基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)探討附子-白芍配伍治療抑郁癥的作用機(jī)制*

張景霞，李莎莎，李 凡，王衛(wèi)鋒，趙重博，李 芳

（1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，陜西 咸陽 712046；2.陜西省中醫(yī)藥研究院，陜西 西安 710003）

附子-白芍配伍具有溫陽斂陰、養(yǎng)血緩急、調(diào)氣機(jī)等作用，最早出現(xiàn)于《傷寒雜病論》[1]。附子（Aconiti carmichaeli Radix Praeparata）為毛茛科烏頭屬植物，具有回陽救逆、補(bǔ)火助陽、散寒止痛的功效，后世皆用其治療危重癥患者。現(xiàn)代研究表明附子主要化學(xué)成分有生物堿、多糖、神經(jīng)酰胺等，具有強(qiáng)心、抗炎、鎮(zhèn)痛、抗衰老、抗抑郁等藥理作用[2-3]。白芍（Paeoniae Radix Alba）為毛茛科植物，具有養(yǎng)血斂陰、柔肝止痛的功效，化學(xué)成分有黃酮類、萜類化合物、多糖等，具有抗炎、抗氧化、抗抑郁等藥理作用，用于治療神經(jīng)退行性疾病[4]。劉磊[3]研究表明附子生物堿可通過上調(diào)cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（cAMPresponse element binding protein，CREB）-腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）通路達(dá)到抗抑郁作用，同時(shí)具有促進(jìn)神經(jīng)元再生的作用。白芍可使海馬組織中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)去甲腎上腺素（norepinephrine，NE）和5-羥色胺（5-hydroxy tryptamine，5-HT）的水平明顯升高，并且使5-羥吲哚乙酸（5-hydroxyindole acetic acid，5-HIAA）的水平明顯下降，達(dá)到抗抑郁的作用[5]，且其提取物及芍藥苷均具有抗抑郁作用[6-7]。

抑郁癥是一種慢性反復(fù)發(fā)作的腦疾病，臨床表現(xiàn)為持續(xù)的情緒低落、焦慮、睡眠障礙、思維遲鈍、興趣減退、對(duì)前途悲觀失望等，嚴(yán)重者甚至有自殺傾向[3]。隨著社會(huì)的發(fā)展，人們在生活和工作中的壓力越來越大，抑郁癥發(fā)病率逐年上升，但其發(fā)病機(jī)制尚不明確[8]。中醫(yī)認(rèn)為抑郁癥屬于“郁病”，其發(fā)病機(jī)理是心神失養(yǎng)，體內(nèi)肝氣郁結(jié)，治療抑郁癥應(yīng)以疏肝理氣解郁為主[9]，還有少數(shù)醫(yī)家認(rèn)為應(yīng)以消痰利膽為主[10]。目前有關(guān)中藥治療抑郁癥的研究越來越多，但主要集中在單味藥和單一作用機(jī)制等方面[11]，而傳統(tǒng)中醫(yī)藥多是將藥材配伍使用，中藥成分復(fù)雜，治療相關(guān)疾病具有多靶點(diǎn)的特征。本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接的方法，探討附子-白芍配伍治療抑郁癥的分子靶點(diǎn)和機(jī)制，構(gòu)建其治療抑郁癥的分子靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，為中藥復(fù)方治療抑郁癥的科學(xué)研究提供參考。

1 資料和方法

1.1 潛在活性成分及靶點(diǎn)篩選 檢索數(shù)據(jù)庫（TCMSP，http://ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php）得到附子和白芍的化合物成分，篩選條件設(shè)定為口服生物利用度（OB）≥30%，類藥性（DL）≥0.18，血腦屏障（BBB）≥-0.3[9]，篩選出附子和白芍的化學(xué)成分及相關(guān)靶標(biāo)，并在Uniprot數(shù)據(jù)庫（http//www.uniprot.org/）將篩選出的靶點(diǎn)蛋白標(biāo)準(zhǔn)化。

1.2 抑郁癥靶點(diǎn)的獲取 檢索GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)和Disgenet數(shù)據(jù)庫（https://www.disgenet.org/）得到與抑郁癥相關(guān)的所有靶點(diǎn)。

1.3 附子-白芍配伍靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)集Venn分析 將附子-白芍配伍主要化學(xué)成分作用靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)數(shù)據(jù)集進(jìn)行Venn 分析（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/），得出附子-白芍化學(xué)活性成分與抑郁癥的靶向關(guān)系。

