蒙藥紹沙七味丸對心肌缺血大鼠的心臟保護作用及炎癥機制研究*

敖道夫，榮 君，小 花，巴乙拉嘎，陳紅梅

（內蒙古民族大學附屬醫院，內蒙古 通遼 028000）

心肌缺血（myocardial ischemia）是指心臟的血液灌注減少，導致心臟的供氧減少，心肌能量代謝不正常，不能支持心臟正常工作的一種病理狀態。目前心肌缺血在我國的患病率呈逐年上升的趨勢，已成為中老年人的常見病和多發病，甚至20～30歲的年輕人也出現心肌缺血的表現。臨床上對嚴重的心肌缺血可實行冠脈搭橋術、冠狀動脈介入治療，但治療費用昂貴，不易被廣大患者所接受，藥物治療仍然是這類疾病的主要防治方式。

蒙藥紹沙七味丸出自《驗方》，是治療心臟病的常用蒙藥，由廣棗、丁香、肉豆蔻、沉香、木香、阿魏、野牦牛心組成，具有抑心赫依、安神定志、增強心功能效果，用于治療心赫依、心悸、心衰、氣喘、失眠、胸痛、癲狂等癥[1]，故沿用至今。該藥物治療心臟疾病療效確切，對冠心病、心肌缺血、心絞痛、心悸、慢性心力衰竭等疾病臨床療效顯著，無不良反應[2-4]，可達到標本兼顧的功效。本實驗根據蒙藥紹沙七味丸的臨床應用情況及療效，結扎左冠狀動脈建立心肌缺血大鼠模型，探討該藥物對心肌缺血的保護作用及其炎癥機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物11周齡SPF級SD雄性大鼠70只，體質量200～220 g，購自長春市伊斯實驗動物技術有限責任公司，生產許可證號：SCXK（遼）2015-0001，飼養溫度22～25℃，濕度45%～65%，光照12 h明暗交替，給予標準飼料和飲用水，飼養環境為清潔級。本實驗通過內蒙古民族大學附屬醫院醫學倫理委員會的批準，批準號：NM-LL-2017-03-09-01。

1.2 藥物與試劑 蒙藥紹沙七味丸（內蒙古民族大學附屬醫院蒙藥房，批號：20180225，規格：15 g/瓶），粉碎成細粉，用0.5%CMC-Na緩沖溶液配制成所需質量濃度使用；復方丹參片（鄭州瑞龍制藥股份有限公司，批號：180314）；CK-MB（批號：34413701）、LDH（批號：35625301）[羅氏診斷產品（上海）有限公司]；IL-6 ELISA試劑盒（批號：20160507A）、TNF-α ELISA試劑盒（批號：20160428A）（上海源葉生物科技有限公司）；NF-kB抗體（北京博奧森生物有限公司，貨號：bs-1704R）。

1.3 主要儀器Animal Bio Amp心電圖儀[艾德儀器國際貿易（上海）有限公司]；HX-300S動物人工呼吸機（成都泰盟科技有限公司）；SC-05低速離心機（安徽中科中佳科學儀器有限公司）；Cobas C311羅氏生化分析儀（日本hitachi high technologies公司）；SUNRISE酶標儀（奧地利亞Tecan）；RM2245石蠟切片機（德國LEICA公司）；HI1210組織烘片機（德國LEICA公司）；HI1220組織攤片機（德國LEICA公司）；EG1150H組織包埋機（德國LEICA公司）；101A-2E電熱鼓風干燥箱（上海精宏實驗室設備有限公司）；DHP-9082型電熱恒溫培養箱（上海精宏實驗室設備有限公司）；U410-86超冷凍冰箱（英國Eppendorf公司）。

1.4 分組與給藥 從70只大鼠中隨機取10只作為正常組，其余60只大鼠按體質量隨機分為模型組、蒙藥紹沙七味丸低劑量組、蒙藥紹沙七味丸中劑量組、蒙藥紹沙七味丸高劑量組和復方丹參片組，每組12只。根據等效劑量計算，蒙藥紹沙七味丸低、中、高劑量組大鼠分別以0.80、1.60、3.20 g/kg劑量灌胃蒙藥紹沙七味丸溶液；復方丹參片組大鼠按0.25 g/kg劑量灌胃給予復方丹參片溶液，正常組、模型組大鼠給予等體積的蒸餾水。給藥體積為2 mL/100 g，1次/d，連續給藥14 d。

