一測多評法測定不同產地芫花中3種活性成分的含量*

馬瑞瑞，吳文平，羅宇琴，邱韻靜，李國衛，魏 梅，孫冬梅，陳向東

（廣東一方制藥有限公司/廣東省中藥配方顆粒企業重點實驗室，廣東 佛山 528244）

[關鍵字]芫花；一測多評法；校正因子；芹菜素-7-O-β-葡萄糖醛酸苷；芹菜素；芫花素；含量測定

芫花為瑞香科植物芫花Daphen genkwa Sieb.et Zucc.的干燥花蕾，春季花未開放時采收，除去雜質，干燥[1]。主要分布于華東及河北、陜西、河南、湖北、湖南、四川、貴州等地。芫花的化學成分主要包括黃酮類、二萜原酸酯類、綠原酸類、木脂素類等，其中黃酮類成分包括芫花素、羥基芫花素、木犀草素、椴樹苷、芹菜素、槲皮苷、芹菜素-7-O-β-葡萄糖醛酸苷等，此外還包括二萜原酸酯類如芫花酯甲、芫花酯乙等。芫花性溫，味苦、辛，具有泄水逐飲的功能，外用殺蟲療瘡[1-4]。臨床主要用于水腫脹滿、胸腹積水、痰飲積聚、氣逆咳喘、二便不利；外治疥廯禿瘡，癰腫，凍瘡。目前對芫花的含量測定研究多集中于對芫花素的含量測定，而芹菜素-7-O-β-葡萄糖醛酸、芹菜素等相關的文獻研究較少。中藥的整體性主要體現在其有效成分群發揮藥理藥效作用，因此，采用一測多評法（QAMS）對中藥有效成分群進行檢測更能反映中藥材內在質量。

目前一測多評法在中藥質量控制中已廣泛應用[5-10]，該方法快速、簡便并且能實現同時檢測多個成分，是一種符合中藥多成分特點的多指標質量評價模式。本實驗采用HPLC法同時測定了芫花中芹菜素-7-O-β-葡萄糖醛酸苷、芹菜素、芫花素的含量，并通過選用芫花素為內標物質計算不同成分的校正因子（f）建立一測多評方法，計算各化學成分的含量，為中藥材芫花多成分含量的測定與質量控制提供了全新的分析模式。

1 材料與儀器

1.1 材料 芹菜素對照品（批號：111901-201603，含量：99.2%），芫花素對照品（批號：111899-201202，含量：94.9%）及芫花對照藥材（批號：121062-201403）均購于中國食品藥品檢定研究院；芹菜素-7-O-β-葡萄糖醛酸苷（批號：ST0892012MG，含量：99.6%）購于上海詩丹德生物科技有限公司；水為超純水；甲醇、磷酸為色譜純，其他試劑為分析純。本實驗所用的芫花藥材，經廣東一方制藥有限公司魏梅主任中藥師鑒定為芫花Daphen genkwa Sieb.et Zucc.的干燥花蕾，樣品采集信息見表1。

表1 樣品信息表

1.2 儀器Waters e2695型高效液相色譜儀（美國沃特世公司）；Waters HSS T3色譜柱（4.6 mm×250 mm，5.0μm)；Agilent TC C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5.0μm）；KQ-500型數控超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；ME-204E型萬分之一天平、XP-26型百萬分之一天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；Milli-Q Direct型超純水系統（美國默克股份有限公司）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件Waters HSS T3色譜柱（4.6mm×250mm，5.0μm)；以甲醇為流動相A，0.1%磷酸溶液為流動相B，按梯度洗脫（0～3 min，20%→43%A；3～25 min，43%→45%A；25～35 min，45%→60%A；35～50 min，60%→90%A）；流速為1.0 mL/min；進樣量為10μL；柱溫為35℃；檢測波長為350 nm。

2.2 對照品溶液的制備 精密稱取芹菜素-7-O-β-葡萄糖醛酸苷、芹菜素、芫花素對照品適量，加甲醇制成每1 mL含芹菜素-7-O-β-葡萄糖醛酸苷605.4μg、芹菜素565.6μg、芫花素229.3μg的混合對照品貯備液；取上述貯備液加甲醇制成每1mL含芹菜素-7-O-β-葡萄糖醛酸苷60.54μg、芹菜素56.56μg、芫花素22.93μg的混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 精密稱取芫花飲片粉末（過三號篩）約0.2 g，置具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇25 mL，稱定質量，超聲處理30 min，放冷，用70%乙醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.4 方法學考察