1.4 網(wǎng)絡(luò)建立與富集分析

1.4.1 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作關(guān)系（PPI）網(wǎng)絡(luò)圖 將得到的交集靶點(diǎn)在線導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫，物種設(shè)為“Homosapiens”，閾值設(shè)為中等置信度“medium confidence=0.4”，其余參數(shù)保持默認(rèn)設(shè)置不變，得到蛋白與蛋白間相互作用信息，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖，利用“Network analysis”功能進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)鋵傩苑治?，根?jù)其節(jié)點(diǎn)度值Degree參數(shù)，明確靶點(diǎn)和靶點(diǎn)間作用關(guān)系；進(jìn)而根據(jù)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)理論得知其在網(wǎng)絡(luò)中信息傳遞效率更高，能影響更多節(jié)點(diǎn)。

1.4.2 生物過程注釋及代謝通路分析 為了闡述附子-白芍配伍與疾病相關(guān)成分的靶點(diǎn)在生物過程中的功能作用機(jī)制，以R Studio軟件對(duì)交集靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG代謝通路分析和GO生物信息學(xué)富集，描述基因靶點(diǎn)的分子功能（MF）、所處的細(xì)胞位置（CC）和參與的生物過程（BP）；用KEGG數(shù)據(jù)庫富集靶點(diǎn)基因參與的主要生化代謝途徑，以P<0.05為顯著性差異作為判定值，對(duì)富集結(jié)果進(jìn)行可視化處理，以說明附子-白芍配伍抗抑郁活性成分及參與生物途徑之間的關(guān)系，并闡明附子-白芍配伍多成分、多靶點(diǎn)、多途徑協(xié)同抗抑郁癥可能的作用機(jī)制。

1.5 分子對(duì)接分析 在PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中得到藥材中活性化合物的3D結(jié)構(gòu)；從RCSB PDB（http://www.rcsb.org/）數(shù)據(jù)庫中篩選得到的核心靶蛋白的晶體結(jié)構(gòu)，去除了水分子和配體小分子，分離出潛在蛋白的結(jié)構(gòu)。在Discovery Studio 2016軟件中采用LibDock程序進(jìn)行對(duì)接，對(duì)接空腔和大小根據(jù)化合物及蛋白質(zhì)分子進(jìn)行設(shè)定，其余參數(shù)保持默認(rèn)，對(duì)化合物和靶標(biāo)蛋白進(jìn)行分子對(duì)接分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 有效成分的搜集與篩選 根據(jù)DB、DL、BBB值篩選得到10個(gè)潛在活性成分，其中附子潛在活性成分7個(gè)，根據(jù)GeneCards和Disgenet數(shù)據(jù)庫中抑郁潛在的靶點(diǎn)和附子-白芍相關(guān)靶點(diǎn)的映射反推配伍后可能存在的有效成分共6個(gè)，相應(yīng)靶點(diǎn)蛋白46個(gè)，活性成分的OB、DL和BBB值見表1，所對(duì)應(yīng)的結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1 附子-白芍中有效化合物的結(jié)構(gòu)

表1 附子-白芍中化合物的OB、DL 和BBB

2.2 疾病及藥物靶點(diǎn)的篩選 檢索GeneCards和Disgenet數(shù)據(jù)庫設(shè)定為“人類”，得到抑郁癥相關(guān)的基因靶點(diǎn)共9 785個(gè)，與附子-白芍配伍潛在靶點(diǎn)進(jìn)行匹配，通過Venny 2.1.0映射最終得到交集靶點(diǎn)36個(gè)。（見圖2）

圖2 “成分-靶點(diǎn)”及“疾病-靶點(diǎn)”Venn 圖

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)建立及富集分析

2.3.1 PPI網(wǎng)絡(luò) 將36個(gè)交集基因名導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫，導(dǎo)出TSV文本，再導(dǎo)入Cytoscape3.7.2軟件得PPI網(wǎng)絡(luò)圖，共36個(gè)節(jié)點(diǎn)，100條邊。CASP3與其他靶點(diǎn)的聯(lián)系最多，其次是JUN、CHRM1、ESR1。CASP3參與Caspases的激活級(jí)聯(lián)反應(yīng)，負(fù)責(zé)細(xì)胞凋亡的執(zhí)行。（見圖3）

圖3 36 個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)圖

2.3.2 富集分析 采用CludterProfiler程序包對(duì)36個(gè)交集靶點(diǎn)基因進(jìn)行GO、KEGG功能注釋和富集分析，GO富集分析中MF、CC和BP功能分析均設(shè)Pvalue Cutoff=0.05；Qvalue Cutoff=0.05并繪制條形圖。KEGG通路富集分析設(shè)定Pvalue Cutoff=0.05，篩選排名前20的通路繪制氣泡圖。（見圖4～5）

