海水小球藻粗多糖對日本蟳免疫相關酶活性的影響

王家新，蘇 宏，王衛兵，許永忠，郭晨宇，顧小朵，王洪斌

( 1.江蘇海洋大學 海洋生命與水產學院，江蘇 連云港 222005； 2.江蘇省徐州市水族展覽館，江蘇 徐州 221006； 3.江蘇省宿遷市大江飼料有限公司，江蘇 宿遷 223900 )

已有研究表明，海水小球藻(Chlorellapacifica)中的生物活性成分包括多酚類、多肽、多糖等。海藻多糖具有極高的營養價值，并且能提高機體免疫力，聯合國糧食及農業組織已將其列入21世紀健康食品名單[1-4]。海藻多糖除了傳統的應用價值以外，還具有多種生物活性及醫用價值，如抗病毒、抗氧化、抗輻射、抗腫瘤、抗菌抗炎、金屬離子絡合作用、增強生物體的免疫活性等；有研究表明，海藻多糖可以通過對機體的免疫系統進行調節，從而發揮這些作用[5-6]。海水小球藻取材方便，易培養，因此海水小球藻的研究開發近年來備受關注。

日本蟳(Charybdisjaponica)屬節肢動物門、甲殼綱，廣泛分布于我國各個海域。日本蟳生長快、移動性小、成活率高，具有較高的經濟價值，是重要的海產養殖蟹類[7]。日本蟳肉質中含量最高的氨基酸為谷氨酸，另外天冬氨酸、精氨酸、亮氨酸含量也比較高，而半胱氨酸和甲硫氨酸含量較少；其中有9種氨基酸是必需氨基酸，占總氨基酸的37%[8]。水生甲殼類動物的血清中免疫活性酶活性是評價機體免疫系統狀態的一項重要指標，研究發現，血清中的溶菌酶活性升高，其免疫力也會提高[9]。溶菌酶能夠溶解革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌，而在水產養殖中引起嚴重疾病的病原菌大多屬于革蘭氏陰性菌，因此溶菌酶可用于水產養殖生物病害防治，同時能夠減少化學藥品對水環境的污染[9]。筆者自海水小球藻中提取粗多糖，研究其對日本蟳部分免疫活性酶(超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和溶菌酶)活性的影響，旨在開發海洋微藻潛在應用價值及探索其在水生動物免疫機制中的作用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

海水小球藻由江蘇海洋大學海洋生命與水產學院藻類生物學實驗室提供；試驗用海水采自連云港海域[鹽度(28.00±1)]，過濾后于121 ℃滅菌20 min，備用；健康日本蟳于2019年5月取自連云港市水產品批發市場，個體規格均勻(約150 g)，活力強，暫養于0.6 m×0.4 m×0.3 m玻璃水族箱中，室溫 24 h通氣；試驗用超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和溶菌酶活性檢測試劑盒購于南京建成生物工程研究所；其他化學試劑均為分析純；海水小球藻培養液采用f/2培養液。

主要儀器：智能光照培養箱(ZGX-300C)、紫外可見分光光度計(T6新世紀)、全波長酶標儀(Synergy HT)。

1.2 試驗方法

1.2.1 海水小球藻的培養及多糖提取

無菌條件下，將活化的海水小球藻按1∶10接種至盛有3000 mL滅菌f/2海水營養鹽溶液的滅菌錐形瓶中，光照培養[光照度3000 lx，光暗比12 h∶12 h，溫度(23±1) ℃]。每日定時搖瓶3次，搖瓶時可隨機調整錐形瓶的放置位置，以減少誤差[10]。

1.2.2 海水小球藻生長量的測定

每一批次的海水小球藻中，隨機選擇一瓶作為監測樣品，從接種之日開始，每隔24 h，混勻樣液后從樣品中取3 mL藻液移入比色皿中，以該批次的滅菌海水營養鹽溶液作為空白對照，測定其在680 nm的光密度(D680)。

1.2.3 海水小球藻粗制多糖提取

熱水浸提法并經乙醇沉淀得到多糖，將醇沉完的溶液8000 r/min(離心半徑8.0 cm)離心20 min，棄上清液，沉淀連同移液管一起放入干燥箱中烘干6 h。采用蒽酮比色法測定多糖含量[11-13]。

1.2.4 日本蟳血清取樣[14]

選擇健康、規格均勻的日本蟳，設試驗組和對照組(每組6只，雌雄各半)。試驗組每只日本蟳用無菌微量注射器從第三步足基部向腹腔注入200 μL海水小球藻多糖溶液，生理鹽水對照組6只按同樣方法注射等量生理鹽水，無注射對照組6只則不注射任何物質。每組設置3個平行。

注射后的日本蟳在5、24、48、72、96 h(3組每時間點每平行隨機取1只日本蟳)分別用無菌藍芯注射器自第三步足基部采血300 μL,置于1.5 mL無菌Eppendorf離心管中(加EDTA抗凝劑500 μL),混勻，4 ℃冰箱保存24 h，將血漿于4 ℃、8000 r/min(離心半徑8.0 cm)離心10 min，去沉淀，上層血清保存于-20 ℃冰箱中備用。

