基于文獻分析和分子對接技術的生脈散激活Nrf2防治心臟損傷活性成分篩選

高 歌，周 鵬，宋 睿，王舒舒，王 翔，王 靚

（1.安徽中醫藥大學研究生院，安徽 合肥 230012；2.安徽中醫藥大學中西醫結合學院，安徽 合肥 230012；3.安徽省中醫藥科學院中西醫結合研究所，安徽 合肥 230012）

生脈散出自金·張元素的《醫學啟源》，由人參、麥冬、五味子組成，具有益氣生津、斂陰止汗之功效。近年來生脈散干預多種病因誘發心臟損傷的效應機制研究已成為研究熱點，氧化應激是心臟損傷的主要病理機制，而核因子E2相關因子（nuclear factor erythroid-2 related factor 2，Nrf2）作為一種重要的氧化應激的調節因子，被激活后可向核內轉移并啟動下游通路信號傳導，發揮抗氧化應激作用，被認為是防治心肌損傷的潛在作用靶點[1-2]。研究發現，在小鼠模型的骨髓源性細胞中特異性Nrf2缺乏可加重小鼠動脈粥樣硬化[3]；Nrf2的缺失可導致小鼠左室舒張功能不全[4]；在分離的心肌細胞中，Nrf2的過度表達阻止了H2O2誘導線粒體的改變，如線粒體網的破壞、線粒體膜的丟失[5]。目前，關于中藥有效成分通過激活Nrf2靶點來治療心血管疾病的研究增多。研究發現，抗氧化藥物可激活體內轉錄因子Nrf2，誘導、啟動下游GST等保護性基因的表達，以維持機體氧化還原平衡，保護組織細胞正常功能[6]。研究發現，右美托咪定可能通過激活Nrf2/HO-1通路，減輕H2O2導致的心肌細胞氧化損傷[7]，但特異性的藥物尚不明確，目前可用于激活Nrf2的中藥有效成分較多，如黃酮類、三萜皂苷類、醌類、萜類、苯酞類及生物堿類[8]，但對于中藥復方研究較少，本研究主要是對生脈散中的潛在活性化合物進行篩選。

分子對接技術作為一種重要的藥物虛擬篩選手段，能為從中藥復方中尋找較好的先導化合物提供準備[9]。本研究所運用的SwissDock（http://www.swissdock.ch/）在線分子對接工具，用于虛擬篩選小分子化合物與蛋白質之間相互作用強弱，并進行EADock快速計算，進而篩選出活性較高的化合物。因此，本研究采用SwissDock分子對接平臺，運用TCMSP數據庫和文獻相關報道篩選小分子化合物作為配體庫，與Nrf2靶點進行對接，根據結合能力打分結果分析生脈散中潛在的激動Nrf2的活性成分，以期為進一步研究生脈散防治心臟損傷的作用機制以及發現天然Nrf2激動劑提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 基于CNKI的近20年生脈散文獻可視化分析 以CNKI為檢索數據庫，檢索策略：采用主題詞或關鍵詞或篇名為“生脈散”，檢索時段為2000年5月1日至2020年5月1日。共檢索出1 123篇相關文獻，通過排除重復發表的文獻、與主題無關的文獻、會議摘要、消息、報紙等，最終納入有效文獻491篇。將納入的文獻以Refworks的格式導出，將格式轉換后導入CiteSpace V軟件中，Top N per slice為50，即選取頻率由高到低排列的50項，剪切方式采用Pathfinder，繪制可視化知識圖譜[10]。

1.2 靶標蛋白結構的獲取和預處理 從蛋白質數據庫中（http://www.rcsb.org）下載Nrf2的三維晶體結構（PDB ID：3zgc）[11]。輸入Nrf2的pdb結構文件，移去自身配體和水分子，保存為pdb格式文件。

1.3 小分子配體構建 從傳統中藥數據庫TCMSP中尋找生脈散的相關活性化合物，并結合中藥在《中華人民共和國藥典》中記載的4個特征性化學成分，共計31個化合物。從Pub－Chem化合物數據庫（http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）下載31個小分子化學成分的sdf文件，并通過Chemdraw 3D Ultra軟件進行能量最小化計算后，保存為mol2格式文件。

1.4 分子對接 采用SwissDock在線分子對接工具，將生脈散中的31個化學成分與Nrf2靶點進行對接[13-14]，在SwissDock網站（http://www.swissdock.ch/）分別上傳靶蛋白和小分子化合物的結構Mol2文件，命名后點擊submit。對接結束后，對接結果傳至已保存郵箱中，下載壓縮文件后，在UCSF chimera軟件查看對接結果。對接得分越低，配體與受體結合越穩定，將通過得分值的高低初步評價化合物與靶點的結合活性。

