炙甘草藥味的加減對梔子柏皮湯中指標成分含量的影響*

張清清，馮 媛，蔣林林，孔亞麗，李春花

（1.河北中醫學院藥學院，河北 石家莊 050200；2.河北省高校中藥組方制劑應用技術研發中心，河北 石家莊 050091；3.內蒙古醫科大學藥學院，內蒙古 呼和浩特 010110）

梔子柏皮湯作為清泄濕熱、治療黃疸的經典方劑之一，最早記載于醫圣張仲景的《傷寒論》中，其原文寫到“傷寒，身黃，發熱，梔子柏皮湯主之”[1]。原方由梔子、黃柏、炙甘草組成，且現代藥理學研究已證明梔子柏皮湯具有較好的保肝利膽作用。隨著當代中醫藥事業的發展，梔子柏皮湯作為經典方劑也常被人們作為研究的對象，主要從其化學成分[2-6]、煎煮方法[7-8]、提取工藝對藥效的影響[9-11]，原方與拆方對藥效的影響[12]，現代臨床藥理作用等方面研究[13-17]。梔子柏皮湯所含化學成分復雜多樣，其主要有效成分有環烯醚萜苷類、生物堿類、三萜皂苷類、黃酮類等，因此要建立復方的科學合理的質量評價體系仍然存在困難和挑戰。

中藥方劑配伍科學性的研究對中醫藥現代化、進一步發揚方劑的整體優勢及開發高效方劑具有重要意義。梔子柏皮湯由梔子、黃柏、炙甘草組成，其中甘草具有調和諸藥、緩和藥性的作用，那么梔子柏皮湯中的炙甘草藥味的加減對指標成分的含量會產生怎樣的影響？本課題選用梔子柏皮湯為研究對象，采用高效液相色譜法，通過對全方及缺炙甘草拆方中指標性成分進行含量測定和比較，以闡釋炙甘草藥味的有無對復方所含指標成分的影響趨勢，進而為梔子柏皮湯的質量控制和炙甘草調和藥性作用研究提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 試藥3個不同批次的梔子、黃柏、炙甘草飲片，均購自國藥樂仁堂河北藥業有限公司，具體信息見表1。經河北中醫學院張丹副教授鑒定分別為茜草科植物梔子（Gardenia jasminoides Ellis.）、蕓香科植物黃皮樹（Phellodendri Chinensis Schneid.）、豆科植物甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch.）的正品。（成都曼思特生物科技有限公司）；甲醇、乙腈（色譜純，天津市大茂化學試劑廠）；磷酸（分析純，天津光復科技發展有限公司）；超純水自制。

表1 供試品分組信息（n=3）

1.2 試劑 梔子苷對照品（批號：MUST-17110105）、甘草酸對照品（批號：MUST-17060805）、鹽酸小檗堿對照品（批號：MUST-17110105）、鹽酸巴馬汀對照品（批號：MUST-18022604）

1.3 主要儀器Agilent 1260 InfinityⅡ高效液相色譜儀，配置1260紫外檢測器（美國Agilent公司）；TD5A-WS離心機（湖南湘儀離心機儀器有限公司）；98-1-B型電熱套（天津泰斯特儀器有限公司）；EQ-100DE型數控超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；Sartorius分析天平（0.01 mg，賽多利斯科學儀器有限公司）；Sartorius分析天平（0.1 mg，賽多利斯科學儀器有限公司）；RE-52旋轉蒸發器（上海亞榮生化儀器廠）；Millipore Bedford純水儀（美國millipore公司）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 采用Dikma Diamonsil C18（4.6 mm×250 mm,5μm）色譜柱；流動相系統：乙腈（A）-0.1%甲酸溶液（B），梯度洗脫，0～20 min 10%～30%A；20～40 min 30%～40%A；40～50 min 40%～60%A；50～55 min 60%～90%A；55～57 min 90%～10%A）；流速：1 mL/min；柱溫：30℃；檢測波長：238 nm（梔子苷、甘草酸）、265 nm（鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀）；進樣量：10μL。理論塔板數按梔子苷峰計算應不低于4 400。

