六味地黃膏膏摩對腦癱幼鼠大腦皮層損傷修復及BDNF/TrkB表達的影響*

張星賀，宋詠麗，高永超，邰先桃，井夫杰

（1.云南中醫藥大學針灸推拿康復學院，云南 昆明 650500；2.成都中醫藥大學藥學院，四川 成都 611137；3.山東中醫藥大學針灸推拿學院，山東 濟南 250355）

腦性癱瘓（cerebral palsy，CP）簡稱腦癱，是一種嚴重的腦部損傷綜合征，通常表現為發育遲緩甚至停滯，運動、感覺、認知、交流及行為障礙，常伴有癲癇及繼發性肌肉骨骼疾病等，發病率為2‰～3.5‰[1-3]。CP患兒所造成的財力、物力及精力消耗數倍甚至十數倍于正常小兒，給社會及家庭造成沉重的負擔[4]。尋找能夠修復患兒腦損傷，提高患兒生存質量，以及降低家庭負擔的治療方式，是當代婦產、兒科、康復等醫學領域亟須解決的問題。團隊前期研究發現，六味地黃膏膏摩能夠促進CP幼鼠生長發育，影響大腦血流供給[5]；還可促進CP患兒的體格發育、改善體質[6]；但六味地黃膏膏摩能否促進CP腦損傷的修復尚不清楚。該研究在“腎腦相關”理論指導下，使用六味地黃膏膏摩對CP幼鼠進行干預，并與單純推拿、單純涂六味地黃膏相比較。觀察六味地黃膏膏摩對CP幼鼠大腦皮層損傷修復的效果并探究六味地黃膏膏摩是否能夠調控BDNF/TrkB信號通路，以期為六味地黃膏膏摩的臨床應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物SPF級SD大鼠18只（雌鼠6只、雄鼠12只），體質量250～280 g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，實驗動物合格證號：43004700063963。飼養于昆明醫科大學基礎醫學院清潔級動物房獨立喂養籠具（Individual ventilated caging system,IVC）中，每籠內雌鼠1只，雄鼠2只，室溫22～26℃，相對濕度50%～60%，光照12 h，黑暗12 h。雌鼠雄鼠自由交配，待雌鼠妊娠后與雄鼠分籠，單獨喂養至分娩。該實驗經云南中醫藥大學動物實驗倫理委員會批準，動物試驗倫理批號：2018 YZ0423。實驗動物從業人員資格證書號（云南省）：LA2017163。

1.2 藥物與試劑 六味地黃膏按照團隊前期已獲授權的國家發明專利技術進行制作[7]，六味地黃膏用量參照《藥理實驗方法學》“動物與人體等效劑量折算系數”[8]，計算得出CP幼鼠每日用量為33.8 g/kg。兔抗大鼠BDNF一抗（批號：ab108319）、兔抗大鼠TrkB一抗（批號：ab18987）、小鼠抗大鼠β-actin一抗（批號：ab8224）、羊抗兔二抗（批號：ab205718）、羊抗小鼠二抗（批號：ab205719）（Abcam公司）；BDNF ELISA試劑盒（批號：ml302829）、TrkB ELISA試劑盒（批號：ml035685）（上海酶聯生物科技有限公司）；尼氏染色試劑盒（Solarbio公司，批號：G1430）。

1.3 主要儀器ChemiDoc XRS+凝膠成像儀（美國BIO-RAD公司）；Multiskan FC酶標儀（美國賽默飛世爾科技公司）；Spectra酶標儀（美國美谷分子儀器有限公司）；Primo Star正置生物顯微鏡（德國卡爾蔡司公司）。

1.4 造模與分組 于幼鼠出生后第2天稱體質量，選取50只體質量7～11 g的幼鼠作為備選對象。第3天造模前，采用RAND函數隨機選擇10只幼鼠作為假手術對照組，其余40只幼鼠采用左側頸總動脈凝斷合并缺氧的方式制備CP模型。采用異氟烷麻醉幼鼠，以幼鼠停止活動，四肢癱軟，掐尾無反應為度；用75%酒精棉球對頸部皮膚進行消毒處理后，在解剖顯微鏡下切開頸部正中偏左側皮膚，找到左側頸總動脈；分離附近組織及伴行神經，提起血管并使用電凝筆凝斷左側頸總動脈；縫合傷口并消毒；幼鼠復蘇后，將其置于37℃恒溫的密閉缺氧箱中，氧含量6%，缺氧3 h后取出。假手術對照組同樣在麻醉后切開頸部正中偏左側皮膚，找到左側頸總動脈，但不予血管凝斷及缺氧。造模后再次采用RAND函數將40只CP模型幼鼠隨機分為模型對照組、推拿組、涂膏組及膏摩組。