圖4 附子-白芍治療抑郁癥活性靶點(diǎn)GO 富集分析

GO富集分析結(jié)果表明富集主要集中在生物過程上，共433條富集結(jié)果，其中膜電位調(diào)節(jié)、肌肉系統(tǒng)過程、血液循環(huán)調(diào)節(jié)和肌肉收縮過程參與的基因數(shù)目最多。細(xì)胞組分中有58條富集結(jié)果，其中基因參與最多的是突觸后膜和膜筏，突觸后膜面向神經(jīng)末梢的突觸前膜，由突觸裂口與之分離，神經(jīng)遞質(zhì)穿過突觸間隙，將信號(hào)傳遞到突觸后膜[12]；膜筏是不均勻的，高度動(dòng)態(tài)的，富含固醇和鞘脂的膜結(jié)構(gòu)域，將細(xì)胞分隔開[13]；分子功能中有71條富集結(jié)果，其中神經(jīng)遞質(zhì)受體所占比重較大，它與神經(jīng)遞質(zhì)結(jié)合并傳遞信號(hào)，改變細(xì)胞活動(dòng)；研究表明，5-HT1A受體既是突觸前膜自身受體又是突觸后膜受體，這2種受體對(duì)5-HT系統(tǒng)具有相反作用，可調(diào)節(jié)其水平，發(fā)揮抗抑郁作用[8]。附子-白芍可通過調(diào)節(jié)機(jī)體的多種生物過程而發(fā)揮抗抑郁作用。

圖5 KEGG 通路富集圖

對(duì)36個(gè)靶基因進(jìn)行KEGG通路富集分析，共得到67條富集結(jié)果，以P＜0.05，取排名前20的為候選信號(hào)通路，主要富集在神經(jīng)活性配體-受體相互作用、5-羥色胺能突觸、γ-氨基丁酸能突觸、PI3k-Akt信號(hào)通路及雌激素信號(hào)途徑等信號(hào)通路。結(jié)果表明，附子-白芍能通過多條信號(hào)通路發(fā)揮抗抑郁作用。2.4 藥材-成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)分析 利用Cytoscape 3.7.2中的Merge功能將“藥材-成分”“成分-靶點(diǎn)”“靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)合并，得到“藥材-成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)路圖。網(wǎng)絡(luò)中粉色節(jié)點(diǎn)表示藥材，橙色節(jié)點(diǎn)表示有效成分，綠色節(jié)點(diǎn)表示與抑郁癥的相關(guān)疾病靶點(diǎn)，紅色節(jié)點(diǎn)表示與抑郁癥靶點(diǎn)相關(guān)的通路。根據(jù)網(wǎng)絡(luò)圖分析得知，通路神經(jīng)活性配體-受體相互作用和鈣信號(hào)通路與潛在靶點(diǎn)存在較多的連接。此外，附子中的三角豆素和白芍中的β-谷甾醇對(duì)活性靶點(diǎn)SCN5A、PTGS2、ADRB2和ADRA1B均有調(diào)控作用；潛在活性靶點(diǎn)PTGS1和PGR連接較多的邊數(shù)；說明附子-白芍配伍是以多途徑、多環(huán)節(jié)、多靶標(biāo)整體協(xié)同增效。（見圖6）

圖6 藥材-成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 分子對(duì)接分析 根據(jù)“藥材-成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖選取活性成分連接靶點(diǎn)數(shù)較多的化合物β-谷甾醇、三角豆素，并選擇靶點(diǎn)PTGS1與上述2種化合物進(jìn)行分子對(duì)接，且成分β-谷甾醇、Mairin、谷甾醇均作用與PGR靶點(diǎn)，利用Discovery Studio 2016軟件進(jìn)行對(duì)接驗(yàn)證。Mairin能夠與PGR靶點(diǎn)中ALA211、PRO210、PHE241、TYR63等氨基酸殘基結(jié)合，產(chǎn)生氫鍵和共軛效應(yīng)，增加了結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，配體受體結(jié)合得分較高。β-谷甾醇能夠與LYS58、TYR63、PHE241等位點(diǎn)結(jié)合形成大量的氫鍵，表明親和力較好。谷甾醇與TYR63、PRO235、TYR26等位點(diǎn)結(jié)合。PTGS1與三角豆素、β-谷甾醇分子對(duì)接得分為110.82和109.12，表明PTGS1與附子和白芍的成分具有良好的親和力，這與“藥物—成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果一致，化學(xué)成分與活性位點(diǎn)的結(jié)合而發(fā)揮治療效果。（見表2、圖7～8）

