基于數據挖掘和網絡藥理學探討糖尿病合并缺血性腦卒中的用藥規律及藥物作用機制

鄭金玲，石 巖，楊宇峰，姜永梅，孫紅曉

（1.遼寧中醫藥大學，遼寧 沈陽 110847；2.大連醫科大學附屬第二醫院，遼寧 大連 116023；3.山東沂水縣人民醫院，山東 臨沂 276400）

糖尿病是指以高血糖為特征的一類代謝性疾病，由胰島素分泌不足或其作用障礙導致血糖升高引發[1]。缺血性腦卒中是指由于腦供血動脈（頸動脈和椎動脈）狹窄或閉塞，引起腦供血不足導致的腦組織壞死的總稱。糖尿病患者機體長期的高血糖狀態會導致動脈血管壁的損傷及血管內皮的脂質沉積，血管內皮雜質的沉積使管腔狹窄甚至閉塞，從而引起缺血性腦卒中[2-3]。腦卒中一旦發生，患者有很大發生二次栓塞的可能，有關缺血性腦卒中的流行病學調查表明，在1型糖尿病、2型糖尿病患者中，缺血性腦卒中的復發率分別為40.9%和29.7%[4]。一旦患病，會嚴重影響患者的生活質量及生活水平，給患者帶來極大的生理、心理負擔。據調查，中國腦卒中死亡年齡呈明顯下降趨勢，且高血糖為其中危險因素之一[5]。目前已經有研究證實，糖尿病患者的血糖水平與缺血性卒中發生風險呈正相關，即血糖水平越高，缺血性卒中發生風險越高[2]。目前西醫對于腦卒中的治療方法主要以阿司匹林等抗血小板聚集藥為主，以及降糖、降脂、神經保護、纖溶酶治療等方案[6-7]。雖然可以減少腦血管病的發生，但糖尿病患者合并缺血性腦卒中的發病率依然存在[8]。糖尿病合并缺血性腦卒中在中醫學中屬于“消渴”“中風”等范疇[9]。近年來，應用中醫藥治療該病的患者越來越多并且在臨床中取得了很好的療效，但并沒有應用數據挖掘方法分析其用藥規律以及作用機制的研究[10]。本研究通過檢索中醫藥治療糖尿病合并缺血性腦卒中的臨床研究，應用數據挖掘、分子對接方法探究中醫藥發揮藥效的可能機制，為臨床治療糖尿病合并缺血性腦卒中提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 數據選取 通過對中國知網、CBM、萬方、維普等數據庫進行檢索，以“糖尿病合并缺血性腦卒中”“糖尿病”“缺血性腦卒中”“醫案”“經驗總結”“中藥”“方劑”等作為主題詞，檢索起止時間為建庫至2020年6月。選取應用中醫藥治療糖尿病合并缺血性腦卒中的醫案、病例分析、隨機對照試驗等，并由兩名人員獨立提取文獻中所涉及的方劑。

1.2 納入標準（1）符合糖尿病合并缺血性腦卒中的中西醫診斷標準；（2）療效標準參照《中藥新藥臨床研究指導原則》[11]。

1.3 排除標準（1）綜述、動物實驗類文章；（2）干預措施不是中藥口服湯劑；（3）四診資料不全、用藥配方不詳、療效不確定；（4）重復發表的文獻。

1.4 數據挖掘方法

1.4.1 分析軟件錄入與核對 本研究經規范處理后由雙人錄入古今醫案云平臺V2.2.1軟件，建立“中醫藥治療糖尿病合并缺血性腦卒中的數據庫”進行數據挖掘。在古今醫案云平臺首頁，選擇“醫案數據采集”，點擊“批量導入”。古今醫案云平臺配備專業中醫藥術語庫，幫助用戶進行數據智能規范化。同時支持用戶手動修正標準化內容，并存儲為標準醫案庫。利用“醫案統計分析”中“醫案標準化”功能，將本研究導入的“中醫藥治療糖尿病合并缺血性腦卒中的數據庫”中的疾病、證候、中藥等數據進行標準化處理。

1.4.2 數據分析 本研究將標準化后的“中醫藥治療糖尿病合并缺血性腦卒中的數據庫”點擊“批量加入分析池”按鈕，全部加入分析池進行醫案分析。利用古今醫案云平臺數據挖掘分析模塊可對加入分析池的醫案數據進行分析和挖掘，包括中藥統計、中藥配伍、四診與中藥、病證與中藥、中藥屬性（四氣、五味、歸經、功效）、中藥聚類分析等內容[12-13]。