1.5 實驗干預 自第4天開始，推拿組采用指摩法對腎俞穴進行操作，60次/min，壓力為0.25～0.35 N，每次2 min，1次/d，共干預28 d。涂膏組將六味地黃膏涂于腎俞穴部位（不予多余的抹動），1次/d，共干預28 d。膏摩組將六味地黃膏涂于腎俞穴部位，并采用指摩法進行推拿操作，60次/min，壓力為0.25～0.35 N，每次2 min，1次/d，共干預28 d。假手術對照組、模型對照組不予干預操作，在其余3組接受干預操作的同時將其與母鼠分籠進行禁食處理。

1.6 觀察指標 干預28 d后將幼鼠麻醉處死，抽取心尖血并取上清液，-80℃超低溫冰箱儲存備用。在每組幼鼠內取5只幼鼠大腦組織制成石蠟切片（10μm）；剩余5只幼鼠進行取材，取出大腦皮層后立刻進行裂解，離心后取上清液，作為皮層的樣品蛋白，-80℃超低溫冰箱儲存備用。

1.6.1 神經元形態數量 采用尼氏染色法觀察大腦皮層神經元數量及形態分布。大腦石蠟切片65℃烘烤5 min，經脫蠟水化后，按照尼氏染色試劑盒說明書進行染色，脫水透明后中性樹膠封片觀察。從每只幼鼠大腦石蠟切片中，隨即取3片進行染色，每個切片在皮層部位隨機選擇3個視野，在10倍目鏡及40倍物鏡下拍照。采用Image J進行神經元計數。

1.6.2 血清BDNF/TrkB含量 從-80℃超低溫冰箱中取出血清樣品，并置于-20℃冰箱2 h及4℃冰箱1 h進行梯度解凍，然后按照試劑盒說明書進行操作。采用Spectra酶標儀在450 nm波長進行測定，根據標準曲線及公式計算濃度。

1.6.3 大腦皮層BDNF/TrkB蛋白表達水平 皮層樣品蛋白變性后，規定蛋白上樣量為50μg，根據樣品蛋白濃度，計算樣品蛋白的上樣體積。灌注分離膠、壓縮膠，然后上樣。80V電泳20min，120 V電泳80 min。22 V轉模80 min。漂洗后采用5%的脫脂牛奶封閉液在搖床上緩慢搖動封閉2 h。加入稀釋好的兔抗大鼠BDNF一抗（1:1 000）；兔抗大鼠TrkB一抗（1:1 000）；小鼠抗大鼠β-actin一抗（1:1 000），放入4℃冰箱內的搖床上緩慢搖動12 h。漂洗后加入稀釋好的二抗；羊抗兔二抗（1:5 000）；羊抗小鼠二抗（1:5 000），室溫搖床緩慢搖動1 h。漂洗后進行曝光并拍照。導入Image J對條帶的平均光密度進行測量，并對比內參蛋白β-actin的比值作為被測蛋白量。

1.7 統計學方法 采用GraphPad Prism 7.0進行統計分析。數據均為計量資料，采用“均數±標準差”（±s）表示，鑒于尼氏染色類型，對其采用半定量分析。在進行比較前，采用Shapiro-Wilk檢驗數據正態性，P〈0.1為數據呈非正態分布；采用F檢驗驗證方差齊性，P〈0.1為數據方差不齊。采用非參數檢驗（Mann-Whitney檢驗）進行組間的比較，P〈0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組幼鼠大腦皮層神經元形態及數量比較 假手術對照組幼鼠大腦皮層神經元細胞形態正常，分布均勻，核漿界限清晰，染色深淺、透明度較一致，尼氏小體較多且呈虎斑樣分布。模型對照組幼鼠大腦皮層神經元形態異常，分布不規則，核漿界限不清晰，形狀大小不一，染色深淺、透明度不一，尼氏小體較少。與模型對照組比較，推拿組、涂膏組及膏摩組幼鼠大腦皮層神經元形態及分布均有所改善，染色深淺、透明度較為一致，尼氏小體較多。與假手術對照組比較，推拿組、涂膏組及膏摩組幼鼠大腦皮層神經元形態異常，分布不規則，核漿界限不清晰，形狀大小不一，染色深淺、透明度不一，尼氏小體較少。（見圖1）