1.2.5 日本蟳血清中超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、溶菌酶活性測定

黃嘌呤氧化酶法(羥胺法)測定超氧化物歧化酶活性；磷酸銨法測定過氧化氫酶活性；比濁法測定溶菌酶活性。具體操作方法根據試劑盒說明書進行。

1.2.6 數據分析

采用Microsoft Excel軟件進行成組t檢驗分析，所有試驗數據采用平均值±標準差表示，設差異顯著性水平為0.05，各組間差異顯著(P>0.05)用不同字母表示。

2 結果與分析

2.1 海水小球藻的生長狀況及粗多糖提取

取5 mL保藏藻液接種至150 mL滅菌海水f/2營養鹽中，每隔24 h取3 mL混勻藻液測D680，得到海水小球藻生長曲線(圖1)。海水小球藻藻體量自第2天起呈快速上升趨勢，活性很強。蒽酮法測定提取的粗多糖含量，多糖含量為58.99%。

圖1 海水小球藻生長曲線Fig.1 Growth curve of green alga C. pacifica

2.2 粗多糖對日本蟳血清中免疫活性酶的影響

2.2.1 粗多糖對超氧化物歧化酶活性的影響

試驗組注射海水小球藻多糖后的日本蟳血清中，超氧化物歧化酶在24 h時出現上升趨勢，注射后48 h即高于生理鹽水組21.8%和未注射組23.1%，與2個對照組相比均差異顯著(P<0.05)，而生理鹽水組與未注射組差異不顯著(P>0.05)；72 h達最高點，比生理鹽水組高43.3%，比未注射組高45.2%，與2個對照組相比，差異性均極顯著(P<0.01)，同樣，生理鹽水組與未注射組差異不顯著(P>0.05)；72 h后超氧化物歧化酶活性迅速下降，到96 h恢復至對照組水平，72 h后3組無顯著差異(圖2)。24 h生理鹽水組與未注射組相比超氧化物歧化酶的活性有小幅升高，其他無變化。

圖2 海水小球藻多糖對日本蟳超氧化物歧化酶活性的影響Fig.2 Influence of green alga C. pacifica polysaccharides on the SOD activity in Japanese stone crab C. japonica

2.2.2 粗多糖對過氧化氫酶活性的影響

試驗組注射海水小球藻多糖后的日本蟳血清中，過氧化氫酶在5 h時出現上升趨勢，24 h即有明顯升高，分別高于生理鹽水組和未注射組76.6%、77.4%，與2個對照組相比均差異極顯著(P<0.01)，而生理鹽水組與未注射組無顯著性差異(P>0.05)；48 h達到最高，比注射生理鹽水的對照組高79.3%，比未注射的對照組高80.8%，與2個對照組相比，均差異極顯著(P<0.01)，而生理鹽水組與未注射組無顯著性差異(P>0.05)；48 h后過氧化氫酶活性開始下降，72 h仍明顯高于2個對照組，具有極顯著性差異(P<0.01)，96 h恢復至對照組水平(圖3)。24、48 h和72 h的結果顯示，試驗組與2個對照組相比差異極顯著，注射多糖的日本蟳過氧化氫酶活性有顯著增強，具有強烈應答。

圖3 海水小球藻多糖對日本蟳過氧化氫酶活性的影響Fig.3 Influence of green alga C. pacifica polysaccharides on the CAT activity in Japanese stone crab C. japonica

2.2.3 粗多糖對溶菌酶活性的影響

試驗組注射海水小球藻多糖后的日本蟳血清中，溶菌酶活性自5 h出現明顯升高，但與對照組差異不顯著(P>0.05)；24 h比生理鹽水組及未注射組分別高28.8%、29.1%，與生理鹽水組相比差異不顯著(P>0.05)，但與未注射組相比具顯著性差異(P<0.05)，生理鹽水組比未注射組略有升高，但無顯著性差異(P>0.05)；直至48 h達到最高，比生理鹽水組及未注射組分別高42.1%、46.1%，與2個對照組相比均差異極顯著(P<0.01)；48 h后溶菌酶活性開始下降，但仍明顯高于2個對照組，96 h恢復至對照組水平(圖4)。48 h的結果顯示，試驗組與2個對照組相比差異極顯著，注射多糖的日本蟳溶菌酶活性有明顯增強，表明海水小球藻多糖能夠激活日本蟳的免疫系統，使之產生強烈生理應答。

圖4 海水小球藻多糖對日本蟳溶菌酶活性的影響Fig.4 Influence of green alga C. pacifica polysaccharides on the LZM activity in Japanese stone crab C. japonica