2.2 樣品的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取梔子苷對照品3.9 mg、甘草酸對照品4.9 mg、鹽酸小檗堿對照品1.2 mg、鹽酸巴馬汀對照品1.0 mg，分別置于5 mL容量瓶中，用70%的甲醇溶解，定容，得各對照品母液。用移液槍精密吸取各對照品母液適量分別加至5 mL容量瓶中，70%甲醇定容，分別得梔子苷（104μg/mL）、甘草酸（131μg/mL）、鹽酸小檗堿（32μg/mL）和鹽酸巴馬汀（27μg/mL）對照品溶液，進樣前過0.22μm微孔濾膜。

2.2.2 混合對照品溶液的制備 精密吸取梔子苷對照品母液400μL、甘草酸對照品母液25μL、鹽酸巴馬汀母液2μL、鹽酸小檗堿母液1 mL，加入到同一5 mL棕色容量瓶中，以70%甲醇定容至刻度線，混勻，即得含梔子苷（62.40μg/mL）、甘草酸（24.50μg/mL）、鹽酸小檗堿（48.00μg/mL）和鹽酸巴馬汀（0.08μg/mL）的混合對照品溶液，進樣前過0.22μm微孔濾膜。

2.2.3 梔子柏皮湯全方水煎液供試品的制備 稱取梔子10 g、黃柏6 g、炙甘草3 g置同一個500 mL的圓底燒瓶內，平行處理3份，加水190 mL，浸泡1 h，然后煎煮1 h，過濾，第2、3次加水量均為150 mL，每次煎煮30 min，過濾，合并3次濾液。將所得的濾液濃縮至60 mL。精密吸取0.25 mL于25 mL容量瓶中，用70%的甲醇溶液定容至刻度，進樣前過0.22μm微孔濾膜，即得梔子柏皮湯全方供試品溶液，備用。

2.2.4 拆方組水煎液供試品的制備 稱取梔子10 g、黃柏6 g，按照上述同樣的制備方法制備缺炙苷草拆方組（拆方組）樣品，平行處理3份。

2.2.5 炙甘草組水煎液供試品的制備 稱取炙甘草3 g，按照上述同樣的制備方法制備炙甘草組樣品，平行處理3份。

為保證實驗的平行性和可比性，拆方組、炙甘草組的加水量、煎煮時間、濃縮后的體積均與全方組相同，最終制得拆方組供試品溶液和炙甘草組供試品溶液，備用。具體分組信息見表1。

2.3 方法學考察

2.3.1 專屬性試驗 分別精密吸取上述混合對照品溶液、全方組供試品溶液、拆方組供試品溶液及炙甘草組供試品溶液各10μL，按“2.1”項下色譜條件分別進樣，結果顯示全方組供試品中梔子苷、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、甘草酸與相鄰色譜峰分離良好，且與對照品保留時間一致，拆方組供試品溶液無甘草酸色譜峰，炙甘草組供試品溶液無梔子苷、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀色譜峰，表明專屬性較強。（見圖1～4）

圖1 238 nm波長下HPLC色譜圖

圖2 全方組238 nm波長下HPLC色譜圖與局部放大圖

圖3 265 nm波長下HPLC色譜圖

圖4 全方組265 nm波長下HPLC色譜圖與局部放大圖

2.3.2 線性關系考察 取“2.2.2”項下混合對照品溶液，按照上述色譜條件分別進樣1、2、4、10、20、50μL，記錄各成分在對應波長下的色譜峰面積。分別以梔子苷、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀、甘草酸的質量（μg）為橫坐標（X），其色譜峰面積為縱坐標（Y），繪制標準曲線并進行線性回歸。（見表2）

表2 回歸方程與線性范圍

2.3.3 精密度試驗 取同一混合對照品溶液適量，按上述色譜條件重復進樣6次，記錄各成分在對應波長下的峰面積和保留時間。計算梔子苷、甘草酸、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀峰面積的RSD分別為0.86%、0.29%、0.90%、2.95%，表明儀器精密度良好。