圖1 大腦皮層神經元尼氏染色結果（×400）

模型對照組幼鼠大腦皮層正常形態神經元數量少于假手術對照組（P〈0.01）；推拿組、涂膏組、膏摩組幼鼠大腦皮層正常形態神經元數量均多于模型對照組（P〈0.01），且均少于假手術對照組（P〈0.01）。膏摩組幼鼠大腦皮層正常形態神經元數量多于推拿組、涂膏組（P〈0.05或P〈0.01）；推拿組幼鼠大腦皮層正常形態神經元數量與涂膏組比較，差異無統計學意義（P〉0.05）。（見表1）

表1 各組幼鼠大腦皮層正常形態神經元數量比較（±s，個）

表1 各組幼鼠大腦皮層正常形態神經元數量比較（±s，個）

注：與假手術對照組比較，aP〈0.01；與模型對照組比較，bP〈0.01；與膏摩組比較，cP〈0.05，dP〈0.01

組別 動物數（只） 正常形態神經元數量假手術對照組 5 103.65±11.73模型對照組 5 71.31±10.49a推拿組 5 84.94±9.08a b c涂膏組 5 81.34±8.63a b d膏摩組 5 89.32±10.33a b

2.2 各組幼鼠血清BDNF、TrkB含量比較 模型對照組幼鼠血清BDNF、TrkB含量高于假手術對照組（P〈0.05）；膏摩組幼鼠血清BDNF含量高于模型對照組（P〈0.05）；膏摩組幼鼠血清TrkB含量低于推拿組，（P〈0.05）。（見表2）

表2 各組幼鼠血清BDNF、TrkB含量比較（±s，pg/mL）

表2 各組幼鼠血清BDNF、TrkB含量比較（±s，pg/mL）

組別 動物數（只） BDNF TrkB假手術對照組 10 448.92±75.45 1 154.97±150.22模型對照組 10 518.61±100.04a 1 352.77±182.99a推拿組 10 549.50±124.47 1 463.92±224.00c涂膏組 10 532.87±93.14 1 354.63±249.67膏摩組 10 572.21±79.55b 1 292.89±147.59

2.3 各組幼鼠大腦皮層BDNF、TrkB蛋白表達水平比較 模型對照組幼鼠大腦皮層BDNF蛋白表達水平高于假手術對照組（P〈0.05），TrkB蛋白表達水平與假手術對照組比較，差異無統計學意義（P〉0.05）；膏摩組幼鼠大腦皮層BDNF蛋白表達水平高于模型對照組（P〈0.01），但TrkB低于模型對照組（P〈0.05）；膏摩組幼鼠大腦皮層BDNF蛋白表達水平高于推拿組及涂膏組（P〈0.01），但TrkB蛋白表達水平低于推拿組及涂膏組（P〈0.05）。（見圖2、表3）

圖2 各組幼鼠大腦皮層BDNF、TrkB蛋白表達電泳條帶

表3 各組幼鼠大腦皮層BDNF、TrkB表達水平比較（±s）

表3 各組幼鼠大腦皮層BDNF、TrkB表達水平比較（±s）

注：與假手術對照組比較，aP〈0.05；與模型對照組比較，bP〈0.01，cP〈0.05；與膏摩組比較，dP〈0.01，eP〈0.05

組別 動物數（只） BDNF TrkB假手術對照組 5 0.54±0.11 0.89±0.11模型對照組 5 0.72±0.14a 1.09±0.26推拿組 5 0.77±0.11d 1.21±0.23e涂膏組 5 0.82±0.07d 1.16±0.37e膏摩組 5 1.04±0.12b 0.85±0.20c