1.5 造模方法 大鼠手術前12 h禁食不禁水，10%水合氯醛麻醉，固定在專用固定板上，連接生物機能實驗系統，檢測大鼠心電圖，將大鼠氣管切開，連接小動物呼吸機。方法如下：胸部備皮，沿左胸骨中線切開線形皮膚約2～3 cm缺口，在第4肋間開胸，擴胸，除去心包膜，擠出心臟，在左心耳根部和肺動脈圓錐交界處，穿細線結扎[5]。觀察結扎線以下心肌顏色發生變化（左心室心肌呈充血暗紅色，且前壁運動減弱），并且心電圖S-T段顯著抬高，說明成功復制急性心肌缺血動物模型[6]。

1.6 觀察指標

1.6.1 血清指標的測定 造模成功后3 h從腹主動脈采血，置于室溫10 min，低溫高速離心機以3 500 r/min離心10 min，分離血清，全自動生化分析儀檢測血清肌酸激酶同工酶（CK-MB）、乳酸脫氫酶（LDH）水平；ELISA法檢測血清IL-6、TNF-α的含量。

1.6.2 心臟組織病理學觀察 處死動物后取心臟組織固定在4%多聚甲醛中，石蠟包埋，3μm厚度切片做HE染色，光學顯微鏡400倍條件下觀察心臟組織病理變化。

1.6.3 心臟組織NF-κB蛋白表達的檢測 每組隨機取6只大鼠心臟組織，在4%多聚甲醛固定，根據試劑盒的要求免疫組化法檢測腎組織的NF-κB蛋白表達，免疫組化最后采用Motic Images Advanced3.2圖像分析軟件進行半定量分析，測定陽性表達強度用光密度值（OD值）表示；OD值越小陽性表達強度越弱既表達量少，OD值越大陽性表達強度越強既表達量多。每張切片400倍光學顯微鏡下，選取連續5個視野測定所得的平均值。

1.7 統計學方法 采用SPSS Statistics 19.0統計軟件進行數據分析，計量資料以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，P〈0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

在造模手術過程中模型組死亡1只，原因為慢性心衰；蒙藥紹沙七味丸低劑量組死亡2只，原因為呼吸衰竭、失血性休克；蒙藥紹沙七味丸高劑量組死亡1只，原因為慢性心衰。因此，各組大鼠數量最終確定為10只。

2.1 各組大鼠血清CK-MB、LDH水平比較 模型組大鼠血清CK-MB、LDH水平均明顯高于正常組（P〈0.01）；蒙藥紹沙七味丸低、中、高劑量組和復方丹參片組大鼠血清CK-MB、LDH水平均明顯低于模型組（P〈0.05或P〈0.01），蒙藥紹沙七味丸中劑量組大鼠血清CK-MB水平低于復方丹參片組（P〈0.05），LDH水平與復方丹參片組比較，差異無統計學意義（P〉0.05）。（見表1）

表1 各組大鼠血清CK-MB、LDH水平比較（±s，mmol/L）

表1 各組大鼠血清CK-MB、LDH水平比較（±s，mmol/L）

注：與正常組比較，aP〈0.01；與模型組比較，bP〈0.05，cP〈0.01；與復方丹參片組比較，dP〈0.05

組別 動物數（只）給藥劑量（g/kg）CK-MB LDH正常組 10 - 55.29±2.97 232.57±14.95模型組 10 - 173.59±9.16a 558.38±15.53a蒙藥紹沙七味丸低劑量組10 0.80 165.13±6.57b 539.50±12.16b蒙藥紹沙七味丸中劑量組10 1.60 158.39±7.52cd 498.14±10.93c蒙藥紹沙七味丸高劑量組10 3.20 159.82±7.04c 508.83±13.30c復方丹參片組 10 0.25 165.04±7.13b 502.33±11.67c

