西黃丸對乳腺癌荷瘤小鼠腫瘤組織凋亡及相關因子表達的影響

張曉笛，何麗娟，陳會叢，張瀚濤，靳 冉，夏明鈺

（1.沈陽藥科大學生命科學與生物制藥學院，遼寧 沈陽 110016；2.北京同仁堂科技發展股份有限公司制藥廠，北京 100079；3.北京中研同仁堂醫藥研發有限公司，北京 100079）

三陰性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）在轉移性乳腺癌中所占比例超過50%，其對內分泌治療和常規靶向藥物治療均不敏感[1]，具有極強的侵襲性，復發率高，致死率高，預后不佳。西黃丸具有軟堅散結、清熱解毒、消腫止痛的功效，是治療乳巖、肺癰、痰核、瘰癘之名方。多項臨床和實驗研究表明，西黃丸可抑制腫瘤細胞和腫瘤干細胞的生長、侵襲和腫瘤組織內血管生成，還可通過提高機體免疫力，逆轉免疫抑制微環境，抑制腫瘤的發生發展和侵襲轉移[2-5]。目前關于西黃丸治療三陰性乳腺癌的研究報道很少，因此，本實驗采用人乳腺癌細胞株MDA-MB-435建立三陰性乳腺癌移植瘤模型，觀察西黃丸對腫瘤生長、腫瘤病理形態學、腫瘤組織凋亡及相關蛋白和mRNA表達的影響，探討西黃丸對MDA-MB-435乳腺癌移植瘤小鼠腫瘤生長及腫瘤組織凋亡的影響。

1 材 料

1.1 實驗動物6～8周齡SPF級雌性BALB/c-nu裸鼠40只，購于北京維通利華實驗動物有限公司，動物合格證號：1140070 0187530，體質量16～22 g。小鼠飼養于SPF級動物室內，日光燈照明，12 h明暗周期，自由飲水、飲食，溫度20～26℃，送風6～10次/h，濕度40%～70%。本實驗經北京同仁堂研究院醫學實驗動物倫理委員會批準。

1.3 藥物與試劑 西黃丸（北京同仁堂科技發展股份有限公司制藥廠，批號：15042143）；RNA提取試劑盒（TaKaRa公司，批號：AA2403-1）；RNA PCR擴增試劑盒（TaKaRa公司，批號：AK5701）；Gene Finder TM（至善生物，批號：151217）；TUNEL染色試劑盒（美國羅氏制藥公司，批號：11684817910）。

1.4 主要儀器ST5010型全自動組織切片染色機（德國Leica公司）；RM2235型石蠟切片機（德國leica公司）；BX61型光學顯微鏡（日本Olympus公司）；UV2300型紫外分光光度計（上海天美）；PCR基因擴增儀（北京東勝創新生物科技有限公司）；MiniBis ProUV凝膠成像儀（以色列DNR）；水平電泳槽（北京六一生物科技有限公司）。

2 方 法

2.1 細胞傳代及培養 將人乳腺癌細胞MDA-MB-435置于恒溫培養箱中（37℃，5%CO2）采用L15完全培養液培養，2～3 d傳代一次（細胞貼壁長至培養瓶的80%～90%）。傳代方法：吸去培養瓶中培養液，用PBS液沖洗后加入0.25%胰蛋白酵消化，待消化完全后，加入L15完全培養液終止消化，輕柔吹打貼壁細胞后分裝，每天觀察細胞生長情況。

2.2 人乳腺癌移植瘤造模方法 吸去培養瓶中培養液，用PBS液沖洗后加入0.25%胰蛋白酶消化，輕柔吹貼壁細胞，收集所有培養瓶中的單細胞懸液，置入離心機中離心（1 200 r/min，5 min），棄上層清液，在細胞計數板下調整細胞密度。在無菌操作臺下用75%酒精消毒接種處皮層，抽取人乳腺癌細胞懸液0.2 mL，于裸鼠腋部皮下緩慢注射，注射后用消毒棉簽輕壓片刻，待接種處皮膚稍隆起后將裸鼠放回。

2.3 分組及給藥 接種10 d后，剔除5只造模未成功者，將35只乳腺癌荷瘤小鼠按體質量隨機方法分為模型組，環磷酰胺組和西黃丸高、中、低劑量組，每組7只。西黃丸高、中、低劑量組荷瘤小鼠灌胃西黃丸，給藥劑量分別為1.8、0.9、0.45 g/kg；環磷酰胺組荷瘤小鼠灌胃環磷酰胺，給藥劑量為36 mg/kg，模型組荷瘤小鼠以等體積的純水灌胃，1次/d，給藥體積均為20mL/kg。連續給藥3周后，將荷瘤小鼠脫頸椎處死，其中西黃丸低劑量組2只和西黃丸中劑量組1只因灌胃嗆死。處死荷瘤小鼠后小心分離腫瘤組織，用游標卡尺量取腫瘤長、短直徑，稱質量，一半用多聚甲醛固定，一半凍存液氮中備用。