2.4.1 系統適用性試驗 精密吸取“2.2”項下混合對照品溶液與“2.3”項下供試品溶液，按照“2.1”項下色譜條件。各色譜峰分離度良好，表明各方法專屬性較好。（見圖1）

圖1 混合對照品及供試品HPLC色譜圖

2.4.2 線性關系考察 分別精密取混合對照品貯備液5.0、2.0、1.0、0.5、0.2、0.1 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，得到不同濃度的對照品溶液，并按照“2.1”項下色譜條件進樣分析，以進樣濃度x（μg/mL）為橫坐標，以峰面積y為縱坐標，繪制標準曲線，計算回歸方程，結果見表2。

表2 3種成分回歸方程、相關系數和線性范圍

2.4.3 精密度試驗 精密吸取“2.3”供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件，連續進樣6針，計算芹菜素-7-O-β-葡萄糖醛酸苷、芹菜素及芫花素峰面積的RSD分別為0.26%、0.28%和0.23%，儀器精密度良好。

2.4.4 穩定性試驗 取同一供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件，分別于0、2、4、8、16、24 h進樣測定，計算芹菜素-7-O-β-葡萄糖醛酸苷、芹菜素及芫花素峰面積的RSD分別為1.53%、0.90%和0.71%，表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.4.5 重復性試驗 稱取同一芫花樣品（過三號篩）約0.2 g，平行6份，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件分別進樣測定，測得芹菜素-7-O-β-葡萄糖醛酸苷、芹菜素和芫花素的含量RSD分別為1.35%、0.68%和0.44%，表明方法重復性良好。

2.4.6 加樣回收率試驗 取同一已知含量的樣品約0.1 g，平行9份，精密稱定，置具塞錐形瓶中，按樣品含量∶對照品加入量為1∶0.5、1∶1、1∶1.5加入對照品，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按照“2.1”項下色譜條件分析，計算加樣回收率，結果芹菜素-7-O-β-葡萄糖醛酸苷、芹菜素和芫花素的平均加樣回收率分別為94.22%、95.48%和97.56%，其RSD（n=9）分別為1.47%、1.69%和3.18%，表明方法準確度良好，結果見表3。

表3 加樣回收率考察結果

2.5 校正因子考察

2.5.1 校正因子計算 分別精密吸取“2.4.2”項下的對照品溶液”，按照“2.1”項下色譜條件”進樣，采用多點校正法計算相對校正因子，以芫花素為內標，按公式f=As×Ci/（Ai×Cs）（式中Ci為芫花素濃度，Ai為芫花素峰面積，Cs為待測組分濃度，As為待測組分峰面積）計算芹菜素-7-O-β-葡萄糖醛酸苷、芹菜素的相對校正因子分別為f芹菜素-7-O-β-葡萄糖醛酸苷/芫花素=1.62、f芹菜素/芫花素=0.98。

2.5.2 待測成分的色譜峰定位 采用待測成分與芫花素保留時間的相對值作為定位標準，考察在不同柱溫、流速、色譜柱及色譜儀下對芹菜素-7-O-β-葡萄糖醛酸苷、芹菜素相對保留時間的影響，結果各待測組分相對保留時間RSD均小于5%，表明方法重現性良好，結果見表4。

2.5.3 校正因子重現性考察 考察校正因子在不同實驗室環境下的重現性，取同一份樣品，按照“2.3”項下方法制備供試品溶液，于不同實驗日期，在不同柱溫、流速、色譜柱及色譜儀下對校正因子進行考察，不同條件下芹菜素-7-O-β-葡萄糖醛酸苷、芹菜素的校正因子波動3%以下，表明方法重現性良好，結果見表4。

表4 3種成分重現性考察結果

2.6 樣品測定結果 取芫花藥材15批，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按照“2.1”項下色譜條件分析，分別采用外標法（ESM）及一測多評（QAMS）法對芫花素、芹菜素-7-O-β-葡萄糖醛酸苷、芹菜素的含量進行計算，并計算兩種方法的相對平均偏差（RE%）。結果顯示兩種方法測得的數據無明顯差異，相對平均偏差小于3%，結果見表5。

表5 樣品ESM及QAMS測定結果

2.7 不同產地芫花藥材的聚類分析 對上述15批不同產地的芫花藥材的內標法測定結果進行分析，通過SPSS 20.0版軟件進行系統聚類，得到聚類分析結果見圖2。從圖2可知，歐氏距離等于5時，可將15批芫花藥材分為5類，其中來自河北省的3批S3、S11、S12為第一類，其中來自廣西省玉林市和廣東省廣州市的5批S1、S2、S4、S5、S6為第二類，來自江西的3批S8、S9、S10為第三類，來自四川省成都市的3批S13、S14、S15為第四類，來自廣西省玉林市的1批S7，單獨成一類，將其作為離群數據處理。上述結果說明不同樣品之間存在明顯的產地差異性。