3 討 論

腦癱屬中醫學“痿證”“癡呆”“五遲”“五軟”“五硬”等范疇。中醫學認為，父母素體虛弱、精血不足，妊娠期外邪侵襲、擾動胎氣，亦或產時風邪入侵等小兒出生前后各種因素是小兒腦癱的主要病因。小兒先天稟賦不足則腎精化髓無力、腦髓失養、腦絡損傷，故出現四肢萎軟無力、行遲、立遲、語遲、智力低下、反應遲鈍、四肢僵硬、癡呆等癥狀。如元代醫家曾世榮《活幼心書·五軟》曰：“五軟證，名曰膽怯，良由父精不足，母血素衰而得。”清代醫家吳謙《醫宗金鑒·五遲》曰：“小兒五遲之癥，多因父母氣血虛弱，先天有虧，致兒生下筋骨軟弱，行步艱難，齒不速長，坐不能穩，要皆腎氣不足之故。”清代醫家張溫《張氏醫通·嬰兒門》曰：“五遲者……良由父母精血不足，腎氣虛弱,不能榮養而然。”蔡陸仙《中國醫藥匯海·論腦以腎為本》曰：“人之靈固莫于腦矣，然其靈根實起于腎……而腦髓實由腎主之，精足則髓足，髓足則腦充。”現代著名醫家李德修《李德修小兒推拿技法·腦炎》曰：“腎通腦最快，治腦炎需多推”。王國才亦認為CP無論病因如何，都勢必造成腎精虧虛、髓海失養，其治療均需補腎[9]。因此，CP的治療當重在補腎益腦、填精益髓，以起到濡養修復大腦的作用[10-12]。

BDNF是第2個被發現的神經營養因子（neurotrophins，NTs）家族成員，在海馬和大腦皮質組織中含量最高，其同時也是腦內含量最高的NTs。NTs具有促進神經細胞存活、分化、修復、再生，重塑神經元突觸等作用。NTs在神經細胞損傷的修復，神經細胞凋亡的抑制，神經細胞存活的增強，以及發揮相關功能等方面具有重要作用。NTs家族目前已發現眾多類型，其中包括神經生長因子（nerve growth factor，NGF）、BDNF、神經營養因子3（neurotrophin 3，NT3）及神經營養因子4/5（neurotrophin 4/5，NT-4/5）等[13]。NTs發揮功能需要通過與其相對應的神經營養因子受體相結合，高親和力受體為酪氨酸蛋白激酶（tyrosine kinase receptor，Trk），其通常發揮維持神經細胞存活生長的正向效應。低親和力受體為p75，與NTs結合可發揮促進神經細胞凋亡的負向效應，但p75在一定量的時候反而可以促進NTs與Trk的結合。NTs與Trk或p75相結合后，引起受體同源二聚化，受體分子的自身酪氨酸磷酸化，磷酸化的酪氨酸召集細胞內的多種相關靶信號分子以最終啟動細胞內信號轉導（見圖3），以發揮相關的調控作用[13-15]。

圖3 NTs家族信號轉導途徑

由多胚層原始神經干細胞分化而來的胚胎干細胞，具有自我更新、增殖、分化的能力，可分化為多種重要的神經元[16]。胚胎干細胞與中醫先天之精具有相同的來源，兩者均來源于父母之精。如《靈樞·決氣篇》曰：“兩神相搏，合而成形，常先身生，是謂精。”即腎中的先天之精稟受于父母，為人體胚胎形成的基本構成物質。同時，胚胎干細胞能夠在子宮內分化為機體發育的組織細胞并促進人體胚胎的形成，而中醫“腎精”具有調控生殖、充骨生髓、補養腦髓、激發臟腑功能及維持正常的生命運行等作用。故先天之精與胚胎干細胞具有相同的屬性特點，胚胎干細胞是先天之精的現代醫學細胞層次的存在形式[17]。而中醫“髓”具有充潤濡養大腦、維持大腦正常功能運轉的作用，大腦的濡養在現代醫學中可表現為神經元的生長、分化、成熟，神經遞質的傳遞，神經元的存活，損傷神經元的修復，以及神經元非程序性凋亡的抑制等[18]。有研究表明，補腎類中藥能夠改善神經系統疾病動物模型的癥狀，促進BDNF、TrkB等相關營養因子的表達[19-20]。因此，中醫“腎腦相關”理論中大腦的濡養則可能與大腦神經元狀態、神經元數量及NTs的變化有關[16-18]。