1.4.3 復雜網絡構建分析 使用Gephi-0.9.2軟件實現網絡的構建，通過不同的布局算法或者通過不同的統計方法對網絡的總體特征、節點特征及節點與邊的相關性等分析，供研究者發現網絡中的規律。故本研究利用該軟件，通過對網絡拓撲性質進行計算和統計，以發現中醫藥治療糖尿病合并缺血性腦卒中的核心方藥。

1.5 網絡藥理學分析 通過中藥系統藥理學分析平臺（TCMSP）網站[14]（http://tcmspw.com/tcmsp.php）獲得糖尿病合并缺血性腦卒中核心藥物所含的化學成分，將口服吸收率（OB≥30%）、類藥性（DL≥0.18）作為篩選條件并獲取相應靶點。通過TTD、DisGeNET、G eneCards等數據庫以“Diabetes Mellitus Combined with Cerebral Infarction”為主題詞獲取疾病靶點。將疾病靶點與藥物靶點取交集后，導入Cytoscape（3.6.0）軟件構建“藥物成分-靶點”網絡圖。利用RProject進行GO注釋和KEGG通路富集分析[15]，進一步了解上述核心靶點的生物功能及在信號通路中的作用。

1.6 分子對接 通過RSCB PDB數據庫（http://www.rcsb.org/）下載PDB格式文件，準備好核心靶點的3D結構文件。通過PubChem數據庫下載核心化合物SDF格式的2D結構文件，應用Chem 3D軟件轉化為PDB格式。運用PyMOL軟件對核心靶點進行去水、加氫等操作，利用AutoDock軟件將化合物及靶蛋白格式轉換為pdbqt格式，最后運行Vina進行對接。選取結合能較低且構象較好采用Discovery Studio、Pymol及Ligplus軟件進一步分析展示對接結果。

2 結 果

2.1 中藥頻數統計 根據納入、排除標準篩選后，共納入74篇文獻進行本次研究，包含中藥方劑94首，涉及中藥32味。對94首中藥湯劑數據進行藥物頻數統計，頻數≥25的中藥共14味，頻數排序前5位的分別為黃芪、川芎、當歸、地龍、丹參。（見表1）

表1 中藥使用頻數表（頻數≥25）

2.2 中藥配伍關聯分析 本研究使用關聯規則分析，挖掘藥物之間的關聯關系，其中支持度表示同時包含A和B的事物占所有事物的比例。如果用P（A）表示使用A事物的比例，那么支持度=P（A∪B）。可信度表示使用包含A的事物中同時包含B事物的比例，即同時包含A和B的事物占包含A事物的比例，可信度=P（A∪B）/P（A）。提升度表示“包含A的事物中同時包含B事物的比例”與“包含B事物的比例”的比值。提升度=P（B|A）/P（B），提升度反映了關聯規則中的A與B的相關性，提升度>1且越高表明正相關性越高，提升度<1且越低表明負相關性越高，提升度=1表明沒有相關性。

將納入方劑數據進行藥物關聯分析，經過篩選同現頻數≥20，置信度≥0.8，支持度≥0.2，最終得到關聯規則數據20條，其中排名前5的藥物配伍為川芎-黃芪、當歸-黃芪、地龍-黃芪、丹參-黃芪、地龍-川芎。（見表2）

表2 中藥配伍關聯分析表

續表2：

本研究對上述頻數≥20共20個藥對，運用Gephi進行藥物歸類可視化分析。源節點（Source）為藥物A名稱，目標節點（Target）為藥物B名稱，以此對數據進行預處理，如源節點為“當歸”，則目標節點設置為“川芎”。將預處理后的數據導入Gephi軟件，關系選為“邊表格”，字符集選為“GB2312”，選取模塊化處理，分別點擊“平均度”“模塊化”“特征向量中心度”及“網絡直徑”來計算網絡的拓撲特征參數，選擇Fruchteiman Reingold布局運行，并根據節點度來植染圖中節點的大小，區值為10 000.0，重力值為10.0，速度為1.0進行可視化展示。（見圖1）

圖1 核心用藥網絡關系圖

2.3 中藥聚類分析 對藥物頻數排名前30的中藥進行Ward法聚類分析。以距離≥7為界，可以將上述藥物分為4組，第一組：黃芪、地龍、川芎；第二組：紅花、桃仁、當歸、赤芍；第三組：生地黃、五味子、天花粉、麥冬、白芍、茯苓、黨參、炙甘草；第四組：水蛭、牛膝、石菖蒲、黃連、熟地黃、丹參、葛根、甘草、天麻、山萸肉、白術、山藥、大黃、澤瀉、南沙參。（見圖2）