2.2 各組大鼠血清IL-6、TNF-α含量比較 模型組大鼠血清IL-6、TNF-α含量明顯高于正常組（P〈0.01）；蒙藥紹沙七味丸中、高劑量組和復方丹參片組大鼠血清IL-6含量均明顯低于模型組（P〈0.05或P〈0.01），蒙藥紹沙七味丸低劑量組大鼠血清IL-6含量與模型組比較，差異無統計學意義（P〉0.05）；蒙藥紹沙七味丸低、中、高劑量組和復方丹參片組大鼠血清TNF-α含量均明顯低于模型組（P〈0.05或P〈0.01）。（見表2）

表2 各組大鼠血清IL-6、TNF-α含量比較（±s，pg/mL）

表2 各組大鼠血清IL-6、TNF-α含量比較（±s，pg/mL）

注：與正常組比較，aP〈0.01；與模型組比較，bP〈0.05，cP〈0.01

組別 動物數（只）給藥劑量（g/kg）IL-6 TNF-α正常組 10 - 18.26±1.67 49.64±4.83模型組 10 - 29.83±2.12a 63.41±6.59a蒙藥紹沙七味丸低劑量組10 0.80 28.20±1.55 56.29±6.31b蒙藥紹沙七味丸中劑量組10 1.60 26.63±0.92c 54.34±6.99c蒙藥紹沙七味丸高劑量組10 3.20 27.27±1.50c 54.08±7.85b復方丹參片組 10 0.25 27.75±1.91b 54.31±6.39c

2.3 各組大鼠心臟組織病理學改變情況 正常組大鼠心肌纖維排列規則、緊密，心肌纖維細胞核長橢圓形，心肌纖維間未見出血、滲出物、炎癥細胞；模型組大鼠大部分心肌纖維排列紊亂、松散、心肌纖維斷裂、細胞核固縮，心肌纖維間可見大量出血、滲出物，少量炎癥細胞；蒙藥紹沙七味丸低劑量組大鼠心肌纖維間可見較多出血滲出物，但較模型組病變程度輕；蒙藥紹沙七味丸中劑量組大鼠病變程度輕于蒙藥紹沙七味丸低劑量組，部分心肌纖維排列紊亂、松散、心肌纖維斷裂、細胞核固縮，心肌纖維間可見出血、滲出物；蒙藥紹沙七味高劑量組大鼠病變程度輕于蒙藥紹沙七味丸中劑量組，心肌纖維間可見少量出血、滲出物，極少量炎癥細胞；復方丹參片組大鼠病變較為嚴重，心肌纖維排列紊亂、松散、纖細、心肌纖維斷裂、細胞核固縮，心肌纖維間可見出血、滲出物、炎癥細胞。

2.4 各組大鼠心臟組織NF-κB蛋白表達量比較NF-κB表達位于細胞質和少部分細胞核，細胞核用蘇木精復染陰性為藍色，陽性紫黑色。免疫組化半定量分析顯示，模型組大鼠心臟組織NF-κB蛋白表達量明顯高于正常組（P〈0.01）；蒙藥紹沙七味丸中劑量組和復方丹參片組大鼠心臟組織NF-κB蛋白表達量明顯低于模型組（P〈0.05），蒙藥紹沙七味丸低、高劑量組大鼠心臟組織NF-κB蛋白表達量與模型組比較，差異無統計學意義（P〉0.05）。（見表3）

表3 各組大鼠心臟組織NF-κB蛋白表達的平均光密度值比較（±s）

表3 各組大鼠心臟組織NF-κB蛋白表達的平均光密度值比較（±s）

注：與正常組比較，aP〈0.01；與模型組比較，bP〈0.05

組別 動物數（只）給藥劑量（g/kg）NF-κB正常組 6 - 109.78±10.88模型組 6 - 173.19±14.20a蒙藥紹沙七味丸低劑量組6 0.80 162.10±11.37蒙藥紹沙七味丸中劑量組6 1.60 159.60±10.02b蒙藥紹沙七味丸高劑量組6 3.20 161.32±10.90復方丹參片組 6 0.25 161.39±9.58b

