量（n=3，mg/g）

3 討 論

3.1 測(cè)定指標(biāo)的選擇 羅漢果中羅漢果皂苷包括11-O-羅漢果苷V、羅漢果苷V、賽門(mén)苷I、羅漢果苷IV等[17-18]，羅漢黃酮主要包含黃酮苷元山奈酚和槲皮素[19]，黃酮苷槲皮素-3-Oβ-D-吡喃葡萄苷-7-O-α-L-鼠李糖苷、羅漢果黃素和山奈酚-3,7-O-α-L-二鼠李糖苷等[15-16，20]。因此本試驗(yàn)將羅漢果苷V、羅漢果黃素和山奈酚-3,7-O-α-L-二鼠李糖苷作為測(cè)定指標(biāo)，評(píng)價(jià)羅漢果中皂苷、黃酮類(lèi)成分的含量，能更全面綜合地評(píng)價(jià)羅漢果的質(zhì)量。

3.2 薄層色譜條件的考察 參照《中華人民共和國(guó)藥典》（2015年版）一部羅漢果鑒別項(xiàng)下方法[11]進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果僅羅漢果皂苷V斑點(diǎn)清晰。考慮到羅漢果黃素、山奈酚-3,7-O-α-L-二鼠李糖苷具有較大的紫外吸收，故優(yōu)化檢視條件，即先噴以5%AlCl3乙醇液，加熱后紫外365 nm下檢視，結(jié)果羅漢果黃素、山奈酚-3,7-O-α-L-二鼠李糖苷斑點(diǎn)清晰，分離度好，再?lài)娨?%香草醛溶液（以10%硫酸乙醇為溶劑），加熱后日光下再檢視，羅漢果皂苷V斑點(diǎn)清晰，分離度好，故確定該條件為最終的薄層色譜條件。

3.3 液相色譜條件的考察 采用UPLC法較普通HPLC法更節(jié)約時(shí)間，溶劑消耗量更少；考察了多種流動(dòng)相系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)以乙腈-0.2%磷酸為流動(dòng)相，所得色譜峰形好且穩(wěn)定；通過(guò)PDA的全波長(zhǎng)掃描發(fā)現(xiàn)，羅漢果黃素和山奈酚-3,7-O-α-L-二鼠李糖苷均在210nm后有兩處最大吸收，分別為264 nm和342 nm，而羅漢果皂苷V在220 nm后沒(méi)有最大吸收，《中華人民共和國(guó)藥典》（2015年版）一部收載的羅漢果質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[11]和張彥東等[13]建立的羅漢果配方顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中羅漢果皂苷V的含量測(cè)定均在203 nm下進(jìn)行，故本試驗(yàn)嘗試以203 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)，結(jié)果基線更平穩(wěn)且3個(gè)成分的峰面積均較大，故將203 nm確定為最終的檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.4 指標(biāo)的限量標(biāo)準(zhǔn)建議 在確定的色譜條件下測(cè)得11批羅漢果藥材中羅漢果黃素、山奈酚-3,7-O-α-L-二鼠李糖苷和羅漢果皂苷V的含量，分別在0.273 5～0.877 6、0.123 7～0.585 3、7.608 8～21.148 8 mg/g之間，差異較大，因此參考含量最低值，擬定本品中羅漢果黃素（C33H40O19）含量不得少于0.27 mg/g，山奈酚-3,7-O-α-L-二鼠李糖苷（C27H30O14）含量不得少于0.12 mg/g，羅漢果皂苷V（C60H102O29)含量不得少于7.61 mg/g。與《中華人民共和國(guó)藥典》（2015年版）一部羅漢果質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)比較，增加了羅漢果黃素、山奈酚-3,7-O-α-L-二鼠李糖苷的含量限度，提高了羅漢果皂苷V的含量限度。

本試驗(yàn)建立了多成分的定量和定性方法，該方法簡(jiǎn)便、可靠，能有效地提高羅漢果的質(zhì)量控制水平。