圖7 PGR 與Mairin、β-谷甾醇、谷甾醇分子結(jié)合圖

表2 化合物與潛在靶點(diǎn)分子對(duì)接結(jié)合能量及得分

3 討 論

圖8 PTGS1 與三角豆素、β-谷甾醇分子結(jié)合圖

本文采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的手段，篩選得到附子-白芍化合物6個(gè)，預(yù)測治療抑郁癥的潛在靶蛋白36個(gè)。網(wǎng)絡(luò)圖提示附子-白芍治療抑郁癥的有效化合物為三角豆素、β-谷甾醇、谷甾醇和Mairin，有效靶點(diǎn)為PTGS1和PGR。PPI網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析結(jié)果顯示，CASP3與其他靶點(diǎn)的聯(lián)系最多，是細(xì)胞凋亡的主要執(zhí)行者，激活下游信號(hào)調(diào)節(jié)因子促進(jìn)細(xì)胞凋亡；GO富集結(jié)果顯示附子-白芍配伍主要是通過參與膜電位調(diào)節(jié)、血液循環(huán)調(diào)節(jié)、對(duì)銨離子的反應(yīng)、G蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)途徑、胞漿鈣離子濃度的調(diào)節(jié)、磷脂酶C激活G蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)途徑及鈣離子輸運(yùn)等生物過程發(fā)揮抗抑郁作用。KEGG主要富集結(jié)果提示附子-白芍抗抑郁的靶點(diǎn)主要集中在神經(jīng)活性配體和受體相互作用、鈣信號(hào)通路、PI3K-Akt、γ-氨基丁酸能突觸和5-羥色胺能突觸等信號(hào)通路。同時(shí)，選取β-谷甾醇、三角豆素與活性靶點(diǎn)PTGS1對(duì)接，β-谷甾醇、Mairin、谷甾醇與活性靶點(diǎn)PGR對(duì)接，模擬驗(yàn)證預(yù)測結(jié)果，結(jié)果顯示化合物和靶點(diǎn)PTGS1及PGR有良好對(duì)接活性。研究結(jié)果說明附子-白芍配伍治療抑郁癥具有多成分、多靶點(diǎn)、多通路協(xié)同作用特點(diǎn)，并使用分子對(duì)接技術(shù)得到了初步驗(yàn)證。

β-谷甾醇和三角豆素與潛在靶點(diǎn)連接的度值較高，β-谷甾醇具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、解熱、免疫調(diào)節(jié)、止痛等作用[14]，能夠顯著提高腦內(nèi)5-HT、NE和代謝產(chǎn)物5-HIAA，有研究表明β-谷甾醇抗抑郁活性是通過這些神經(jīng)遞質(zhì)介導(dǎo)的[15]；三角豆素具有抗炎、抗菌、抗氧化及肝保護(hù)作用[16]。研究表明氧化應(yīng)激與抑郁有較大的關(guān)系[17]。

中樞神經(jīng)系統(tǒng)中5-HT活性降低是引發(fā)抑郁的基礎(chǔ)，可通過5-羥色胺能突觸信號(hào)通路來升高5-HT[18]；神經(jīng)活性配體-受體相互作用信號(hào)通路是質(zhì)膜上所有與細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)通路相關(guān)的受體和配體的集合，可改善神經(jīng)遞質(zhì)傳導(dǎo)功能而發(fā)揮抗抑郁作用[19]；研究證明小鼠抑郁樣行為的改善作用伴隨著前額葉灰質(zhì)和海馬內(nèi)的基因表達(dá)差異，而這些基因主要集中在神經(jīng)活性配體和受體相互作用的信號(hào)通路上；γ-氨基丁酸是一類重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，主要分布在腦內(nèi)且含量較高，與焦慮、抑郁和失眠的發(fā)病機(jī)制有關(guān)[3]。PI3K-Akt信號(hào)通路中AKT可促進(jìn)NF-κB蛋白表達(dá)，從而擾亂下丘腦-垂體-腎上腺軸功能使炎癥反應(yīng)失調(diào)，將加重抑郁癥狀[20]。

本研究預(yù)測了附子-白芍配伍治療抑郁癥生物過程及通路的可行性，表明了其多靶點(diǎn)、多通路的治療特點(diǎn)，但對(duì)其關(guān)鍵生物過程和關(guān)鍵通路的調(diào)控還應(yīng)進(jìn)一步的深入研究，后續(xù)應(yīng)進(jìn)行體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)或體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)等手段加以驗(yàn)證，以確保預(yù)測結(jié)果的科學(xué)性及準(zhǔn)確性。