六味地黃丸首見于宋代醫家錢乙《小兒藥證直·地黃丸》：“地黃丸，治腎怯失音，囟開不合，神不足，目中白睛多，面色白等方。”可見古代醫家最初的用意是將此方用來治療小兒囟門遲閉、齒遲、語遲、立遲、行遲及發遲等“五遲”“五軟”及“痿證”，與當代CP先天受損、臟腑精氣不足、生長發育遲緩或停止等病因癥狀相吻合。本研究將具有滋陰補腎、填精益髓作用的“六味地黃丸”制作為外用膏劑[7]，并與同樣具有補腎益腦功用的腎俞穴相結合，通過六味地黃膏膏摩的干預方式對CP幼鼠進行干預。采用與中醫“髓”功能相似的皮層神經元形態數量及BDNF/TrkB作為主要指標進行觀察。大腦皮層神經元尼氏染色表明，以補腎益腦為核心治則，不論采用摩腎俞的推拿刺激、六味地黃膏外用或者兩者結合的六味地黃膏膏摩，均能對CP幼鼠起到濡養大腦、修復大腦皮層受損神經的作用，但3種干預方式的修復作用有限；而推拿與六味地黃膏相結合的六味地黃膏膏摩法能夠更有效地修復皮層神經損傷。BDNF/TrkB是腦損傷后多種修復轉導途徑中的一種重要啟動因子。BDNF/TrkB總量及磷酸化表達的增加能夠誘導神經細胞的存活，并對神經損傷起到積極的修復作用。模型對照組CP幼鼠在缺血缺氧腦損傷后BDNF/TrkB的表達明顯增加，以發揮腦損傷后的自我修復的作用。與此同時，六味地黃膏膏摩能夠更加顯著地誘導CP幼鼠血清與大腦皮層BDNF的表達，進一步增強CP幼鼠腦損傷修復的效果，而同樣以補腎為核心的推拿腎俞或涂六味地黃膏膏對CP幼鼠BDNF/TrkB表達的影響均不顯著，但膏摩組CP幼鼠大腦皮層TrkB蛋白表達水平與假手術對照組比較，差異均無統計學意義（P〉0.05）。

六味地黃膏膏摩相較單純推拿或者單純涂膏，對大腦皮層神經元的損傷具有更好的修復作用，且擁有更強的促BDNF表達作用，但膏摩組TrkB表達水平較模型對照組有所減少。究其原因，膏摩組除了摩腎俞的經穴效應外，還可能起到刺激局部皮膚改善血液循環促進六味地黃膏透皮吸收的作用；而TrkB磷酸化是后續細胞信號轉導途徑中的一種形式，在TrkB總量減少的同時，其磷酸化程度很有可能已經增強，能夠更有效地觸發后續的細胞存活相關信號轉導機制，從而對神經元損傷起到促進修復的作用；現代醫學神經損傷修復是多通路、多樣化、復雜化的，中醫“髓”濡養大腦的功能除了與BDNF/TrkB相似外，還與NGF、NT3、NT-4/5等具有功能上的相似性。

六味地黃膏膏摩是選擇性脊柱推拿[21]及補腎名方“六味地黃丸”的有機結合，能夠避免藥物口服的難題，具有藥物及推拿雙重功效的優勢。六味地黃膏膏摩能夠調控CP幼鼠生長激素釋放激素（GHRH）、促生長激素釋放肽（Ghrelin）及生長抑制素（SS）等，起到促進生長發育的效果，同時還可影響大腦血流供給[5,22-23]。在經過藥物安全性驗證后，我們將六味地黃膏膏摩應用于臨床，發現其具有促進早產低體重兒及CP患兒生長發育的作用[6,24-25]。本研究證明了六味地黃膏膏摩能夠對CP幼鼠大腦皮層損傷起到修復作用，且優于單純推拿或六味地黃膏外用；其補腎益腦、修復腦損傷的機制可能與BDNF/TrkB信號通路有關，但仍可能存在其他的作用機制，仍需進一步廣泛而深入的研究。