圖2 中藥聚類分析圖

2.4 中藥功效統計分析結果 對94首治療糖尿病合并缺血性腦卒中的中藥功效進行統計分析，得到使用頻數較高的藥物功效從高到低的頻數排列結果，其中生津養血藥使用頻數最高86次。頻數排序前5位的分別為生津養血藥、清熱涼血藥、潤腸通便藥、利水消腫藥、行滯通痹藥。排序前10的中藥功效頻數排序數據見表3。

表3 中藥功效頻數表

3 核心配伍分子機制探討

上述數據挖掘研究得出治療糖尿病合并缺血性腦卒中的高頻用藥主要為黃芪、川芎、當歸、地龍、丹參等，用藥配伍關聯規則分析、聚類結果提示“黃芪-川芎”的關聯強度最高。所以“黃芪-川芎”為治療糖尿病合并缺血性腦卒中的核心配伍用藥，對其中的分子機制作進一步探討。

3.1 “黃芪-川芎”的化合物成分收集 通過在TCMSP網站中檢索“黃芪”“川芎”。將口服吸收率（OB≥30%）和類藥性（DL≥0.18）作為篩選條件，得到黃芪化合物成分16個，靶點276個；川芎化合物成分7個，靶點75個。

3.2 疾病靶點收集 通過在TTD、DisGeNET、GeneCards數據庫以“Diabetes Mellitus Combined with Cerebral Infarction”為主題詞，分別檢索得到23、1 189、3 082個疾病靶點，經查重共檢索到3 353個糖尿病合并缺血性腦卒中的潛在作用靶點。

3.3 “黃芪-川芎”化合物成分-靶點網絡構建 應用Cytoscape軟件構建“黃芪-川芎”化合物成分-靶點網絡圖，圖中共包含161個節點（2個中藥、18個化合物成分、141個靶點）、294條邊。其中橙色代表黃芪及其化合物、藍色代表川芎及其化合物、紅色為多靶點交叉的化合物、綠色代表疾病靶點。應用Network Analyze獲取相關拓撲參數，首先選取節點度值（degree）的中位數為篩選標準，其次以介度（betweenness）和節點緊密度（closeness）的中位數作為篩選依據，共得到核心化合物成分17個、核心靶點53個。（見圖3、表4）

圖3 “黃芪-川芎”化合物成分-靶點網絡圖

表4 degree≥10 化合物成分與靶點表

續表4：

其中排名前5的化合物為槲皮素（quercetin）、山柰酚（kaempferol）、黃芪總皂苷（isorhamnetin）、芒柄花素（formononetin）、楊梅酮（myricanone），可能是“黃芪-川芎”發揮藥效的成分之一。排名前5 的核心靶點為PTGS2、PTGS1、HSP90AA1、NOS2、RXRA，分別與15、11、10、8、8個化合物發生相互作用，可能是“黃芪-川芎”治療糖尿病合并缺血性腦卒中發揮作用的靶點。3.4 基因GO與KEGG通路富集分析 利用R Project中的BiocManager、clusterProfiler等安裝包，將上述53個核心靶點進行GO注釋、KEGG通路富集分析。GO富集分析結果：生物過程（BP）P<0.05的條目有1 064個，細胞組成（CC）P<0.05的條目有29個，分子功能（MF）P<0.05的條目有71個。縱坐標為GO的名稱，橫坐標為富集在每一個GO的數目，顏色越趨近于紅色代表P-Value越小，富集越高。（見圖4）

圖4 GD 富集分析barplot 圖

KEGG通路富集分析結果：縱坐標為KEGG的名稱，橫坐標為富集在每一個KEGG的比例，圓圈的大小為富集的數目，顏色越趨近于紅色代表P-Value越小，富集越高。主要涉及Endorine resistance、Platinum drug resistance、Metabolism of xenobiotics by cytochrome P450、Tryptophan metabolism、Drug metabolism-cytochrome P450、PPAR signaling pathway等信號通路。（見圖5）