圖2 芫花藥材聚類分析結果

2.8 不同產地芫花藥材的主成分分析 用SPSS 20.0軟件對15批樣品內標法含量測定所得結果進行主成分分析，得出相關矩陣的特征值及方差分析，結果見表6。主成分1與主成分2的特征值分別為2.089和0.706，對于總方差的累積貢獻率達93.164%，基本保留了原樣本信息，所以確定提取的主成分數為2個。根據主成分載荷矩陣表7可知，芹菜素和芫花素對主成分1的影響最大，芹菜素-7-O-β葡萄糖醛酸苷對主成分2的影響較大。以2個主成分（見表8）分別作為X、Y軸得15個樣品的主成分得分圖，可以將15批樣品分為5類，其中來自河北省的3批S3、S11、S12為第一類，來自廣西省玉林市和廣東省廣州市的5批S1、S2、S4、S5、S6為第二類，來自江西的3批S8、S9、S10為第三類，來自四川省成都市的3批S13、S14、S15為第四類，來自廣西省玉林市的1批S7，單獨成一類，將其作為離群數據處理，與聚類分析結果一致（見圖3）。計算各樣品綜合得分并排序，結果表明，來自于廣西省玉林市、廣東省廣州市和四川省成都市的芫花藥材質量排名均優于河北省安國市、江西省宜春市。（見表9）

圖3 主成分得分圖

表6 特征值及方差分析

表7 主成分載荷矩陣

表8 主成分得分、綜合得分及排名

表9 5個產地芫花主成分得分均值、綜合主成分得分均值及排名

綜上，進一步分析各類之間的含量配比，以芹菜素-7-Oβ-葡萄糖醛酸苷∶芹菜素∶芫花素三者含量比例關系來看，第一類約為5∶1∶1，第二類約為2∶2∶1，第三類約為3∶1∶1，第四類約為3∶2∶1，第二類和第四類樣品的芹菜素含量占比均較高，該兩類樣品分別來源于廣東、廣西、四川；在主成分分析結果中，芹菜素的特征值為0.913，為影響芫花藥材質量的關鍵因素；從地理位置來看，四川、廣西和廣東的海拔均高于河北和江西，且四川、廣西和廣東均屬于亞熱帶季風氣候，適宜芫花的生長。上述3個產地的樣品均排名前三，質量較好，含量結果與主成分分析結果一致，提示藥材化學成分的比例可能與其生長環境有一定的關聯。

3 討 論

3.1 分析方法的確定2015年版《中華人民共和國藥典》芫花項下含量測定以芫花素為指標，文獻研究指出芫花素在芫花的不同部位均有分布，且芫花素是芫花泄水逐飲，鎮咳祛痰的主要成分[11]，因此，選擇芫花素作為內標，建立一測多評法測定3種黃酮類成分的含量。本實驗考察了前處理方法中不同條件對3種成分含量的影響，最終確定最優的條件為：料液比為0.2∶25 g/mL，以70%乙醇作為提取溶劑，超聲處理（功率300 W，頻率40 kHz）30 min，重復提取2次。

3.2 一測多評法 本研究通過建立一測多評的方法，測定15批芫花的芹菜素-7-O-β-葡萄糖醛酸苷含量范圍在6.314～12.633 mg/g、芹菜素含量范圍在2.416～6.565 mg/g、芫花素含量范圍在2.018～3.659 mg/g，并對不同成分之間的含量比例關系與主成分分析結合進行分析。結果顯示，四川、廣西和廣東產地的芫花質量優于河北和江西，表現為整體質量優、品質佳，可作為芫花基地規范化種植及優良種質篩選的優選區域。

3.3 聚類分析和主成分分析 聚類分析將15批樣品分為五類，利用主成分分析法，將3個峰變量降維為2個主成分變量，用主成分1和主成分2分別作為X、Y軸得15個樣品的主成分得分圖，結果與聚類分析一致。計算各樣品綜合得分并排序，結果表明，來自廣西省玉林市、廣東省廣州市和四川省成都市的芫花藥材質量優于河北省安國市和江西省宜春市藥材質量。經分析，芫花的質量可能與海拔、生長年限及采收加工有關，為芫花原藥材的產地優選提供參考。

本研究建立的一測多評法同時測定芫花中3種活性成分的含量，為更好評價芫花藥材質量提供了參考，并為優選芫花產地提供了實驗依據。