2 結 果

2.1 生脈散防治心臟損傷的文獻分析 以關鍵詞為網絡節點，并對同義但不同表達的關鍵詞進行合并，如生脈散加味和加味生脈散，心肌炎和病毒性心肌炎，療效和臨床療效，氣陰兩虛和氣陰兩虛證等進行合并，剪裁后形成由91個節點、150條連線組成的關鍵詞共現圖譜，熱點關鍵詞及其出現頻率見表1、圖1。對關鍵詞進行分析發現，生脈散具有益氣養陰之功效（關鍵詞：氣陰兩虛、補氣劑）；且近年來臨床及基礎研究（關鍵詞：臨床療效、治療、大鼠等）聚焦于生脈散干預心肌缺血、心肌缺血再灌注、糖尿病、阿霉素等多種病因誘發心臟損傷的效應研究（關鍵詞：慢性心力衰竭、冠心病、阿霉素、心臟毒性、心肌炎等）。文獻分析結果表明，生脈散臨床多用于防治多種病因誘發的心臟損傷，其防治心臟損傷效應機制研究受到廣泛重視，是近年來研究熱點。

圖1 生脈散文獻中高頻關鍵詞可視化圖譜

表1 生脈散文獻中的高頻關鍵詞

2.2 生脈散中小分子化合物信息 選取滿足口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18的27個化學成分作為候選成分[12]，結合《中華人民共和國藥典》記載，共獲得31個化合物。（見表2）

表2 生脈散中小分子化合物信息

2.3 生脈散中天然Nrf2激動劑活性成分篩選 分子對接結果規定，結合打分值越低說明小分子化合物與靶點之間的結合能力越強，即形成的復合物越穩定。本研究結果顯示，生脈散中的31個化合物均能與Nrf2發生不同程度的結合，且結合能力較好的5個化合物均來自于人參，也符合人參在生脈散中作為君藥的說法。其中化學成分人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、Alexandrin_qt、花生四烯酸、人參皂苷Rg5_qt與Nrf2的結合打分依次升高，說明結合能力的大小順序為人參皂苷Re>人參皂苷Rb1>Alexandrin_qt>花生四烯酸>人參皂苷Rg5_qt。雖然人參皂苷Re和人參皂苷Rb1是《中華人民共和國藥典》中規定人參的特征性化學成分，但兩者的OB均較低，分別為4.27%和6.24%，且兩者DL也較低，而分子量均較大，從成藥性出發，人參皂苷Re和人參皂苷Rb1很難作為先導化合物，因此，生脈散中可作為天然的Nrf2激動劑優選Alexandrin_qt、花生四烯酸和人參皂苷Rg5_qt，其中激動活性最強的是Alexandrin_qt。（見表3、圖2）

圖2 生脈散中主要活性成分與Nrf2 分子對接的3D 圖

表3 生脈散中活性化學成分與Nrf2對接打分情況

3 討 論

生脈散中人參為君藥，補氣，益肺，生津，麥冬為臣藥養陰生津，佐以五味子斂陰止汗，益氣生津。三藥合用，一補一潤一斂，益氣養陰，生津止渴，斂陰止汗，使氣復津生、汗止陰存、氣充脈復。隨著現代醫家的深入研究,發現生脈散對心血管、中樞神經系統、內分泌系統等疾病均有顯著的治療效果。近20年的相關文獻分析顯示，生脈散對多種原因誘導的心臟損傷有積極的防治效應，其作用機制研究已成為近期研究熱點。大量國內外研究表明[15-17]氧化應激及其激活的炎癥、自噬、凋亡等病理學改變是心肌缺血、心肌缺血再灌注、糖尿病、阿霉素等多種原因誘發心臟結構和功能損傷的重要病理基礎。研究顯示[18-19]，Nrf2生理狀態下與Keap1耦聯并與胞質肌動蛋白結合被錨定在細胞質，處于一種非游離并且不斷降解的非活性狀態，活性氧（reactive oxygen species，ROS）等病理刺激可誘導Nrf2解離，與抗氧化反應元件（antioxidant response element,ARE）相互作用，能誘導出一系列的保護性蛋白，以緩解細胞所受的損害。Nrf2作為抗氧化應激損傷的關鍵調控靶點，是保護多種病因誘導心臟損傷的潛在作用靶點[20]。

本研究以生脈散為研究對象，以Nrf2作為潛在調控靶點，對照TCMSP數據庫并結合《中華人民共和國藥典》從生脈散中篩選符合條件的31個化合物，采用分子對接技術虛擬篩選天然Nrf2激動劑，發現生脈散的主要活性物質來自于人參，包括人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、Alexandrin_qt、花生四烯酸和人參皂苷Rg5_qt等。研究表明，人參皂苷Rb1可促進動脈粥樣硬化模型大鼠的Nrf2蛋白核移位，上調HO-1水平，說明人參皂苷Rb1可以激活Nrf2和Nrf2下游基因[21]。人參皂苷Re可促進異丙腎上腺素所致心肌損傷大鼠Nrf2核轉位的增加，從而發揮心肌保護作用[22]。Alexandrin_qt與Nrf2的結合能力最強，最有可能作為先導化合物進行進一步改造和開發，同時本研究也從分子對接層面預測了生脈散對Nrf2的調控作用，為后期研究生脈散防治心臟損傷的作用機制，以及發現天然Nrf2激動劑提供了一定的理論依據。