2.3.4 穩定性試驗 取“2.2.3”項下制備的同一全方組供試品溶液，按上述色譜條件分別在制備后0、2、4、8、12、18、24 h進樣，測定并記錄各成分峰面積。計算梔子苷、甘草酸、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀峰面積的RSD分別為2.40%、2.82%、2.31%、1.18%，表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.3.5 重復性試驗 分別取同一組復方中的單味藥材，按照“2.2.3”項下方法制備全方組供試品溶液，平行處理6份，按照上述色譜條件，測定峰面積并計算含量，結果梔子苷、甘草酸、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀含量的RSD分別為0.90%、1.56%、2.08%、3.00%，表明方法的重復性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗 稱取同一組已知含量的梔子5 g、黃柏3 g、炙甘草1.5 g，平行6份，分別加入與每份含量相同的各對照品溶液，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液。并按上述色譜條件，進樣10μL。記錄峰面積，計算梔子苷、甘草酸、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀的平均加樣回收率和RSD，具體結果見表3。

表3 加樣回收率試驗結果（n=6）

續表3：

2.4 樣品含量測定 按照表1的分組，分別稱取3個批次的各單味藥材，按照“2.2.3”項下的供試品溶液制備方法，每組平行處理3份，按上述色譜條件進行含量測定，根據標準曲線計算各成分含量，由結果分析可知，梔子苷、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀在全方組水煎液中的溶出率均低于拆方組，且甘草酸在全方組水煎液中的溶出率低于炙甘草組，在一定程度上反映出，炙甘草藥味的存在削弱了復方中梔子苷成分和生物堿類成分鹽酸小檗堿和鹽酸巴馬汀的溶出。（見表4）

表4 不同組別水煎液中指標成分在對應單味藥材中的含量（±s，n=3）

表4 不同組別水煎液中指標成分在對應單味藥材中的含量（±s，n=3）

組別 梔子苷 鹽酸小檗堿 鹽酸巴馬汀 甘草酸各組成分含量(mg/g)全方組1 46.44±0.23 24.10±0.43 0.29±0.05 14.52±0.59全方組2 47.47±1.05 23.36±0.71 0.25±0.01 12.97±0.65全方組3 48.68±0.78 22.50±0.52 0.30±0.02 14.09±0.19拆方組1 52.39±0.85 27.35±1.38 0.39±0.01 /拆方組2 50.77±0.54 25.80±0.89 0.36±0.03 /拆方組3 52.02±1.52 26.13±0.26 0.38±0.01 /炙甘草組1 / / / 23.15±0.45炙甘草組2 / / / 21.58±0.80炙甘草組3 / / / 22.53±1.01平均含量(mg/g) 全方組 47.53±1.12 23.32±0.80 0.28±0.03 13.86±0.80拆方組 51.73±0.85 26.43±0.82 0.38±0.02 /炙甘草組 / / / 22.42±0.79

3 討 論

本實驗構建的基于HPLC-DAD技術的含量測定方法可成功用于梔子柏皮湯及其拆方中各目標成分的定量分析。通過比較全方組和拆方組的成分含量，可知全方中炙甘草藥味的加入均降低了梔子苷和生物堿類成分鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀的含量。根據前期文獻報道，梔子苷、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀、甘草酸等成分是梔子柏皮湯發揮保肝利膽作用的重要物質基礎。其中梔子苷是梔子發揮保肝利膽作用的藥效物質，但同時有研究報道梔子苷具有一定的肝臟毒性；而生物堿類成分在發揮保肝利膽作用的同時具有苦寒之性[18]，甘草的加入緩和了梔子苷的肝毒性和生物堿的苦寒作用，這與甘草“調和諸藥、緩和藥性”之功相符。通過研究藥味加減對組方中藥效成分含量的影響，有助于闡明梔子柏皮湯的配伍科學性，除拆方組外，其他拆方組和各單味藥材組的差異分析將在后續論文中報道。本方法簡便、準確、穩定，為梔子柏皮湯的質量控制和配伍科學性研究了提供參考。