2.4 觀察指標

2.4.1 脾臟指數檢測 荷瘤小鼠脫頸椎處死后，小心分離腫瘤組織，打開腹腔，剝離脾臟，去除多余脂肪，稱質量，計算脾臟指數。脾臟指數=脾臟濕質量/體質量×100%。

2.4.2 腫瘤病理組織形態學檢測 將腋下腫瘤組織，放置于多聚甲醛中固定，組織固定2周，將腫瘤組織置于包埋盒中進行組織脫水、包埋，制作臘塊。組織臘塊切為3μm厚度貼于病理級玻片上，45℃烤片數分鐘后進行HE染色。中性樹膠封片，鏡下進行形態學觀察。

山洪災害防御預案的編制堅持以人為本的原則，以保障人民群眾生命安全為首要目標；堅持安全第一，常備不懈，以防為主，防、避、搶、救相結合；堅持因地制宜，突出重點，具有可操作性；堅持落實行政首長防汛責任制、分級管理責任制、分部門責任制和崗位責任制。

2.4.3 腫瘤病理組織免疫組化檢測 免疫組化檢測方法：石蠟切片常規脫水，加3%H2O2滅活源性過氧化物活性，加山羊血清封閉，滴加一抗，4℃過夜，PBS液沖洗后滴加二抗，DAB顯色，蘇木素復染，鹽酸酒精分色，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。顯微鏡下觀察，拍片，光學顯微鏡下取圖，采用Image-ProPlus 6.0軟件統計分析。

2.4.4 TUNEL法檢測腫瘤組織細胞凋亡程度 組織蠟塊制備3μm切片，常規二甲苯脫蠟，按照試劑盒說明書進行操作，DAB顯色，蘇木素輕度復染，脫水透明、封片，光學顯微鏡下取圖，采用Image-Pro Plus 6.0軟件統計分析，計算各組荷瘤小鼠腫瘤組織細胞凋亡情況。

2.4.5 RT-PCR方法檢測凋亡基因Bax、Caspase-3和原癌基因Bcl-2的mRNA表達 采用Trizol法提取細胞總RNA，經RT反應和PCR反應之后，擴增產物瓊脂糖電泳，采用MiniBis Pro凝膠成像分析儀進行圖像分析，并用Gelpro32凝膠圖像分析軟件對PCR產物進行半定量分析，分別用目的基因/內參基因的積分吸光度來表示目的基因的mRNA表達水平。

2.5 統計學方法 采用SPSS 25.0軟件進行分析，計量資料以“均數±標準差”（±s）表示，數據先進行方差齊性檢驗，方差齊選用One-Way ANOVA法進行各組間比較，方差不齊選用t’檢驗進行組間比較。以P〈0.05為有統計學意義

3 結 果

3.1 各組荷瘤小鼠腫瘤生長情況 環磷酰胺組和西黃丸高、中、低劑量組荷瘤小鼠腫瘤體積均低于模型組，但差異無統計學意義（P〉0.05）；環磷酰胺組和西黃丸高劑量組荷瘤小鼠腫瘤質量均低于模型組（P〈0.05），西黃丸中劑量組荷瘤小鼠腫瘤質量低于模型組，但差異無統計學意義（P〉0.05）。（見表1）

表1 各組荷瘤小鼠腫瘤生長情況比較（±s）

表1 各組荷瘤小鼠腫瘤生長情況比較（±s）

注：與模型組比較，aP〈0.05

組別 動物數（只）給藥劑量（g/kg）體積（mm3）腫瘤質量（g）模型組 7 - 433.4±179.9 0.371±0.136環磷酰胺組 7 0.036 286.4±176.5 0.202±0.124a西黃丸高劑量組7 1.800 343.8±182.1 0.216±0.107a西黃丸中劑量組6 0.900 350.2±204.3 0.283±0.093西黃丸低劑量組5 0.450 358.8±135.8 0.275±0.100

3.2 各組荷瘤小鼠體質量、脾臟濕質量、脾臟指數比較5組荷瘤小鼠體質量比較，差異無統計學意義（P〉0.05）；環磷酰胺組荷瘤小鼠脾臟濕質量和脾臟指數均低于模型組（P〈0.05），西黃丸中劑量組荷瘤小鼠脾臟濕質量和脾臟指數均高于模型組（P〈0.05）；西黃丸中、高劑量組荷瘤小鼠脾臟濕質量和脾臟指數均高于環磷酰胺組（P〈0.01），西黃丸低劑量組荷瘤小鼠脾臟濕質量和脾臟指數與模型組和環磷酰胺組比較，差異無統計學意義（P〉0.05）。（見表2）

