紅花有效成分提取工藝研究*

立 新，郝俊生，巴德瑪斯仁，云 峰，奧·烏力吉

（1.內(nèi)蒙古民族大學(xué)蒙醫(yī)藥學(xué)院，內(nèi)蒙古 通遼 028000；2.內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院，內(nèi)蒙古 通遼 028000；3.內(nèi)蒙古蒙醫(yī)藥工程技術(shù)研究院，內(nèi)蒙古 通遼 028000）

三臣丸是蒙醫(yī)臨床中常用的傳統(tǒng)古方，又稱臣方三味，最早記載于《四部醫(yī)典》[1]，主要用于治療小兒肺熱、肝熱等臟腑之熱證，以及呼吸道感染引起的感冒咳嗽、發(fā)燒等癥狀。其毒性小、療效確切，為治療各種熱證、特別是小兒退熱的首選藥[2-4]。三臣小兒退熱貼是由三臣丸的劑型改進(jìn)而成的，由紅花、人工牛黃、天竺黃組成，其原劑型為水丸和散劑[5-6]。此兩種劑型均由于小兒服用不便、順從性差而影響其療效。本課題擬將其劑型改進(jìn)為外用貼劑，以便克服傳統(tǒng)劑型的缺點(diǎn)，增加療效，減少毒副作用。新劑型三臣小兒退熱貼攜帶和使用方便，解決了兒童及嬰幼兒使用困難的難題。

羥基紅花黃色素A為紅花中含量較高的成分，也是其主要活性成分，為評(píng)價(jià)紅花的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)之一[5]，常用于紅花相關(guān)制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的含量測(cè)定指標(biāo)。目前提取紅花黃色素A工藝的報(bào)道很多，但不同文獻(xiàn)報(bào)道的提取方法各不相同。本實(shí)驗(yàn)從中選擇最佳條件為當(dāng)因素，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法，優(yōu)選三臣小兒退熱貼中羥基紅花黃色素A最佳提取工藝，為有效利用紅花提供依據(jù)。

1 材 料

1.1 儀器 高效液相色譜儀（華普科技有限公司）；數(shù)控超聲波洗清器（昆山超聲儀器有限公司）；恒溫水浴鍋（上海-恒科學(xué)儀器有限公司）；電子分析天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；冷凝回流裝置；電熱鼓風(fēng)干燥器（上海-新苗醫(yī)療器械有限公司）。

1.2 試藥 紅花由內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院蒙藥制劑室提供（批號(hào)：20190714），經(jīng)過全檢，符合《中華人民共和國(guó)藥典》（2015版）“紅花”項(xiàng)下相關(guān)規(guī)定。羥基紅花黃色素A（中國(guó)食品藥品檢驗(yàn)所，批號(hào)：110876-202004）。

1.3 試劑 無水乙醇（分析純，天津大茂化學(xué)試劑廠，批號(hào)：20190905）；甲醇（色譜純，德國(guó)默克兩合公司）；乙腈（色譜純，德國(guó)默克兩合公司）；磷酸溶液（分析純，天津市永大化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20170519）；超純水（自制）。

2 方法與結(jié)果

2.1 羥基紅花黃色素A的含量測(cè)定

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Eclipse Plus C18（4.6 mm×250 mm，5μm）；流動(dòng)相：A相-乙腈，B相-0.7%磷酸溶液，梯度洗脫（0～15 min，A相12%，B相88%；15～30 min，A相12～32%，B相88%～68%）；流速：1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)：403 nm；柱溫30℃；進(jìn)樣量：10μL。

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取羥基紅花黃色素A對(duì)照品1.32 mg，放置10 mL容量瓶中，加25%甲醇定容，搖勻，即得。

2.1.3 供試品溶液的制備 取紅花粉末（過50目篩）約4.0 g，精密稱定，置錐形瓶中，精密加入15倍水，回流提取3次，60 min/次。合并提取液，定容至250 mL，0.45μm濾膜濾過，精密吸取25 mL，放置50 mL容量瓶中，加水定容即可。

2.1.4 專屬性和系統(tǒng)適用性 將對(duì)照品溶液與供試品溶液各進(jìn)樣10μL，色譜圖見圖1～2。理論塔板數(shù)大于3 000，分離度1.82，專屬性良好。

圖1 對(duì)照品色譜圖

圖2 供試品色譜圖

2.1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取“2.1.2”項(xiàng)羥基紅花黃色素A對(duì)照品溶液2、5、10、15、18μL進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積。以峰面積值（Y）對(duì)進(jìn)樣質(zhì)量（X）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：Y=2 271.2X-86.936，R2=1.00，結(jié)果見圖3。羥基紅花黃色素A在0.264～2.376 mg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖3 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 精密度試驗(yàn) 取“2.1.2”項(xiàng)羥基紅花黃色素A對(duì)照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，每次10μL，記錄峰面積和保留時(shí)間，計(jì)算RSD值。結(jié)果峰面積RSD=0.85%（n=6），保留時(shí)間RSD為0.31%，表明儀器精密度良好。

2.2.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 將“2.1.3”項(xiàng)供試品溶液于0、2、4、6、8、12 h共進(jìn)樣6次，每次10μL，記錄峰面積，計(jì)算RSD值。RSD為1.13%。表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取樣品6份，按“2.1.3”法制備后取10μL進(jìn)樣，測(cè)定每份樣品中羥基紅花黃色素A的含量。RSD為1.75%。表明該方法重復(fù)性很好。

2.2.4 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的樣品9份，分為低、中、高劑量3組。分別精密加入相當(dāng)于待測(cè)樣品含量的50%、100%、150%的對(duì)照品溶液，按樣品測(cè)定項(xiàng)下操作。平均回收率為99.6%；RSD值為1.98%。表明該方法準(zhǔn)確性良好。