圖5 KEGG 通路富集分析barplot 圖

3.5 “黃芪-川芎”部分化合物作用于核心靶點的分子對接 本研究將degree排名前5的化合物成分及5個核心靶點PTGS2、PTGS1、HSP90AA1、NOS2、RXRA分別進行分子對接。（見表5）使用Autodock Vina和Pymol腳本完成高通量分子對接，一般認為配體與受體相互作用的親和力越強，所需能量越少，其發生作用的可能性越大。分子對接的結果顯示，這些化合物與核心靶點的結和能均低于-5.2 kcal/mol，表明親和力較強。為了進一步研究配體與受體相互作用關系，采用Pymol對化合物小分子進行加氫、加電荷、刪除水溶劑等處理，運用Discovery Studio 3.5 Client、Pymol、Ligplus軟件對結合能排名前三的“化合物-蛋白”對接構象進行可視化展示，見圖6～8。圖中顏色越接近粉色親水作用越強，反之越接近綠色疏水作用越強，圖中應用Pymol展示空間結構、結合殘基名稱及其氫鍵，圖Ligplus使用2D效果具體體現不用殘基間的氫鍵距離，距離越短氫鍵的作用越強，結合的越緊密。

表5 degree 排名前5 的化合物與核心靶點對接結結合能表

圖6 quercetin -PTGS2 分子對接圖

圖7 isorhamnetin-PTGS2 分子對接圖

圖8 kaempferol-PTGS2 分子對接圖

4 討 論

糖尿病合并缺血性腦卒中在中醫學中屬于“消渴”“中風”等范疇[16]，消渴病的病機主要為陰虛燥熱，消渴病日久氣陰兩虛而致血脈運行無力形成血脈瘀滯，成為了中風發生的危險因素[17]。中醫藥治療糖尿病合并缺血性腦卒中應以活血化瘀、益氣養陰為主。目前，通過中醫藥治療糖尿病合并缺血性腦卒中已經取得很好的療效[18]，但至今沒有關于其用藥規律的統計分析，本次研究得出黃芪、川芎、當歸、地龍、丹參、赤芍、生地黃、紅花、葛根、桃仁、麥冬、水蛭、甘草、山萸肉等為治療糖尿病合并缺血性腦卒中的高頻使用藥物，功效均以活血化瘀、益氣養陰為主。藥物關聯分析發現川芎-黃芪、當歸-黃芪、地龍-黃芪、丹參-黃芪、地龍-川芎等藥物相互配伍頻率較高，說明臨床上常用黃芪配伍活血藥治療，起到補氣活血的功用。本次研究在聚類分析中共得出4組藥物，第一組：黃芪、地龍、川芎；第二組：紅花、桃仁、當歸、赤芍；第三組：生地黃、五味子、天花粉、麥冬、白芍、茯苓、黨參、炙甘草；第四組：水蛭、牛膝、石菖蒲、黃連、熟地黃、丹參、葛根、甘草、天麻、山萸肉、白術、山藥、大黃、澤瀉、南沙參；4組藥物主要功效均以行滯通痹、活血化瘀、益氣養陰生津為主，與上述功效統計結果相一致。其中黃芪、川芎是本次研究中使用的高頻藥物，黃芪味甘、微溫，是補中益氣的要藥，同時還具有利水消腫、固表止汗、托毒斂瘡的功效，川芎味辛、性溫，能夠活血行氣、祛風止痛，常用于治療瘀血阻滯的各種病癥。現代研究表明，吳英萍等[19]通過動物實驗證實黃芪多糖可以通過調節TNF-α的水平，來改善胰島素抵抗，降糖效果顯著優于單用胰島素。賈新菊等[20]通過研究發現黃芪甲苷可通過改善血管炎性病變，來降低糖尿病小鼠的血糖和糖化血紅蛋白水平。周佳等[21]發現黃芪甲苷可下調腦組織中NF-κB蛋白表達,抑制氧化應激及炎癥反應，從而有效減輕大鼠因腦缺血再灌注導致的神經功能缺損。方翔[22]發現川芎可通過影響神經膠質細胞Ube3aas基因水平治療腦缺血小鼠。吳作敏等[23]亦認為“黃芪-川芎”藥對可以通過調控多條通路治療腦卒中。劉曉瑞等[24]應用益氣活血法治療糖尿病大鼠，可以改善大鼠脂代謝的紊亂，延緩糖尿病大血管病變的進展。