表2 各組荷瘤小鼠體質量、脾臟濕質量、脾臟指數比較（±s）

表2 各組荷瘤小鼠體質量、脾臟濕質量、脾臟指數比較（±s）

注：與模型組比較，aP〈0.05；與環磷酰胺組比較，bP〈0.01

組別 動物數（只）體質量（g） 脾臟濕質量（g）脾臟指數（%）模型組 7 15.14±1.01 0.071±0.011 0.447±0.059環磷酰胺組 7 15.08±0.91 0.049±0.010a 0.322±0.064a西黃丸高劑量組 7 15.59±0.64 0.082±0.022b 0.523±0.134b西黃丸中劑量組 6 16.06±1.16 0.096±0.028a b 0.606±0.214a b西黃丸低劑量組 5 15.77±0.33 0.068±0.005 0.428±0.026

3.3 各組荷瘤小鼠腫瘤組織病理形態比較 各組荷瘤小鼠腫瘤組織中腫瘤細胞呈彌漫性生長，緊密排列在一起。模型組荷瘤小鼠腫瘤細胞異型性明顯，腫瘤細胞體積較大者居多，細胞核大而深染，核漿比例明顯增大，細胞核可見病理性核分裂像。環磷酰胺組和西黃丸高、中、低劑量組荷瘤小鼠腫瘤細胞異型性較模型組低，腫瘤組織出現壞死區域，壞死區伊紅染色呈現無結構顆粒狀。其中環磷酰胺組荷瘤小鼠腫瘤組織見大量泡沫細胞形成，瘤周可見淋巴細胞反應。西黃丸高劑量組荷瘤小鼠腫瘤細胞有所退變，殘存的腫瘤細胞較少，腫瘤細胞核深染、固縮。（見圖1）

圖1 各組荷瘤小鼠腫瘤組織的形態學比較（HE，×400）

3.4 各組荷瘤小鼠腫瘤組織細胞凋亡的表達比較TUNEL染色陽性產物表現為棕黃色，多集中于胞漿、胞膜及核膜上。模型組荷瘤小鼠腫瘤組織細胞凋亡表達不明顯，著色較淺，局部區域表現為淺黃色，西黃丸低劑量組荷瘤小鼠腫瘤組織細胞凋亡局部表達明顯，呈弱陽性，西黃丸中、高劑量組荷瘤小鼠腫瘤組織凋亡組織表現出棕黃色，范圍廣，呈強陽性表達。與模型組比較，環磷酰胺組和西黃丸高、中劑量組荷瘤小鼠腫瘤組織凋亡區域明顯增加（P〈0.05或P〈0.01）。（見圖2～3）

圖2 各組荷瘤小鼠腫瘤組織細胞凋亡情況比較（TUNEL染色，×400）

Bax免疫組化法陽性表達為棕黃色，模型組荷瘤小鼠腫瘤組織細胞凋亡表達不明顯，環磷酰胺組和西黃丸高劑量組荷瘤小鼠腫瘤組織凋亡組織表達明顯，范圍廣，呈強陽性表達，與模型組比較，陽性表達顯著增加（P〈0.01）。（見圖4～5）

圖4 各組荷瘤小鼠腫瘤組織Bax蛋白表達的形態學比較（免疫組化，×400）

圖3 各組小鼠腫瘤細胞凋亡情況比較（±s）

圖5 各組荷瘤小鼠腫瘤組織Bax蛋白表達情況比較（±s）

3.5 各組荷瘤小鼠腫瘤組織凋亡基因Bax mRNA、Caspase-3 mRNA和原癌基因Bcl-2 mRNA比較 與模型組比較，環磷酰胺組和西黃丸高劑量組荷瘤小鼠腫瘤組織Caspase-3 mRNA的表達明顯升高（P〈0.05），表明環磷酰胺和高劑量西黃丸對Caspase-3 mRNA的表達也有一定的促進作用；與模型組比較，環磷酰胺組及西黃丸各劑量組Bax mRNA均明顯降低（P〈0.05），表明環磷酰胺及高、中、低劑量西黃丸可顯著下調Bax基因的比率；與模型組比較，西黃丸高劑量組荷瘤小鼠腫瘤組織Bcl-2 mRNA的表達明顯降低（P〈0.05）。（見圖6～7）