2.3 紅花提取工藝的優(yōu)選

2.3.1 因素水平表 根據(jù)文獻(xiàn)研究結(jié)果[6-8]，以溶劑、溶劑量、提取時(shí)間、提取次數(shù)為影響因素，每個(gè)因素設(shè)計(jì)3個(gè)水平，建立L9（34）試驗(yàn)表。（見表1）

表1 因素水平表

2.3.2 正交試驗(yàn)結(jié)果 精密稱取4.0 g紅花粉末（過50目篩），按正交試驗(yàn)表進(jìn)行提取，合并提取液，定容至250 mL。搖勻，精密吸取25 mL，加相應(yīng)溶劑定容至50 mL，每次進(jìn)樣10μL，測(cè)定羥基紅花色黃素A的含量。由于羥基紅花黃色素A在高溫下穩(wěn)定性差[9]。所以提取溫度和時(shí)間不宜過高、過長(zhǎng)。

精密吸取提取液200 mL，置于恒重的蒸發(fā)皿中，在水浴鍋上蒸干后移到105℃烘干箱中放置3 h，取出置干燥器中，放冷30 min，測(cè)定出膏量。

以羥基紅花黃色素A含量和出膏量為指標(biāo)，采用加權(quán)綜合評(píng)分優(yōu)選最佳提取工藝，并對(duì)加權(quán)分析的結(jié)果進(jìn)行方差分析。綜合評(píng)價(jià)分?jǐn)?shù)=提取率×60%+出膏率×40%。結(jié)果見表2。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

由正交試驗(yàn)結(jié)果可知各因素對(duì)羥基紅花黃色素A的提取效果的影響大小順序?yàn)椋篋〉A(chǔ)〉C〉B，即提取次數(shù)〉提取溶劑〉提取時(shí)間〉溶劑量，三臣小兒退熱貼最佳提取工藝為A3B3C2D3。

由于溶劑量的影響最小，且15倍和20倍溶劑量之間無顯著差異，為了節(jié)省生產(chǎn)成本，最終確定紅花最佳提取工藝為15倍的60%乙醇為溶劑，回流提取3次，每次60 min。在此條件下，羥基紅花黃色素A提取率達(dá)98.9%。

2.3.3 方差分析 由直觀分析和方差分析可見，各因素對(duì)羥基紅花黃色素A的提取無顯著性差異，方差分析結(jié)果見表3。

表3 方差分析結(jié)果

3 討 論

三臣丸是蒙醫(yī)和藏醫(yī)通用的傳統(tǒng)古方，最早記載于《四部醫(yī)典》[10]，在很多蒙醫(yī)經(jīng)典著作里均有記載。三臣丸為解熱散劑族“臣方”的主要部分或基礎(chǔ)方[11-14]。三臣丸主要用于治療小兒傷風(fēng)感冒、肺炎、支氣管炎及其引起的咳嗽、發(fā)燒等癥狀。三臣丸治療各種熱證療效確切，為蒙醫(yī)臨床中最常用的小兒退熱的藥。本課題擬將其劑型改進(jìn)為外用貼劑，為發(fā)熱兒童提供安全、有效、使用方便的經(jīng)皮給藥蒙藥復(fù)方制劑。

三臣小兒退熱貼成型工藝為取處方量紅花，粉碎過50目篩，加15倍60%乙醇，回流提取3次，每次60 min，合并提取液，過濾，50℃減壓濃縮至浸膏，冷凍干燥，備用。人工牛黃和天竺黃，粉碎成細(xì)粉，過150目篩，備用。將N46和甘羥鋁加入盛有甘油的燒杯中，充分?jǐn)噭蚝蠹尤胩幏搅咳斯づ｜S、天竺黃藥粉，用攪拌器混合均勻作為A相；將酒石酸溶解于純化水中，加入紅花提取物凍干粉攪拌使之完全溶解加入N500充分?jǐn)噭蜃鳛锽相，再將B相加入A相中，攪拌充分交聯(lián)后，涂布于無紡布上，蓋上保護(hù)膜，即得三臣小兒退熱貼。

藥理實(shí)驗(yàn)采用干酵母致大鼠發(fā)熱模型，對(duì)三臣小兒退熱貼紅花提取組、原藥粉組和原劑型組的藥效進(jìn)行比較，結(jié)果顯示紅花提取組的療效優(yōu)于原藥粉組，劑型改進(jìn)后的三臣小兒退熱貼高、中劑量組退熱效果良好，與原劑型相當(dāng)，發(fā)熱后4 h使體溫降至正常。

組方中人工牛黃主要成分為膽酸、膽紅素，以及無機(jī)鹽類和微量元素[15]；天竺黃主要成分為硅酸鹽及多種無機(jī)元素和氨基酸[15]。該兩種藥物均不宜提取。紅花的主要成分是紅花黃色素，屬于黃酮類成分中的查爾酮類，溶于水和乙醇[16]。紅花黃色素也溶于甲醇，但溶媒殘留對(duì)人體危害，且生產(chǎn)成本高、生產(chǎn)過程中對(duì)環(huán)境造成污染，綜合以上因素，本課題組設(shè)計(jì)了以水和不同濃度乙醇為溶劑并以羥基紅花黃色素A含量及出膏量為考察指標(biāo)，運(yùn)用正交試驗(yàn)方法，確定了三臣小兒退熱貼最佳提取工藝。

最終確定羥基紅花黃色素A適宜的提取工藝條件為：以15倍量60%乙醇為溶劑，回流提取3次，每次60 min。該方法穩(wěn)定可行，可用于三臣小兒退熱貼中羥基紅花黃色素A的提取。