3 討 論

3.1 日本蟳的非特異性免疫

研究證實，多糖對甲殼動物具有免疫調節作用，甲殼動物循環血細胞具有吞噬和包囊入侵異物的作用。如凝集素和酚氧化物酶原激活系統能對入侵的細菌、真菌表面脂多糖或真菌細胞壁成分1,3-β-D-葡聚糖進行識別結合，促進吞噬細胞的吞噬[15-16]。楊福剛等[17]報道，凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)免疫系統中存在著識別β-葡聚糖的結合蛋白，當兩者相結合時，結合物可與顆粒細胞膜的受體相結合，從而激活免疫系統。甲殼動物屬于無脊椎動物中的一個大類，并且其中很多都是具有較高經濟價值的養殖種類，隨著養殖規模的不斷擴大，養殖甲殼動物的病蟲害防治成為一項艱巨而重要的任務。傳統的水生養殖動物病害防治主要依靠抗生素及化學藥物，不但污染水源，而且長時間使用抗生素及化學藥物還會使水產養殖生物的體內蓄積大量有害物質，通過食物鏈進入人體從而威脅人類健康[18]。因此，對甲殼動物免疫力的研究，提高水產養殖動物自身的免疫活性就成為一個重要的研究方向。

3.2 海水小球藻多糖對日本蟳抗氧化酶活性的增強效果

超氧化物歧化酶的活性與生物的免疫水平密切相關，對于增強吞噬細胞的防御能力和整個機體的免疫功能有重大作用。當酶活性較低時，生物體內活性氧量過多，勢必會擾亂、破壞一些體內重要的生物分子，導致代謝紊亂，生理功能失調，體內免疫水平下降，潛在的病原被激活，使機體發病[19]。劉恒等[20]報道，用添加免疫多糖的飼料投喂凡納濱對蝦后，凡納濱對蝦肌肉中免疫酶的活性有一定的提高，表明口服多糖可以提高凡納濱對蝦的免疫力，而免疫水平的提高又會增強對蝦肌肉等部位的活力。過氧化氫酶主要生理作用就是將體內代謝物H2O2催化分解為H2O和O2。劉樹青等[21]發現，對中國明對蝦(Fenneropenaeuschinensis)注射免疫多糖后，血清中的過氧化氫酶活性比對照組明顯增高，表明通過提高動物血液中抗氧化酶活性，可以減少自由基對正常細胞的損傷，清除細胞生理代謝過程中產生的活性氧，從而提高機體的解毒免疫功能和防病抗病能力，因此認為抗氧化酶的活性也可作為一項免疫指標來衡量對蝦機體免疫機能。本試驗設置了兩組對照試驗，一組是注射等量生理鹽水的日本蟳，一組是未注射的日本蟳。試驗結果顯示，在注射海水小球藻粗多糖后，日本蟳的抗氧化酶的活性均有不同程度的提高，并且與對照組差異顯著。注射生理鹽水的日本蟳血清中抗氧化酶比較穩定，在24 h后與未注射的對照組相比略有升高，其他時間無變化。說明海水小球藻多糖對日本蟳具有較強烈誘導免疫應答作用。其中過氧化氫酶活性72 h后有明顯降低，但與對照組相比，其活性仍保持在一個較高水平上，并具有顯著性差異，與賈超艷[22]的試驗結果有一定的差異，經分析認為，這可能與日本蟳的產地和養殖環境有關，并且二者給日本蟳注射多糖的種類和劑量也有所不同，使得日本蟳的免疫反應有差異。

3.3 海水小球藻多糖對日本蟳溶菌酶活性的增強效果

溶菌酶在多種動物的血液和血細胞中均廣泛存在，是非特異性免疫因子的主要成分，在免疫活動中發揮著重要作用。溶菌酶主要殺滅的是革蘭氏陽性菌，能夠水解細菌細胞壁β-1,4糖苷鍵，從而使細菌的細胞壁破損，細胞崩解，而且溶菌酶還是吞噬細胞殺菌的物質基礎[23]。王雷等[24]研究發現，正常中國明對蝦的血淋巴中溶菌酶活性較高，而在瀕死中國明對蝦血淋巴中未檢測到溶菌酶，說明溶菌酶活性也可以作為檢測對蝦機體免疫功能狀態的指標之一。劉樹青等[25]報道，日本囊對蝦(Marsupenaeusjaponicus)經注射1%海藻多糖和1%北蟲草多糖后，血淋巴中的溶菌酶活性大大增加。本試驗結果表明，注射海水小球藻多糖后，日本蟳血清溶菌酶活性的變化最為明顯，升高較快，注射后5 h就出現明顯的升高，但與對照組差異不顯著；24 h接近最高值，并且能在較長時間里保持一個較高的水平，與生理鹽水組相比差異不顯著，但與未注射組差異顯著；注射后48 h溶菌酶活性達到最高，分別高于生理鹽水組和未注射組42.1%和46.1%。

4 結 論

給日本蟳進行人工注射海水小球藻粗多糖能夠刺激其免疫系統產生應答，一定時間內能提高其免疫酶活性，增強其免疫力。若在實際養殖生產中，將海水小球藻粗多糖添加于甲殼動物養殖飼料中，結合動物口服途徑，將對病害防治和水產動物健康養殖以及發展綠色水產品等都具有深遠的意義。本試驗提取粗多糖，經測定其中多糖含量為58.99%。本試驗未涉及粗多糖中其他成分和養殖海水中其他環境因子對酶活性的影響。