圖1 各組大鼠心臟組織病理切片圖（HE，×400）

3 討 論

心肌缺血損傷是一種復雜的病理過程，急性心肌梗死也是一種炎癥過程，而細胞因子在炎癥反應過程中起著非常重要的作用，炎癥反應過度表達是心肌損傷的主要機制之一。IL-6和TNF-α為眾多炎癥細胞因子中比較特別的[7]，都是重要的炎癥介質，當心肌缺血發生時，可引起TNF-α、IL-6等促炎性細胞因子釋放，促使中性粒細胞向損傷區域聚集，組織浸潤增加，從而引發炎癥反應，同時產生大量自由基，加劇組織損傷[8-9]。IL-6在炎癥反應中起核心調節作用，IL-6基因表達的多態性可影響機體炎癥、免疫反應程度，與冠心病發病的易感性有關，是冠脈斑塊炎癥事件重要的局部和循環標記物，被認為是冠心病發病的重要候選基因之一[10]。TNF-α可引起腫瘤組織出血性壞死，是一種促炎性細胞因子，主要由激活的單核-巨噬細胞產生，具有廣泛的生物學效應及生物學功能。在應激狀態下，TNF-α在心肌大量表達，可以通過多種途徑影響心肌功能，啟動信號轉導系統，并造成心肌損傷[11]。在各種心臟疾病如心肌缺血/再灌注損傷、缺血預處理、不穩定型心絞痛、充血性心力衰竭、心肌炎及擴張性心肌病等都存在NF-κB激活[12]。NF-κB通過對多種炎癥相關的細胞因子、黏附分子等基因的轉錄調控，導致心肌炎癥反應，促發凋亡、壞死、心功能衰竭等，導致心肌缺血損傷，它的激活與抑制直接關系到炎癥損傷的進展與預后[13]。心肌缺血時，TNF-α、IL-6往往共同發生作用，在激活的心肌組織細胞可分泌多種細胞因子，這些細胞因子共同發揮強大的致炎作用，且通過NF-κB信號轉導系統調節心肌細胞的功能。

蒙藥紹沙七味丸中廣棗中的黃酮類及有機酸等成分的存在使其具有多種生理活性，包括抗心律失常作用、保護缺血心肌作用、影響血液動力學、抗氧化、增強免疫力等生理活性[14]；原兒茶酸具有降低心肌耗氧量，提高心肌耐缺氧能力作用，可降低冠脈阻力，顯著縮小心肌梗死范圍[15]。野牦牛心（由于野牦牛為國家保護動物，野牦牛心藥材稀缺，故多用牛心，兔心替代）富含的甘氨酸[16]、精氨酸[17]等均具有保護心臟、治療缺血性心臟病、改善心功能等作用。輔藥肉豆蔻揮發油可減慢心率，降低心律失常的發生率，同時降低心肌細胞損傷所釋放的GOT、CK、LDH的含量，降低MDA和升高SOD的活性，從而對大鼠心肌缺血再灌注損傷具有保護作用[18]。木香有效成分主要為萜類、生物堿、蒽醌、黃酮等，能保護心臟，治療缺血性心臟病。低濃度的木香揮發油對離體兔心有抑制作用。從木香揮發油中分離出的成分均能不同程度地抑制豚鼠、兔和蛙的離體心臟活動[19]。阿魏具有保護心血管，以及增加心率的作用[20]。

本研究中，蒙藥紹沙七味丸各給藥組均可不同程度地降低冠狀動脈結扎復制大鼠急性心肌缺血模型大鼠的血清CK-MB、LDH含量，并能不同程度地下調血清IL-6、TNF-α水平和心臟組織NF-κB蛋白的表達，從而改善心臟組織的病理改變。蒙藥紹沙七味丸對急性心肌缺血損傷有一定的保護作用，其中蒙藥紹沙七味丸中、高劑量組作用更佳，低劑量組作用其次。蒙藥紹沙七味丸的抗炎癥機制可能與IL-6、TNF-α炎癥因子水平與NF-κB蛋白的表達有關。

圖2 各組大鼠心臟組織NF-κB表達情況（免疫組化，×400）