圖6 各組裸鼠瘤體組織Bax、Bcl-2、Caspase-3 mRNA的表達情況（RT-PCR）

圖7 各組荷瘤小鼠瘤體組織Bax mRNA、Caspase-3 mRNA、Bcl-2 mRNA表達比較（±s）

4 討 論

細胞凋亡是細胞在一定條件下接受刺激信號并受基因調控的一種自主性、程序性死亡過程[6]，對于細胞凋亡方面的研究，近些年取得了關鍵性進展。細胞凋亡涉及到一系列蛋白及轉錄因子的激活、表達及調控等作用，其中Bcl-2家族蛋白、Caspase家族蛋白和p53蛋白等在調控的信號轉導中扮演著重要角色[7]。Bcl-2家族是一組原癌基因蛋白，包含抑制和促進細胞凋亡兩類功能相反的一組蛋白質，Bcl-2和Bax是Bcl-2家族一對相反的調控因子[8]，Bcl-2存在人體多種形態的腫瘤組織中，Bax可與Bcl-2蛋白形成異二聚體，中和Bcl-2抗凋亡信號，激活下游凋亡因子，從而促進凋亡，二者的比例決定細胞接受凋亡信號的多少[9]。抑癌基因TP53可由輻射、化學物質、氧化應激等誘導的DNA損傷等應激反應激活，從而轉錄誘導多種凋亡蛋白（PUMA、NOXA、Bax等）表達啟動凋亡，維持機體基因組的穩定性[10]。COX-2可能通過蛋白激酶C（PKC）依賴途徑抑制腫瘤細胞的凋亡發生，有研究顯示COX-2抑制劑可使PG合成減少，從而下調Bcl-2的表達，導致細胞凋亡[11]。

惡性腫瘤與中醫所述之“積聚”“癥瘕”較為類似，中醫理論認為本虛標實是癌癥的主要病機，當代醫家指出癌癥以虛致實的理論，認為氣血虛損及臟腑虛損，導致人體三焦道路、人體經絡失于通暢，進而產生諸如痰、瘀、內毒及內火等病理產物，因此多虛中夾實[12]。西黃丸作為抗腫瘤的中成藥在臨床上被廣泛使用，有“抗癌第一中成藥”的美譽。西黃丸中牛黃清熱解毒化痰，為君藥；麝香辛竄通絡，活血散結，并助牛黃化痰之力，為臣藥；乳香、沒藥活血祛瘀，消腫止痛，為佐藥；黃米飯養胃，陳酒活血行氣以助藥力，共為使藥，全方合用以達清熱解毒、和營消腫之功效。西黃丸常用來治療淋巴結核、乳腺增生、丹毒、皰疹口瘡、多發性膿腫等疾病。現代醫學研究也表明西黃丸具有抗腫瘤作用[13-15]。

前期結果提示西黃丸大鼠含藥血清對乳腺癌細胞株MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-435細胞增殖均有不同程度的抑制作用，西黃丸含藥血清對乳腺癌細胞株MDA-MB-435、MDA-MB-231和MCF-7細胞凋亡有一定的促進作用，并且對三陰性乳腺癌細胞株的抑制作用更強[16]。本實驗研究在前期研究結果的基礎上，采用人乳腺癌細胞株MDA-MB-435在裸鼠腋下注射建立三陰性乳腺癌細胞株移植腫瘤模型（CDX），西黃丸經口灌胃給藥3周后檢測腫瘤質量、體積、脾臟指數、病理學改變、腫瘤組織凋亡情況及和凋亡相關mRNA的表達，以評價西黃丸治療乳腺癌的作用。

本研究顯示，西黃丸干預乳腺癌CDX后，西黃丸在一定程度上可以降低乳腺癌CDX腫瘤組織瘤質量，對乳腺癌CDX所致的腫瘤生長、演進有一定抑制作用。西黃丸灌胃給藥乳腺癌CDX后，腫瘤組織中Bax mRNA和Casepase-3 mRNA的表達均有所降低，同時可以下調腫瘤組織中Bcl-2 mRNA的表達，經TUNEL染色結果表明西黃丸可以增加腫瘤組織中凋亡區域的面積，可以誘導腫瘤組織中腫瘤細胞凋亡，凋亡程度與西黃丸給藥劑量呈正相關。免疫組化結果顯示，西黃丸低、中、高劑量組Bax蛋白表達含量依次增加，而PCR結果顯示，西黃丸高、中、低劑量組Bax mRNA表達依次增加，這可能是西黃丸可促進Bax mRNA加速翻譯成蛋白，也可能是其他的原因尚需進一步研究探索。綜上所述，對腫瘤組織中腫瘤細胞凋亡相關環節的誘導和調控可能是西黃丸發揮抗乳腺癌的重要效應機制。