在“黃芪-川芎”-糖尿病合并缺血性腦卒中靶點網絡圖中篩選出53個核心靶點，其中排名前5靶點為PTGS2、PTGS1、HSP90AA1、NOS2、RXRA，說明在此網絡中起到重要的作用。目前研究表明，PTGS1、PTGS2蛋白是前列腺素合成的主要限速酶，即前列腺素內過氧化物合酶1和環氧化酶2，其環氧化酶2是花生四烯酸代謝的起始限速酶-環氧化酶的同工酶[25]，王熠等[26]發現環氧化酶2的表達及活性增加參與了血管內皮胰島素抵抗對內皮功能的影響。張如意等[27]認為糖尿病大血管病變的發生和發展可能與環氧化酶2 的激活有關。HSP90AA1是熱休克家族蛋白的一種，在糖尿病發生發展過程中起到重要作用的分子伴侶蛋白家族[28]，王嬌等[29]發現HSP90AA1可以有效延緩糖尿病并發癥的進展。NOS2是一種誘導性一氧化氮合酶，NOS2的遺傳多態性可能與糖尿病的易感性相關[30]。陸迪菲等[31]認為NOS是血管內皮功能重要的調節因子，通過多種機制參與心血管保護作用，能夠有效抑制糖尿病大血管病變的發生和發展。RXRA是一種視黃酸受體，陳春蓮等[32]發現視黃酸受體反應蛋白水平的升高可能與糖尿病大血管病變的發展有關，患者血漿視黃酸受體反應蛋白、CRP的水平與HbA1c、HOMA-IR的關系呈正相關。為中醫藥治療糖尿病合并缺血性腦卒中提供了有效依據。

GO富集通路分析顯示，“黃芪-川芎”-糖尿病合并缺血性腦卒中的主要環節是BP，如抑制氧化應激反應、調節活性氧代謝、炎癥反應、對有毒物質、類固醇激素、抗生素、異種生物刺激、脂多糖等的響應，改善激素水平（包括類固醇激素、雌激素、性激素等）、調節細胞反應（藥物、異源刺激、類固醇激素刺激等）。CC主要涉及核染色質、核染色體部分、神經細胞體、受體復合體、轉錄因子復合體、突觸膜等部分。MF主要涉及酶結合（蛋白磷酸酶、磷酸酶、蛋白酶、細胞周期蛋白依賴性蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶抑制劑活性等），相關活性因子（類固醇激素受體活性、核受體活性、轉錄因子活性、絲氨酸水解酶活性、抗氧化活性等），蛋白結合（熱激蛋白、肌動蛋白、Hsp90蛋白等）等各方面。KEGG富集通路分析顯示，P-Value排序前20條的信號通路主要涉及PI3K-Akt signaling pathway、MAPK signaling pathway、Endocrine resistance3條內分泌相關代謝通路，以及Ras signaling pathway、ErbB signaling pathway、FoxO signaling pathway、p53 signaling pathway、NF-kappa B signaling pathway、Chemokine signaling pathway、cAMP signaling pathway、Sphingolipid signaling pathway、Calcium signaling pathway、Rap1 signaling pathway等10條信號通路。目前研究發現，PI3K-AKT信號通路是胰島素轉導的重要信號通路，是調控血糖的重要通道[33]。朱百科等[34]發現川芎可通過介導PI3K-AKT信號通路，對腦缺血再灌注具有明顯的保護作用。miR-145可通過靶向MAPK通路保護腦缺血性中風大鼠神經元干細胞[35]。李建設等[36]發現鼠李黃素可能通過抑制MAPK信號通路，修復糖尿病腦梗死大鼠腦組織損傷和炎癥反應。陳麗莉[37]發現糖尿病大血管病變的發生有磷酸化p38MAPK的參與，干預p38MAPK信號轉導通路能夠延緩糖尿病大血管病變的發生、發展。趙海云等[38]通過臨床研究發現自擬益氣滋陰消瘀方可使患者血脂、同型半胱氨酸、纖維蛋白原降低，使患者神經功能提高，進而治療T2DM合并腦梗死。

分子對接結果顯示，槲皮素、黃芪總皂苷、山柰酚與PTGS2主要與135、45、47位甘氨酸，34位天冬酰胺，39位組氨酸等氨基酸殘基發生氫鍵、疏水、范德華力等相互作用。

本次研究對中醫藥治療糖尿病合并缺血性腦卒中進行用藥規律分析，結果表明，高頻應用藥物為黃芪、川芎、當歸、地龍、丹參、赤芍、生地黃等，以補氣養陰、活血化瘀、行滯通痹為主要治法。網絡藥理學分析結果表明，結合分子對接技術將化合物與核心靶點進行結合能探測，進一步探究了“黃芪-川芎”治療糖尿病合并缺血性腦卒中的可能作用機制，預測潛在作用靶點、通路及作用方式，體現了中藥多成分、多靶點、協同作用的特點，為今后臨床應用中醫藥治療糖尿病合并缺血性腦卒中提供了研究方向及用藥依據。